專利名稱：一株枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
香蕉枯萎病是由尖孢錸刀菌古巴?；?Fusarium oxysporum f. sp. cubense)侵染引起的一種毀滅性病害，是香蕉生產(chǎn)的毀滅性土傳病害。病原菌從受傷的根莖侵入，通過維管束向假莖及葉部蔓延，堵塞木質(zhì)部導(dǎo)管，直至植株枯萎死亡。香蕉枯萎病菌是土壤習(xí)居菌，其厚垣孢子能夠在土壌中存活8 10年。目前對(duì)枯萎病的防治還沒有一種有效的化學(xué)農(nóng)藥，而且長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境 和人類健康造成嚴(yán)重威脅。與化學(xué)防治法相比，利用拮抗菌防治植物病害具有對(duì)環(huán)境友好、成本低、病原菌不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，是未來病害防治的方向。盡管人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量拮抗細(xì)菌，但目前所分離到的細(xì)菌還遠(yuǎn)不能滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的要求。芽孢桿菌能產(chǎn)生耐熱、抗逆的芽抱，有利于菌劑的生產(chǎn)、劑型加工及在環(huán)境中存活、定殖與繁殖。國內(nèi)外已有生防芽孢桿菌用于防治豆類、麥類、棉花和花生等根部病害及防治蔬菜、櫻桃、葡萄、葫蘆和胡桃的細(xì)菌和真菌等葉部病害的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的ー個(gè)技術(shù)問題是提供ー株枯草芽孢桿菌。本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) BLG010，其在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC No. 5953。該 菌種已于2012年04月06日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCOo本發(fā)明的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) BLGOlO在營養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基上呈乳脂色不透明，表面干燥，有皺褶突起，邊緣不整齊。顯微鏡下單個(gè)菌體呈桿狀，兩端鈍圓，革蘭氏染色后，染色均勻，并可見細(xì)胞中被染成藍(lán)紫色芽孢。本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供ー種殺菌劑。本發(fā)明所提供的殺菌劑，它的活性成分是上述枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) BLGOIOo所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) BLGOlO具體可為分生孢子或/和菌絲體。所述殺菌劑具體可用于防治由尖孢錸刀菌古巴專化型(Fusarium oxysporum f.sp. cubense)引起的植物病害。所述植物病害具體可為香蕉枯萎病。本發(fā)明所要解決的再一個(gè)技術(shù)問題是提供一種防治香蕉枯萎病的方法。本發(fā)明所提供的防治香蕉枯萎病的方法，包括采用I X 108cfu/mL的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) BLG010CGMCC No. 5953菌懸液澆灌香蕉苗基部的步驟。實(shí)驗(yàn)證明，以lX108cfu/mL的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLGOlOCGMCCNo. 5953菌懸液澆灌香蕉苗基部，對(duì)香蕉枯萎病的防病效果達(dá)81. 4%。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) BLG010CGMCC No. 5953在低濃度下能夠有效抑制香尖孢錸刀菌的生長(zhǎng)，對(duì)香蕉枯萎病的防治具有重要意義。菌種名稱枯草芽孢桿菌拉丁名Bacillussubtilis菌株編號(hào)BLG010保藏機(jī)構(gòu)中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏機(jī)構(gòu)簡(jiǎn)稱CGMCC地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào) 保藏日期2012年04月06日保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)CGMCC No. 5953下面結(jié)合具體實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，這些實(shí)施例用于理解而不是限制本發(fā)明。


圖I 為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) BLG010CGMCC No. 5953 發(fā)酵濾液對(duì)尖孢錸刀菌古巴?；?號(hào)小種(F0C4)菌絲抑制作用。A 為未加入枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) BLG010CGMCC No. 5953 發(fā)酵濾液的PDA上的尖孢錸刀菌古巴?；?號(hào)小種(F0C4)菌絲。B 為加入枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) BLG010CGMCC No. 5953 發(fā)酵濾液的PDA上的尖孢錸刀菌古巴?；?號(hào)小種(F0C4)菌絲。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中的NA培養(yǎng)液牛肉浸膏0. 3%，酵母浸膏0. 1%，蛋白胨0. 5%，葡萄糖
