專利名稱：一株甲基營養(yǎng)性芽孢桿菌utm401及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物肥料領域，具體地，涉及ー種甲基營養(yǎng)性芽孢桿菌菌株UTM401及其制備生物肥料的用途。
背景技術：
生物肥料是利用微生物的有關性質，來提供作物生長所需要的氮素養(yǎng)分或提高土壤中難利用礦物態(tài)養(yǎng)分的有效性，從而促進作物對養(yǎng)分的吸收和生長，提高其產量和品質。 生物肥料在發(fā)展生態(tài)農業(yè)中具有不可替代性。利用有機廢物制備生物肥料不僅可以處理有機廢物，解決環(huán)境問題，還可實現有機廢物的資源化利用，是ー種公認的、低成本的、資源高效再生利用的有效途徑。目前，市場上的生物肥料要么是由于生產菌種退化、要么是因為生產エ藝、載體問題導致有效活菌數不足，致使產品功能無法充分顯現，質量得不到保證。而利用有機廢物制備生物肥料也存在發(fā)酵周期長、受場地限制的問題。生產生物肥料使用的菌種主要是圓褐固氮菌、巨大芽孢桿菌及根際促生細菌芽孢桿菌和假孢菌，基本上沒有發(fā)酵廢物的功能，限制了其作為發(fā)酵促進接種劑的應用。甲基營養(yǎng)性芽抱桿菌(Bacillus methylotrophicus)是韓國人Madhaiyan等在2010年新報道的一種可以代謝甲醇、具有ACC脫氨酶活性的植物根際促生菌。專利(申請?zhí)?01010561580. 3)報道了該微生物對植物病原真菌具有拮抗作用的特性，并將其應用于制備可吸性粉劑生物菌劑。但此微生物具有降解淀粉的特性及應用于有機廢物發(fā)酵處理，并制備作物促生性功能生物肥料至今未見公開報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供ー種具有作物促生作用的微生物及其利用有機廢物制備生物肥料的方法。本發(fā)明從污泥腐熟堆肥中分離到具有エ業(yè)化應用前景的菌株，為利用有機廢物制備生物肥料提供了ー種兼具農作物促生效果及降解有機廢物特性的微生物。本發(fā)明從采自大地綠源環(huán)保科技(北京)有限公司堆肥發(fā)酵車間的污泥腐熟堆肥中，利用馴化培養(yǎng)基(牛肉膏3-5g，酵母提取物3-5g，蛋白胨8-10g，氯化鈉3-5g，可溶性淀粉8-15g，蒸餾水1000ml)在40°C下，經多代富集馴化、功能篩選后得作物促生菌UTM401菌株。菌株UTM401已于2012年3月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJii :北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編 100101)保藏，分類命名為 Bacillus methylotrophicus，保藏號為 CGMCC No. 5927。本發(fā)明提供的UTM401在NA培養(yǎng)基(牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml，pH7. 2)上菌落特征是形態(tài)為圓形，表面干燥，乳白色，臍突狀，生長迅速，30-40°C培養(yǎng)36小時菌落直徑約3mm，生長溫度20_45°C。利用引物引物為(27f ):5' -AGAGTTTGA TCC TGG CTC AG-3/ 和(1492r):5' -GGT TAC CTT GTT ACGACT T-3/ 經 PCR 擴增該菌株的16S rRNA基因，獲得序列提交到EzTaxon數據庫進行比對，結果顯示UTM401菌株的該基因與Bacillus methylotrophicus的相似性最高,為99. 72%,此序列是鑒定該菌株的主要特征依據。其次是以上所述菌株的生長特性為鑒別該菌株的次要特征。本發(fā)明提供了一種甲基營養(yǎng)性芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus)菌株UTM401，其保藏編號為 CGMCC No. 5927。本發(fā)明提供了含有甲基營養(yǎng)性芽孢桿菌UTM401的菌劑。本發(fā)明提供了甲基營養(yǎng)性芽孢桿菌UTM401或其發(fā)酵產物或上述菌劑在植物促生中的應用。本發(fā)明提供了甲基營養(yǎng)性芽孢桿菌UTM401或其發(fā)酵產物或上述菌劑在制備生物肥料中的應用。本發(fā)明提供應用甲基營養(yǎng)性芽孢桿菌UTM401制備生物肥料的方法，包括以下步驟I)制備發(fā)酵液取本發(fā)明的甲基營養(yǎng)性芽孢桿菌菌株UTM401的活化菌種接種于液體培養(yǎng)基中，進行三級發(fā)酵；2)將發(fā)酵液接種于物料堆混合均勻進行發(fā)酵，所述物料堆為畜禽糞便與木薯加工廢棄物的混合物；3)堆溫下降至45-50°C時，再次接種發(fā)酵液；當堆溫降至環(huán)境溫度后，進行翻堆，控制堆溫在環(huán)境溫度，出料風干后，篩分得到生物肥料。