專利名稱：一種用于分離荔枝霜疫霉病菌的培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于分離荔枝霜疫霉病菌的培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
蒸枝(Litchi chinensis Sonn.)是著名的嶺南佳果,在北纟韋18° 31°均有種植，分布遍及海南、廣西、云南、福建、貴州、四川、廣東、臺(tái)灣等8省區(qū)。2008年全國(guó)種植面積約900萬(wàn)畝，超過(guò)約820萬(wàn)畝的荔枝，成為種植面積最大的熱帶水果。我國(guó)的荔枝產(chǎn)量超過(guò)全球產(chǎn)量的60%。荔枝霜疫霉病是荔枝一種主要病害，該病害可以危害荔枝的花和果，花期發(fā)病，造成大量的枯花，幼果期發(fā)病，引起落果，成熟期發(fā)病，引起果實(shí)腐爛。在鮮果運(yùn)輸銷售期，此病繼續(xù)發(fā)展，也嚴(yán)重影響鮮果的貯運(yùn)和外銷，進(jìn)而影響了荔枝產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展。藥劑防治是目前防治該病最有效的方法之一。
蒸枝霜疫霉病菌(Peronophythora Litchi Chen ex Ko et al)以菌絲體和卵抱子在病葉、病果及土壤中越冬，為翌年的初侵染病源。翌年春末夏初產(chǎn)生孢子囊，隨風(fēng)雨傳播，孢子囊產(chǎn)生的游動(dòng)孢子侵入寄主葉片和果實(shí)為害。為了對(duì)荔枝霜疫霉病菌進(jìn)行相關(guān)研究，以及調(diào)查病原菌的越冬菌量和田間發(fā)病情況，做好病害的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)，通過(guò)分離而獲得純化的荔枝霜疫霉病菌是必要的。常規(guī)的病原菌分離方法是《植病研究方法》介紹的用75%乙醇和O. 1%升汞液表面消毒處理。實(shí)際工作中，在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離的樣本往往不是新鮮樣品，是經(jīng)田間采樣后存放有一定時(shí)間的病殘?bào)w，這些荔枝病組織中就不可避免的常常帶有其他雜菌，按常規(guī)方法進(jìn)行分離組織病原菌時(shí)，由于這些雜菌的生長(zhǎng)較荔枝霜疫霉病菌迅速，雜菌的菌絲常將荔枝霜疫霉病菌覆蓋，而快速生長(zhǎng)的細(xì)菌也會(huì)抑制荔枝霜疫霉病菌的生長(zhǎng)。傳統(tǒng)病原菌分離方法中，利用普通培養(yǎng)基從病組織中分離荔枝霜疫霉時(shí)，采集的病組織若不消毒或是消毒時(shí)間短，造成培養(yǎng)時(shí)有雜菌污染，達(dá)不到分離純化的目的。若消毒時(shí)間太長(zhǎng)，往往在殺死雜菌的同時(shí)，也會(huì)把要分離的病原菌殺死，造成病原菌分離率往往不太聞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種殺菌劑、用于分離荔枝霜疫霉病菌(Peronophythora Litchi Chen ex Ko et al)的培養(yǎng)基、和分離蒸枝霜疫霉病菌(Peronophythora Litchi Chen ex Ko et al)的方法。本發(fā)明所提供的殺菌劑，其活性成分為如下I)或2)所示I)由苯醚甲環(huán)唑、多菌靈、利福平和青霉素組成；2)由苯醚甲環(huán)唑、咪鮮胺、利福平和青霉素組成。上述殺菌劑，所述I)所示殺菌劑中，所述苯醚甲環(huán)唑、多菌靈、利福平和青霉素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為(10-20): (10-50): (50-100): (50-100)，具體為 10 10 50 :50，或 15 20 70 70，或 20 50 :100 :100 ；