I.0%，用蒸餾水定容至IOOOmL ;其pH7. O。其中的百分含量均為質(zhì)量百分含量。下述實(shí)施例中的NA培養(yǎng)基是在上述NA培養(yǎng)液中加入瓊脂得到的固體培養(yǎng)基。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例I、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) BLG010的分離及鑒定I、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis) BLG010 的分離從中國海南省香蕉種植地選擇枯萎病重發(fā)田中發(fā)病田塊的香蕉植株，采集根部土樣。把土壤樣本風(fēng)干，過篩后稱取IOg放入裝有90mL無菌水和玻璃珠的三角瓶中，充分振蕩，靜置IOmin后，按梯度濃度法稀至I X 10'I X 10'IX 1(T5。各梯度稀釋液于80°C水浴加熱20min，取IOOul涂布于營養(yǎng)瓊脂(NA)分離培養(yǎng)基上。30°C恒溫培養(yǎng)2d，根據(jù)菌落顔色、形態(tài)、干濕度、透明度、邊緣等特征挑取有代表性的單菌落純化，純化后經(jīng)革蘭氏染色和芽孢染色，菌體桿狀、產(chǎn)芽孢等特征選取芽抱桿菌轉(zhuǎn)入NA斜面培養(yǎng)基保存，作為待測(cè)菌株。拮抗初篩、復(fù)篩拮抗菌制備尖孢錸刀菌古巴專化型4號(hào)小種(F0C4)孢子液(約2.0X105個(gè)/mL)，以培養(yǎng)基的1/1000比例吸取孢子懸浮液至PDA培養(yǎng)基混勻后倒至四方形大板。均勻點(diǎn)接待測(cè)菌，28°C下培養(yǎng)4天，觀察有無抑菌圏。復(fù)篩時(shí)，在培養(yǎng)4天的香蕉枯萎病菌的菌落邊緣打取直徑為5mm的菌塊，將其移至空白PDA平板中央。然后在距中心5cm處劃直線接種供試拮抗細(xì)菌。每皿接種2個(gè)供試菌株，以只接種指示菌作為對(duì)照28°C培養(yǎng)6d。連續(xù)觀察記錄各拮抗菌菌落長(zhǎng)度、寬度及抑菌帶寬度，重復(fù)4次，最終計(jì)算抑制率。最終得到枯草芽孢桿菌(BaciIIus subtilis) BLGO10。2、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis) BLG010 的鑒定(I)形態(tài)學(xué)鑒定
將分離純化到的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) BLG010菌株接種于NA培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)48h，觀察菌落形態(tài)。另取培養(yǎng)48h的菌落，適當(dāng)稀釋后于顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示枯草芽孢桿菌(BaciIIus subtilis)BLG010菌株在NA培養(yǎng)基上呈乳脂色不透明，表面干燥，有皺褶突起，邊緣不整齊。顯微鏡下單個(gè)菌體呈桿狀，兩端鈍圓，革蘭氏染色后，染色均勻，并可見細(xì)胞中被染成藍(lán)紫色芽抱。(2)分子鑒定枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis) BLG010的16S rDNA全序列如序列表中的序列I所示，全長(zhǎng)為1429bp?？莶菅勘U菌(Bacillus subtilis) BLG010已于2012年04月06日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)其在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC No. 5953。實(shí)施例2、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLG010CGMCC No. 5953 對(duì)尖孢錸刀菌古巴專化型4號(hào)小種(F0C4)菌絲的拮抗作用I、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) BLG010CGMCC No. 5953 發(fā)酵濾液對(duì)病原菌絲抑制作用分別在熔融態(tài)的PDA培養(yǎng)基中加入枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLGOIOCGMCC No. 5953發(fā)酵濾液(按照下述步驟2的方法進(jìn)行制備)搖勻制平板。倒板前在培養(yǎng)皿中央至一無菌的載玻片，倒入培養(yǎng)基剛好沒過載玻片，將直徑5mm尖孢錸刀菌古巴專化型4號(hào)小種(F0C4)菌塊接至載玻片上，28°C培養(yǎng)5d后將載玻片取出直接置于共聚焦顯微鏡下鏡檢各處理的菌絲形態(tài)。每處理重復(fù)3次。顯微觀察發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLG010CGMCC No. 5953的發(fā)酵濾液對(duì)尖孢錸刀菌古巴?；?號(hào)小種(F0C4 )菌絲的生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用，菌絲破裂，消解(圖I)。表明枯草芽孢桿菌(Bac i I Iussubtilis) BLG010CGMCC No. 5953發(fā)酵濾液能明顯抑制尖孢錸刀菌古巴?