其中，步驟I)所述的三級發(fā)酵為a)將甲基營養(yǎng)性芽孢桿菌菌株UTM401接種于液體培養(yǎng)基中，30_40°C，120_180r/min培養(yǎng)，當0D_≥I. 8時停止培養(yǎng)，得到一級發(fā)酵種子液；b)將ー級發(fā)酵種子液按體積比5-15%接種于液體培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度30-40°C，間歇攪拌通風，間隔Ih攪拌I次，姆次攪拌5_15min,攪拌速度120_160r/min,間隔O. 5h通風I次，每次通風5-10min，通氣量I: (O. 4-0. 8)，當OD6tltl彡2時停止培養(yǎng)，得到ニ級發(fā)酵種子液；c)將ニ級發(fā)酵種子液按體積比5-10%接種于液體培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度28-40°C，間歇攪拌通風，間隔Ih攪拌I次，每次攪拌10-20min，攪拌速度140_200r/min，間隔O. 5h通風I次，每次通風5-15min，通氣量I: (O. 8-1. 2)，當OD600彡2時停止培養(yǎng)，得到發(fā)酵液。其中，步驟2)所述的發(fā)酵液接種至物料堆的方法是取相當于總物料濕重1%_5%的玉米面或麥麩吸附相當于總物料濕重O. 1%-0. 5%的發(fā)酵液，然后接種至物料堆，混合均勻。其中，步驟2)所述的畜禽糞便與木薯加工廢棄物的混合物的碳氮比為2(Γ30，含水率為50% 60%。所述的木薯加工廢棄物為木薯渣和/或木薯皮。其中，步驟2)所述發(fā)酵液接種物料堆之后保持氧氣含量為8% 15%，間隔3飛天翻堆I次。本發(fā)明實施例中使用的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。本發(fā)明還提供了上述方法制備得到的生物肥料。本發(fā)明菌株UTM401利用有機物進行代謝制備生物肥料，促進升溫，具有起溫效果好，生產成本低，質量穩(wěn)定，縮短發(fā)酵周期的優(yōu)點；當堆肥過程溫度下降至45-50°C，再次接種該微生物種子液，繼續(xù)發(fā)酵，制得生物肥料。本發(fā)明菌株UTM401能在固態(tài)物料中再次迅速增菌，與發(fā)酵物料載體形成穩(wěn)定的菌落系統(tǒng)，能夠高密度地在植物根際定殖，兼有抑制植物病原菌、根際有害微生物，以及促進植物生長并提高作物產量的作用。本發(fā)明菌株UTM401及其發(fā)酵有機廢物制備的生物肥料綠色環(huán)保，無污染，性能優(yōu)良，具有較好的經濟效益和社會效益。


圖I為本發(fā)明菌株UTM401發(fā)酵物料堆過程中溫度變化圖。圖2為本發(fā)明菌株UTM401發(fā)酵物料堆過程中發(fā)芽指數變化圖。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。實施例I甲基營養(yǎng)性芽孢桿菌UTM401的分離與鑒定稱取IOg污泥腐熟堆肥樣品(采自大地綠源環(huán)保科技(北京)有限公司堆肥發(fā)酵車間)置于裝有10粒小玻璃珠的IOOml無菌水250ml三角瓶中，于40°C置于恒溫搖床上震蕩I小吋，然后靜置30分鐘，在超凈臺中，吸取上清液1ml，轉接至裝有IOOml已滅菌的馴化培養(yǎng)基(牛肉膏3g，酵母提取物3g，蛋白胨8g，氯化鈉3g，可溶性淀粉10g，1000 ml蒸餾水)中，在恒溫搖床上40°C下振蕩富集馴化培養(yǎng)3天,轉速160r/min。同樣方式,再次吸取Iml富集液，在相同條件下，再傳代培養(yǎng)3代。分別取馴化后的菌懸液lmL，加入到9mL無菌水中，以梯度稀釋法制成ΚΓ1，1(Γ2，IO-3,10Λ IO-5, IO-6, IO-7的稀釋度，取O. ImL平板涂布，每個稀釋度涂布于3個淀粉降解鑒定培養(yǎng)基平板上。取ImL的無菌水做上述同樣的操作，作為對照處理。在40°C下培養(yǎng)3天，選擇菌落分散較好的平板(在一定的稀釋度下的平板)，挑取降解圈大的單菌落，在鑒定培養(yǎng)基上，反復劃線分離純化3次，通過觀察降解圈的大小及有無情況，淘汰降解性能不穩(wěn)定的菌株，再將形態(tài)一致的菌落制片，進行簡單染色，在油鏡下觀察菌體形態(tài)，多視野下觀察菌體細胞形態(tài)，確認菌體形態(tài)一致后，接種至LB斜面培養(yǎng)至豐厚，在4°C下保存，備用。