專利名稱：一種櫸樹無菌播種方法
技術領域：
本發(fā)明涉及林業(yè)科學中 的林木組織培養(yǎng)育苗技術，具體是一種櫸樹無菌播種方法。背景技術：
棒樹scAffeioferiaaa)屬于偷科(Ulmaceae family)棒屬(Ze^/AoFa),落葉大喬木，分布于地中海東部至亞洲東部，約10個物種。我國主要產(chǎn)于遼東半島至西南以東的廣大地區(qū)。具有樹齡長，抗風、抗早、病蟲害少、材質優(yōu)良等特點。櫸樹木材致密堅硬，紋理美觀，不易伸縮與撓曲，耐腐性強，是造船、橋梁以及生產(chǎn)各類高檔家具和工藝品的上等木材，屬于高檔的硬闊葉用材樹種；莖皮含纖維，且含量較多，是制造人造棉、繩索和造紙的原料；樹根根系發(fā)達，能夠固持水土，保養(yǎng)水源，改善土壤透氣性和結構，是很好的水土保持樹種；樹形優(yōu)美，樹冠冠幅大，葉色季相變化豐富，因而又是深受人們喜愛的傳統(tǒng)色葉園林樹種和重要的園林綠化景觀樹種。由于櫸樹具有較高經(jīng)濟、生態(tài)和景觀利用價值，且現(xiàn)存櫸樹資源非常緊缺，在第一批《國家重點保護野生植物名錄》中，櫸樹被列為國家二級重點保護的野生植物。櫸樹花小，落花落果現(xiàn)象嚴重，且種子的結實率僅在10%左右，已被列為國家二類保護植物?，F(xiàn)階段，我國用材櫸木主要依靠進口。開展櫸樹組織培養(yǎng)研究，對加速優(yōu)良櫸樹苗木的繁殖，制備人工種子，開展細胞融合和體細胞雜交等生物技術育種有著極其重要的意義。由于櫸樹種子消毒極難，消毒后又不易萌發(fā)，給櫸樹的組織培養(yǎng)帶來一定困難。因此開展櫸樹無菌播種技術研究，對于突破櫸樹組織培養(yǎng)瓶頸具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種櫸樹無菌播種方法。利用櫸樹成熟合子胚進行無菌播種，通過成熟合子胚的脫分化和再分化過程培育出櫸樹有根組培小苗。以解決櫸樹種子不易消毒，消毒后不萌發(fā)等問題，突破利用櫸樹成熟合子胚繁育的瓶頸。本發(fā)明通過以下技術方案達到上述目的，一種櫸樹無菌播種方法，包括如下步驟
I、外植體的采集、消毒
收集櫸樹種子，將采回的種子用清水浸泡I天，再用洗潔精搓洗，后用去離子水清洗I 3次，置于超凈工作臺上去種皮。將去除種皮的成熟合子胚用75%乙醇浸泡滅菌10 S，蒸懼水沖洗I 3次,再用0. 1% HgCl2以振蕩的方式進行滅菌處理4 6 min,用無菌水沖洗3 5次。2、成熟合子胚愈傷誘導、愈傷增殖、芽分化培養(yǎng)、單芽生根培養(yǎng)
將消毒好的去種皮的成熟合子胚接種到改良WPM+6-BA1. 0 2.0 mg I71+蔗糖30000 mg*!/1+瓊脂4000 mg*!/1的培養(yǎng)基上進行誘導培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為25±2°C，1000 1500LX，每天光照10 14 h為宜。30 d后將誘導的大團愈傷組織分割成小團，轉接到改良 WPM+6-BA0. 5 I. 0 mg L—1+ 蔗糖 30000 mg.L-1+ 瓊脂 4000 mg.L-1 的增殖培養(yǎng)基上，以促進愈傷組織的增殖。愈傷組織增殖到一定數(shù)量后，轉入改良WPM+6-BA2. Omg -L^1+NAAO 1.0 mg L—1+蔗糖30000 mg*!/1+瓊脂4000 mg*!/1的分化培養(yǎng)基上，誘導愈傷組織分化出芽。將誘導出的株高1.0 cm以上的單芽剪下，接種到生根培養(yǎng)基1/2改良WPM+ IBA0. I I. Omg*!/1+ 鹿糖 20000 mg.L-1+ 瓊脂 5000 mg.L-1 中誘導生根。所述改良WPM培養(yǎng)基的組成為