；?號(hào)小種(F0C4)菌絲的生長(zhǎng)。2、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) BLG010CGMCC No. 5953 對(duì)尖孢錸刀菌古巴專化型4號(hào)小種(F0C4)分生孢子萌發(fā)的抑制作用本實(shí)驗(yàn)采用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) BLG010CGMCC No. 5953發(fā)酵上清液測(cè)試枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) BLG010CGMCC No. 5953的代謝物對(duì)尖孢錸刀菌古巴?；?號(hào)小種(F0C4)分生孢子萌發(fā)的抑制作用?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis) BLG010CGMCC No. 5953發(fā)酵上清液按照如下方法制備將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLG010CGMCC No. 5953接種到NA培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)2-3天，待其產(chǎn)生足量的分生孢子，用無菌鉬環(huán)刮取其孢子2 — 3環(huán)接種于250ml三角瓶(裝有50ml NA培養(yǎng)液)內(nèi)，置可控溫?fù)u床上，在30°C條件下，200rpm/min (旋轉(zhuǎn)半徑13mm)恒溫振蕩培養(yǎng)36h ;然后在無菌條件下按照10% (體積百分含量)的接種量接入500ml三角瓶?jī)?nèi)(裝有200ml LB培養(yǎng)液)；接種后的搖瓶在31°C條件下，以240rpm/min (旋轉(zhuǎn)半徑13mm)的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)36小時(shí)；此時(shí)菌株已在發(fā)酵液中產(chǎn)生高濃度的抑菌活性代謝產(chǎn)物。將以上步驟獲得的發(fā)酵液5000rpm/min離心10_15min沉降菌絲體及固形物,上清液用
0.22 u m的無菌微孔濾膜過濾,收集濾液(該濾液中無枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLGOIOCGMCC No. 5953)，該濾液即為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) BLG010CGMCCNo. 5953發(fā)酵上清液。取600 ill F0C4孢子液懸浮液(I X 107cfu/mL)，分裝至2ml離心管中。再分別往各離心管中加入200 ii I枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLG010CGMCC No. 5953發(fā)酵上清液，分別與病原菌菌液混勻置28°C恒溫培養(yǎng)，以加入無菌水為對(duì)照。每處理重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)計(jì)算拮抗芽孢桿菌12h和24h對(duì)香蕉枯萎病病原菌分生孢子萌發(fā)的抑制率。
對(duì)照萌發(fā)率-處理萌發(fā)率一抱子明發(fā)抑制率對(duì)照蔭發(fā)率ー100%結(jié)果表明枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) BLG010CGMCC No. 5953發(fā)酵濾液在12小時(shí)對(duì)F0C4分生孢子萌發(fā)的抑制率是89. 25%，在24小時(shí)對(duì)F0C4分生孢子萌發(fā)的抑制率是 73. 21%。3、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) BLG010CGMCC No. 5953 對(duì)尖孢錸刀菌古巴?；?號(hào)小種(F0C4)的抑制作用采用平板對(duì)峙法，測(cè)試枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLG010CGMCC No. 5953對(duì)尖孢錸刀菌古巴?；?號(hào)小種(F0C4)的拮抗作用。具體方法如下在馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基PDA (其中加5g/L蛋白胨，pH值調(diào)節(jié)到6. 5)平板中央接入直徑為5mm的尖孢錸刀菌古巴專化型4號(hào)小種(F0C4)(病原菌)菌絲塊，在距離病原菌兩側(cè)25mm處，用接種環(huán)劃線接種枯草芽抱桿菌(Bacillus subtil is )BLG010CGMCC No. 5953,以只接尖抱祿刀菌古巴?；?號(hào)小種(F0C4)菌絲塊的處理作為對(duì)照，于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，測(cè)量抑菌帶寬度，每處理重復(fù)3次。結(jié)果表明枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) BLGOIOCGMCC No. 5953對(duì)尖孢錸刀菌古巴?；?號(hào)小種(F0C4)的抑菌帶寬度為ll_13mm。實(shí)施例3、盆栽防治香蕉枯萎病試驗(yàn)將生長(zhǎng)3個(gè)月，健康的巴西香蕉苗移栽至裝有病土 (含有尖孢錸刀菌古巴?；?