上述殺菌劑，所述2)所示殺菌劑中，所述苯醚甲環(huán)唑、咪鮮胺、利福平和青霉素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為(10-20): (10-50): (50-100): (50-100)，具體為 10 10 50 :50，或 15 20 70 70，或 20 50 :100 100o本發(fā)明所提供的用于分離蒸枝霜疫霉病菌(Peronophythora Litchi Chen ex Koet al)的培養(yǎng)基，為如下I或II所示I、是向白云豆培養(yǎng)基中添加權(quán)利要求I或2中所述I)所示殺菌劑得到的；II、是向白云豆培養(yǎng)基中添加權(quán)利要求I或2中所述2)所示殺菌劑得到的。上述I所示培養(yǎng)基中，所述苯醚甲環(huán)唑在所述白云豆培養(yǎng)基中的濃度為IOyg/mL-20 μ g/mL,具體為10 μ g/mL、15 μ g/mL或20 μ g/mL ;所述多菌靈在所述白云豆培養(yǎng)基中的濃度為10 μ g/mL-50 μ g/mL,具體為10 μ g/mL>20 μ g/mL或50 μ g/mL ;所述利福平在所述白云豆培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL-100 μ g/mL,具體為50 μ g/mL>70 μ g/mL或100 μ g/mL ;所述青霉素在所述白云豆培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL-100 μ g/mL,具體為50 μ g/mL、 70 μ g/mL 或 100 μ g/mL ；上述II所示培養(yǎng)基中，所述苯醚甲環(huán)唑在所述白云豆培養(yǎng)基中的濃度為IOyg/mL-20 μ g/mL,具體為10 μ g/mL、15 μ g/mL或20 μ g/mL ;所述咪鮮胺在所述白云豆培養(yǎng)基中的濃度為10 μ g/mL-50 μ g/mL,具體為10 μ g/mL>20 μ g/mL或50 μ g/mL ;所述利福平在所述白云豆培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL-100 μ g/mL,具體為50 μ g/mL、70 μ g/mL或100 μ g/mL ;所述青霉素在所述白云豆培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL-100 μ g/mL,具體為50 μ g/mL、70 μ g/mL 或 100 μ g/mL。上述培養(yǎng)基在分離蒸枝霜疫霉病菌(Peronophythora Litchi Chen ex Ko et al)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所提供的分離蒸枝霜疫霉病菌(Peronophythora Litchi Chen ex Ko etal)的方法，包括如下步驟用上述任一所述培養(yǎng)基培養(yǎng)樣本，得到荔枝霜疫霉病菌；所述樣本為感染荔枝霜疫霉病菌的植物的葉片或果實(shí)。本發(fā)明的白云豆選擇性培養(yǎng)基成本低廉、制作簡(jiǎn)便，且對(duì)細(xì)菌具有非常好的抑制作用。實(shí)驗(yàn)證明，用本發(fā)明的白云豆選擇性培養(yǎng)基分離荔枝霜疫霉的方法，解決了荔枝霜疫霉等植物病原卵菌分離過(guò)程中各種非目標(biāo)真菌和細(xì)菌污染嚴(yán)重的問(wèn)題；該方法分離效率高、可靠、省時(shí)、省力。


圖I為三種抗生素對(duì)植株葉片表面細(xì)菌的抑制作用。圖2為三種抗生素對(duì)果皮表面的細(xì)菌抑制作用。圖3為荔枝霜疫霉病的癥狀(攝于廣西北流)
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。多菌靈原藥購(gòu)自安徽廣信農(nóng)化股份有限公司(安徽廣信農(nóng)化集團(tuán)有限公司)，其主要活性成分物質(zhì)的化學(xué)名稱是N —(2—苯駢咪唑基)一氨基甲酸甲酯，通用名稱為多菌靈，分子式C9H9N302。該藥中主要活性成分物質(zhì)的質(zhì)量百分含量為98. 9 %。苯醚甲環(huán)唑原藥購(gòu)自杭州宇龍化工有限公司。其主要活性成分物質(zhì)的化學(xué)名稱是順，反-3-氯-4-[4-甲基-2-1H-1，2，4-三唑-I-基甲基)-1，3- 二啞戊烷_(kāi)2_基)苯基4-氯苯基醚(順，反比例約為45:55)，通用名稱是苯醚甲環(huán)唑。該藥中主要活性成分物質(zhì)的質(zhì)量百分含量為96 %。咪鮮胺原藥(又叫咪鮮胺)購(gòu)自海南力智生物工程有限公司，其主要活性成分物質(zhì)的化學(xué)名稱是N-丙基-N-[2_(2，4，6-三氯苯氧基)乙基]-咪唑-I-甲酰胺，分子式C15H16C13N302。該藥中咪鮮胺的質(zhì)量百分含量為97 %。青霉素、利福平、氯霉素、鏈霉素、硫酸新霉素和鹽酸四環(huán)素均購(gòu)自北京拓英坊科技有限公司。實(shí)施例I、不同濃度的三種真菌抑制劑和六種抗生素對(duì)荔枝霜疫霉的抑制作用