上述鑒定培養(yǎng)基的配方為可溶性淀粉10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，ρΗ7· O,瓊脂粉15g-20g,曲利苯藍O. 05 O. lg, IOOOrnl蒸餾水；LB培養(yǎng)基的配方為胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，瓊脂15g，植物凝膠10g，蒸餾水1000ml，pH7. 2。以本發(fā)明菌株的DNA為模板，PCR擴增其16S rDNA序列，引物為(27f) :5' -AGAGTT TGA TCC TGG CTC AG-3/ 和(1492r):5' -GGT TACCTT GTT ACG ACT T-3/。PCR 反應程序為95°C預變性5min，95°C變性30s，53°C退火45s，72°C延伸90s，30個循環(huán)，72°C延伸lOmin。擴增產物經電泳檢測其純度后測序，測序結果見序列表SEQ ID No. I所示。獲得的16S rDNA基因序列通過EzTaxon數據庫(http://www. eztaxon. org/)進行比對，與菌株Bacillus methylotrophicus的相似性最高，同源性為99. 72%,結合菌株的生長特征,把該菌株鑒定為Bacillus methylotrophicus，命名為UTM401，并于2012年3月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為Bacillus methylotrophicus,保藏號為 CGMCC No. 5927。實施例2菌株UTM401發(fā)酵種子液的制備(I)將4°C保存的本發(fā)明生產菌株UTM401斜面轉接至NA培養(yǎng)基平板上，在30°C下培養(yǎng)至豐厚，然后用無菌玻璃刮刀將其全部轉接至裝有1000ml LB液體培養(yǎng)基的5000ml三角瓶中，在振蕩器上37°C，轉速160r/min下震蕩培養(yǎng)2天，此時0D_為2. 202，停止培養(yǎng)，此為ー級發(fā)酵種子液。將ー級發(fā)酵種子液按液體培養(yǎng)基體積比的5%，接種至含有LB液體培養(yǎng)基的發(fā)酵種子罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵條件是溫度37°C，間歇攪拌通風，間隔I小時攪拌I次，毎次攪拌5分鐘,攪拌速度150r/min，間隔半小時通風I次,每次通風5分鐘,通氣量1:0. 6。培養(yǎng)5天后，檢測OD6tltl為3. 051，停止培養(yǎng)，此為ニ級發(fā)酵種子液。 將ニ級發(fā)酵種子液按液體培養(yǎng)基體積比的10%，接種至發(fā)酵種子罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵條件是溫度37°C，間歇攪拌通風，間隔I小時攪拌I次，毎次攪拌15分鐘，攪拌速度180r/min，間隔半小時通風I次，每次通風10分鐘，通氣量1:1.2。培養(yǎng)6天后，檢測0D_為3. 112，停止培養(yǎng)，此為發(fā)酵種子液。實施例3菌株UTM401發(fā)酵種子液的制備(2)將4°C保存的本發(fā)明生產菌株UTM401斜面轉接至NA培養(yǎng)基平板上，在30°C下培養(yǎng)至豐厚，然后用無菌玻璃刮刀將其全部轉接至裝有2000ml LB液體培養(yǎng)基的5000ml三角瓶中，在振蕩器上30°C，轉速150r/min下震蕩培養(yǎng)3天，此時0D_為2. 084，停止培養(yǎng)，此為ー級發(fā)酵種子液。將ー級發(fā)酵種子液按液體培養(yǎng)基體積比的10%，接種至含有LB液體培養(yǎng)基的發(fā)酵種子罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵條件是溫度30°C，間歇攪拌通風，間隔I小時攪拌I次，毎次攪拌10分鐘，攪拌速度120r/min，間隔半小時通風I次，每次通風5分鐘，通氣量I: O. 5。培養(yǎng)5天后，檢測0D_為3. 257，停止培養(yǎng)，此為ニ級發(fā)酵種子液。將ニ級發(fā)酵種子液按液體培養(yǎng)基體積比的5%，接種至發(fā)酵種子罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵條件是溫度28°C，間歇攪拌通風，間隔I小時攪拌I次，毎次攪拌10分鐘，攪拌速度200r/min，間隔半小時通風I次，每次通風5分鐘，通氣量1:1。培養(yǎng)7天后，檢測OD6tltl為