號(hào)小種(F0C4))的花盆，進(jìn)行3種不同的處理處理ー在移栽吋，用200ml濃度為I X 108cfu/mL 的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLG010CGMCC No. 5953 菌株菌懸液(用水懸浮枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) BLG010CGMCC No. 5953的孢子得到)沿香蕉基部燒灌，共處理150棵苗；處理ニ 用I X 107cfu/mL的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLGOIOCGMCC No. 5953菌懸液((用水懸浮枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLG010CGMCCNo. 5953的孢子得到))沿香蕉基部澆灌，共處理100棵苗；處理三為澆灌清水對(duì)照，用等體積的清水沿香蕉基部澆灌，共處理150棵苗。之后在溫室大棚里常溫培養(yǎng)，待對(duì)照出現(xiàn)發(fā)病癥狀后，調(diào)查病情指數(shù)和防病效果將香蕉枯萎病分為以下5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)
0級(jí)植株無枯黃癥狀。I級(jí)植株下部葉片出現(xiàn)輕微的枯黃癥狀，嫩葉完好，少部分根系輕微褐變，莖部出現(xiàn)水潰狀褐變。2級(jí)植株下部葉片出現(xiàn)明顯的枯黃癥狀，但嫩葉完好，根系出現(xiàn)褐變，莖部和假莖部出現(xiàn)水潰狀褐變。3級(jí)整個(gè)植株出現(xiàn)枯黃癥狀，根系褐變腐爛，莖部和假莖部褐變連片，少數(shù)葉柄出現(xiàn)紅褐。4級(jí)植株出現(xiàn)枯萎死亡癥狀，根系嚴(yán)重褐變腐爛。
病情指數(shù)=E (各級(jí)發(fā)病株數(shù)X該級(jí)代表數(shù))X 100%
總數(shù)X最高級(jí)代表值
防病效果=(對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))X100%
対照病情指數(shù)結(jié)果如表I 所示，說明枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLG010CGMCC No. 5953
對(duì)香蕉枯萎病具有很好的防病效果。表I.枯草芽抱桿菌(Bacillus subtiIis)BLG01OCGMCC No. 5953 對(duì)香蓮枯萎病的防病效果
處理ー處理ニI處理三(對(duì)照)
病情指數(shù) 16. 3%41. 3%87.4%
防病效果 81.4%52. 7%/
權(quán)利要求
1.枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis),其特征在于所述枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的菌株號(hào)為BLG010，其在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC No. 5953。
2.權(quán)利要求I所述的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)在生產(chǎn)分生孢子和/或菌絲體中的應(yīng)用。
3.ー種殺菌劑，它的活性成分是權(quán)利要求I所述的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的殺菌劑，其特征在干所述枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)為分生孢子或/和菌絲體。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的殺菌劑，其特征在于所述殺菌劑用于防治由尖孢錸刀菌古巴?；?Fusarium oxysporum f. sp. cubense)引起的植物病害。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的殺菌劑，其特征在于所述植物病害為香蕉枯萎病。
7.權(quán)利要求I所述的枯草芽孢桿菌在制備植物殺菌劑中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物殺菌劑的靶標(biāo)菌為尖孢錸刀菌古巴?；?Fusarium oxysporum f. sp. cubenseノ。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物殺菌劑用于防治香蕉枯萎病。
10.一種防治香蕉枯萎病的方法，包括采用IXlO8CfuAiL的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) BLG010 CGMCC No. 5953菌懸液澆灌香蕉苗基部的步驟。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLG010，其在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC No.5953。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLG010CGMCC No.5953在低濃度下能夠有效抑制香尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)，對(duì)香蕉枯萎病的防治具有重要意義。
文檔編號(hào)A01P3/00GK102747020SQ201210248300
公開日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月18日
發(fā)明者劉磊, 朱利林, 梁昌聰, 王國芬, 黃俊生 申請(qǐng)人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所