一、不同濃度的三種真菌抑制劑對(duì)荔枝霜疫霉的抑制作用以二甲基甲酰胺為多菌靈的溶劑，以丙銅或甲醇為苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺的溶劑，分別配制5000 μ g/mL的三種藥劑母液10ml，三種藥劑的稱量量依次為50. 6mg、52. Omg和
51.5mg ;將這三種母液分別配制系列濃度為50 μ g/mL>20 μ g/mL和10 μ g/mL的多菌靈，咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑的帶毒白云豆平板，以加有溶劑的平板為對(duì)照；然后采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定荔枝霜疫霉對(duì)三種真菌抑制劑的敏感性。將荔枝霜疫霉菌株在白云豆平板上于25°C預(yù)培養(yǎng)7d，用直徑為5mm的打孔器于菌落邊緣的同一圓周上打取菌餅，將菌餅接種到分別含有三種藥劑系列濃度的白云豆帶毒平板中央(各濃度含等量有機(jī)溶劑)，于25°C下黑暗培養(yǎng)，7d后用十字交叉法測(cè)量各處理的菌落增長(zhǎng)直徑(菌落直徑減去菌餅直徑5_)，每處理重復(fù)3次；最后按照下面公式求出各藥劑濃度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制百分率(％)，抑制率(%) = [(對(duì)照菌落增長(zhǎng)直徑-處理菌落增長(zhǎng)直徑)/ (對(duì)照菌落增長(zhǎng)直徑)]X 100。測(cè)定了供試的三種真菌抑制劑對(duì)荔枝霜疫霉的毒力，結(jié)果如表I所示，不同濃度的多菌靈對(duì)荔枝霜疫霉的抑制率均低于10%，因此可以采用10-50 μ g/mL的多菌靈作為選擇性藥劑；苯醚甲環(huán)唑50 μ g/mL濃度的藥劑對(duì)荔枝霜疫霉的抑制率在20%左右，20 μ g/mL濃度的苯醚甲環(huán)唑?qū)笾λ呙沟纳L(zhǎng)反而有促進(jìn)作用，10 μ g/mL的濃度對(duì)荔枝霜疫霉也沒(méi)有抑制作用，因此，可以采用10-20 μ g/mL濃度的苯醚甲環(huán)唑作為選擇性藥劑；咪鮮胺50 μ g/mL濃度的藥劑對(duì)荔枝霜疫霉有促進(jìn)作用，抑制率為-68. 7%。20和10 μ g/mL濃度的咪鮮胺對(duì)荔枝霜疫霉均沒(méi)有抑制作用，所以也可以采用10-50 μ g/mL的咪鮮胺為分離荔枝霜疫霉中使用的選擇性藥劑。表I三種真菌抑制劑對(duì)荔枝霜疫霉的抑制作用
權(quán)利要求
1.一種殺菌劑，其活性成分為如下I)或2)所示 O由苯醚甲環(huán)唑、多菌靈、利福平和青霉素組成； 2)由苯醚甲環(huán)唑、咪鮮胺、利福平和青霉素組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的殺菌劑，其特征在于所述I)所示殺菌劑中，所述苯醚甲環(huán)唑、多菌靈、利福平和青霉素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為(10-20) :(10-50) :(50-100) : (50-100)，具體為 10 10 50 :50，或 15 20 70 :70，或 20 50 :100 :100 ； 所述2)所示殺菌劑中，所述苯醚甲環(huán)唑、咪鮮胺、利福平和青霉素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為(10-20): (10-50): (50-100): (50-100)，具體為 10 10 50 :50，或 15 20 70 :70，或 20 50 100 :100。