3.257，停止培養(yǎng)，此為發(fā)酵種子液。實施例4菌株UTM401發(fā)酵種子液的制備(3)將4°C保存的本發(fā)明生產菌株UTM401斜面轉接至NA培養(yǎng)基平板上，在30°C下培養(yǎng)至豐厚，然后用無菌玻璃刮刀將其全部轉接至裝有1500ml LB液體培養(yǎng)基的5000ml三角瓶中，在振蕩器上40°C，轉速150r/min下震蕩培養(yǎng)2天，此時0D_為I. 984，停止培養(yǎng)，此為ー級發(fā)酵種子液。將ー級發(fā)酵種子液按液體培養(yǎng)基體積比的15%，接種至裝有LB液體培養(yǎng)基的發(fā)酵種子罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵條件是溫度40°C，間歇攪拌通風，間隔I小時攪拌I次，毎次攪拌5分鐘，攪拌速度160r/min，間隔半小時通風I次，每次通風8分鐘，通氣量1:0. 8。培養(yǎng)5天后，檢測OD6tltl為3. 007，停止培養(yǎng)，此為ニ級發(fā)酵種子液。將ニ級發(fā)酵種子液按液體培養(yǎng)基體積比的10%，接種至發(fā)酵種子罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵條件是溫度40°C，間歇攪拌通風，間隔I小時攪拌I次，毎次攪拌20分鐘，攪拌速度140r/min，間隔半小時通風I次，每次通風15分鐘，通氣量I: O. 8。培養(yǎng)6天后，檢測OD_為2. 305，停止培養(yǎng)，此為發(fā)酵種子液。實施例5利用菌株UTM401發(fā)酵種子液制備生物肥料(I)取雞糞與木薯渣，檢測其基本性質，結果見表I :表I
原料名稱水分(% ) 全碳(% ) 全氮(% ) 原料C7、
喪27.518.5I —S99.8 拿篡渣74 J57,30.38150.8經計算，當雞糞與木薯渣的物料配比為2:3時，碳氮比為23. 5，含水率為55%。取400公斤雞糞與600公斤木薯渣混合均勻后，再取相當干物料總濕重3%的玉米面30公斤吸附相當干物料總濕重O. 3%的實施例2制備的發(fā)酵液3升，然后接種至物料堆，混合均勻，于發(fā)酵池中進行發(fā)酵。發(fā)酵過程中，進行曝氣使氧氣含量為8%之間，期間每隔3天翻拋一次。當堆溫下降至45°C后，再次按上次方法接種發(fā)酵液，待溫度下降至環(huán)境溫度后，再次每隔I天翻堆至堆溫不再上升后，出料風干后，經篩分得到生物肥料。同吋，以等量無菌水代替發(fā)酵液進行對照實驗。發(fā)酵周期為30天。對發(fā)酵過程中，溫度和發(fā)芽指數的變化如圖I、圖2所示。圖I中接種UTM401處理在堆肥第2天即達到54°C，對照實驗則在第4天達到53°C，與對照實驗相比，接種UTM401發(fā)酵液后，物料起溫快、效果好。圖2中，接UTM401處理在發(fā)酵第20天的發(fā)芽指數已達86%，超過80%，已完全無植物毒性，達到腐熟；對照實驗則在發(fā)酵第30天發(fā)芽指數已達85%，達到腐熟；發(fā)酵結束后，接UTM401處理比對照實驗高13%。說明接種UTM401發(fā)酵液后，物料發(fā)酵周期縮短，發(fā)酵所得的生物肥料的腐熟度提高。實施例6利用菌株UTM401發(fā)酵種子液制備生物肥料(2)取豬糞與木薯皮，檢測其基本性質，結果見表2 表 2
.原料名稱.................................水分(％>....................................全破(%)..................................全氣(%>.........................................Ji料... . ..—
誠. _ 5(15 __ 31.5 __ 2.03 __ 15.5 _
木薯皮60.243.4OJI140J經計算，當豬糞與木薯皮的物料配比為2:1時，碳氮比為22. 7，含水率為54%。取400公斤豬糞與200公斤木薯皮混合均勻后，再取相當干物料總濕重5%的麥麩30公斤吸附相當干物料總濕重O. 5%的實施例2制備的發(fā)酵液3升，然后接種至物料堆，混合均勻，于發(fā)酵池中進行發(fā)酵。發(fā)酵周期為30天。
發(fā)酵過程中，進行曝氣使氧氣含量在12%，期間每隔4天翻拋一次。當堆溫下降至45°C后，再次按上次方法接種發(fā)酵液，待溫度下降至環(huán)境溫度后，再次每隔I天翻堆至堆溫不再上升后，出料風干后，經篩分得到生物肥料。同吋，以等量無菌水代替發(fā)酵液進行對照實驗。本試驗也得到了與實施例5的類似結果接種UTM401發(fā)酵液后，物料發(fā)酵周期縮短，發(fā)酵所得的生物肥料的腐熟度提高。不同之處在于具體數值上的差別，試驗結果見下表表權利要求
1.甲基營養(yǎng)性芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)菌株UTM401,其保藏編號為CGMCC No. 5927。
2.含有權利要求I所述甲基營養(yǎng)性芽孢桿菌UTM401的菌劑。
3.權利要求I所述的甲基營養(yǎng)性芽孢桿菌UTM401或其發(fā)酵產物或權利要求2所述的囷劑在植物促生中的應用。
4.權利要求I所述的甲基營養(yǎng)性芽孢桿菌UTM401或權利要求2所述的菌劑在制備生物肥料中的應用。
5.一種制備生物肥料的方法，其特征在于，包括以下步驟 O制備發(fā)酵液取權利要求I所述甲基營養(yǎng)性芽孢桿菌菌株UTM401的活化菌種接種于液體培養(yǎng)基中，進行三級發(fā)酵； 2)將發(fā)酵液接種于物料堆混合均勻進行發(fā)酵，所述物料堆為畜禽糞便與木薯加工廢棄物的混合物； 3)堆溫下降至45-50°C時，再次接種發(fā)酵液；當堆溫降至環(huán)境溫度后，進行翻堆，控制堆溫在環(huán)境溫度，出料風干后，篩分得到生物肥料。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟I)所述的三級發(fā)酵為 a)將甲基營養(yǎng)性芽孢桿菌菌株UTM401接種于液體培養(yǎng)基中，30-40°C，120-180r/min培養(yǎng)，當OD6tltl ^ I. 8時停止培養(yǎng)，得到一級發(fā)酵種子液； b)將ー級發(fā)酵種子液按體積比5-15%接種于液體培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度30-40°C，間歇攪拌通風，間隔Ih攪拌I次,姆次攪拌5_15min,攪拌速度120_160r/min,間隔O. 5h通風I次，每次通風5-10min，通氣量1:0. 4-0. 8，當OD6tltl彡2時停止培養(yǎng)，得到ニ級發(fā)酵種子液； c)將ニ級發(fā)酵種子液按體積比5-10%接種于液體培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度28-40°C，間歇攪拌通風，間隔Ih攪拌I次，每次攪拌10-20min,攪拌速度140-200r/min,間隔O. 5h通風I次，每次通風5-15min，通氣量1:0. 8-1. 2，當OD6tltl彡2時停止培養(yǎng)，得到發(fā)酵液。
7.如權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2)所述的發(fā)酵液接種至物料堆的方法是取相當于總物料濕重1%_5%的玉米面或麥麩吸附相當于總物料濕重O. 1%-0. 5%的發(fā)酵液，然后接種至物料堆，混合均勻。
8.如權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2)所述的畜禽糞便與木薯加工廢棄物的混合物的碳氮比為2(Γ30，含水率為50%飛0%。
9.如權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2)所述發(fā)酵液接種物料堆之后保持氧氣含量為8% 15%，間隔3飛天翻堆I次。
10.權利要求5、任一所述方法制備得到的生物肥料。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株甲基營養(yǎng)性芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus)UTM401及其應用，該菌生物保藏編號為CGMCCNo.5927。將本發(fā)明菌株UTM401的發(fā)酵種子液接種于有機廢物物料堆中，進行發(fā)酵處理，能夠制備生物肥料。使用菌株UTM401制備生物肥料，成本低，質量穩(wěn)定，能夠縮短發(fā)酵周期，且在固態(tài)物料中再次迅速增菌，與發(fā)酵物料載體形成穩(wěn)定的菌落系統(tǒng)，能夠高密度地在植物根際定殖，兼有抑制植物病原菌、根際有害微生物、以及促進植物生長并提高作物產量的作用。本發(fā)明菌株UTM401及其發(fā)酵有機廢物制備的生物肥料綠色環(huán)保，無污染，性能優(yōu)良，具有較好的經濟效益和社會效益。
文檔編號A01P21/00GK102703363SQ20121022695
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月29日 優(yōu)先權日2012年5月14日
發(fā)明者劉永躍, 周順桂, 汪涌, 許宜北 申請人:大地綠源環(huán)保科技(北京)有限公司