3.一種用于分離蒸枝霜疫霉病菌(Peronophythora Litchi Chen ex Ko et al)的培養(yǎng)基，為如下I或II所示 I、是向白云豆培養(yǎng)基中添加權(quán)利要求I或2中所述I)所示殺菌劑得到的； II、是向白云豆培養(yǎng)基中添加權(quán)利要求I或2中所述2)所示殺菌劑得到的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述I所示培養(yǎng)基中，所述苯醚甲環(huán)唑在所述白云豆培養(yǎng)基中的濃度為10 μ g/mL-20 μ g/mL,具體為10 μ g/mL、15 μ g/mL或20 μ g/mL ;所述多菌靈在所述白云豆培養(yǎng)基中的濃度為10 μ g/mL-50 μ g/mL，具體為10 μ g/mL>20 μ g/mL或50 μ g/mL ;所述利福平在所述白云豆培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL-100 μ g/mL,具體為50 μ g/mL、70 μ g/mL或100 μ g/mL ;所述青霉素在所述白云豆培養(yǎng)基中的濃度為 50 μ g/mL-100 μ g/mL,具體為 50 μ g/mL、70 μ g/mL 或 100 μ g/mL ； 所述II所示培養(yǎng)基中，所述苯醚甲環(huán)唑在所述白云豆培養(yǎng)基中的濃度為IOyg/mL-20 μ g/mL,具體為10 μ g/mL、15 μ g/mL或20 μ g/mL ;所述咪鮮胺在所述白云豆培養(yǎng)基中的濃度為10 μ g/mL-50 μ g/mL,具體為10 μ g/mL>20 μ g/mL或50 μ g/mL ;所述利福平在所述白云豆培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL-100 μ g/mL,具體為50 μ g/mL>70 μ g/mL或100 μ g/mL ;所述青霉素在所述白云豆培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL-100 μ g/mL,具體為50 μ g/mL、70 μ g/mL 或 100 μ g/mL。
5.權(quán)利要求3或4所述培養(yǎng)基在分離蒸枝霜疫霉病菌(PeronophythoraLitchi Chenex Ko et al)中的應(yīng)用。
6.一種分離蒸枝霜疫霉病菌(Peronophythora Litchi Chen ex Ko et al)的方法，包括如下步驟用權(quán)利要求3或4所述培養(yǎng)基培養(yǎng)樣本，得到荔枝霜疫霉病菌；所述樣本為感染荔枝霜疫霉病菌的植物的葉片或果實(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于分離荔枝霜疫霉病菌的培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基為如下Ⅰ或Ⅱ所示Ⅰ、是向白云豆培養(yǎng)基中添加由苯醚甲環(huán)唑、多菌靈、利福平和青霉素組成的殺菌劑得到的；Ⅱ、是向白云豆培養(yǎng)基中添加由苯醚甲環(huán)唑、咪鮮胺、利福平和青霉素組成的殺菌劑得到的。本發(fā)明的白云豆選擇性培養(yǎng)基成本低廉、制作簡(jiǎn)便，且對(duì)細(xì)菌具有非常好的抑制作用。實(shí)驗(yàn)證明，用本發(fā)明的白云豆選擇性培養(yǎng)基分離荔枝霜疫霉的方法，解決了荔枝霜疫霉等植物病原卵菌分離過(guò)程中各種非目標(biāo)真菌和細(xì)菌污染嚴(yán)重的問(wèn)題；該方法分離效率高、可靠、省時(shí)、省力。
文檔編號(hào)A01N43/653GK102763662SQ20121017784
公開(kāi)日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2012年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月31日
發(fā)明者劉西莉, 劉鵬飛, 周俞辛, 畢揚(yáng), 王茜, 胡健, 陳磊 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)