KNO3900mg L-1
NH4NO3400 mg L—1
CaCl2. 2H20264 mg L—1
MgSO4. 7H20370 mg L-1 Ca (NO3) 2. 4 H2O556 mg.L-1
KH2PO3270 mg.171
MnSO4. 4 H2O22. 3 mg.L-1
ZnSO4. 7 H2O8. 6 mg.171
FeSO4 7H2027. 8mg*L_1
Na2-EDTA 2H2037. 3mg*L_1
CuSO4. 5 H2O0. 025 mg.L-1
H3BO36. 2 mg*L 1
Na2MoO4. 2 H2O0. 25 mg*L 1
KI0. 83 mg.L-1
CoCl2. 6 H2O0. 025 mg.L-1
維生素 BI0. 4 mg*!/1
維生素 B60. 5 mg L_1
煙酸0. 5 mg.171
甘氨酸2. 0 mg L_1
肌醇100 mg*L^10本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下突出的實質性特點和顯著進步
I、由于采用剝?nèi)シN皮的種子進行消毒，污染率大幅降低。2、采用櫸樹成熟合子胚為外植體，通過脫分化和再分化的途徑再生完整植株，既能解決櫸樹種子不萌發(fā)的問題，又能通過愈傷組織的增殖，大量繁育該樹種，達到保護瀕危樹種種質資源的目的，增殖系數(shù)約為3 5倍/30d。具體實施例方式 以下通過具體實施例對本發(fā)明的技術方案作進一步說明。本發(fā)明所述的櫸樹無菌播種方法，包括如下步驟
1、種子的收集
將新鮮櫸樹種子或叫小堅果采回后，放在通風蔭涼的地方自然干燥至含水量13%以下，然后將種子進行貯藏，試驗所用種子的千粒重為13. 6g。2、無菌播種
2.I、成熟合子胚消毒
實例I :將采回的種子用清水浸泡I天，以使種皮軟化。再用洗潔精搓洗，洗掉附著在種子上的部分塵土，后用去離子水清洗I次。將種子放置在經(jīng)過消毒的不銹鋼碟子中，置于超凈工作臺上，用新潔爾滅洗凈雙手，手工剝?nèi)シN皮。將去除種皮的成熟合子胚轉至經(jīng)過高壓滅菌的空玻璃瓶中，仍置于超凈工作臺上，用75%乙醇浸泡滅菌10 S，蒸餾水沖洗I次，再用0. 1% HgCl2以振蕩的方式進行滅菌處理4 min,最后用無菌水沖洗3次。實例2 :將采回的種子用清水浸泡I天，以使種皮軟化。再用洗潔精搓洗，洗掉附著在種子上的部分塵土，后用去離子水清洗2次。將種子放置在經(jīng)過消毒的不銹鋼碟子中，置于超凈工作臺上，用新潔爾滅洗凈雙手，手工剝?nèi)シN皮。將去除種皮的成熟合子胚轉至經(jīng)過高壓滅菌的空玻璃瓶中，仍置于超凈工作臺上，用75%乙醇浸泡滅菌10 S，蒸餾水沖洗2次，再用0. 1% HgCl2以振蕩的方式進行滅菌處理5 min,最后用無菌水沖洗4次。實例3 :將采回的種子用清水浸泡I天，以使種皮軟化。再用洗潔精搓洗，洗掉附著在種子上的部分塵土，后用去離子水清洗3次。將種子放置在經(jīng)過消毒的不銹鋼碟子中， 置于超凈工作臺上，用新潔爾滅洗凈雙手，手工剝?nèi)シN皮。將去除種皮的成熟合子胚轉至經(jīng)過高壓滅菌的空玻璃瓶中，仍置于超凈工作臺上，用75%乙醇浸泡滅菌10 S，蒸餾水沖洗3次，再用0. 1% HgCl2以振蕩的方式進行滅菌處理6 min,最后用無菌水沖洗5次。2. 2、成熟合子胚的愈傷誘導培養(yǎng)
實例I :將消毒好的成熟合子胚接種到改良WPM+6-BA1. 0 mg L—1+蔗糖30000 mg-L^1+瓊脂4000 mg*!/1的培養(yǎng)基上進行誘導培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為25±2°C，1000LX，每天光照10 h為宜。培養(yǎng)10 d后，開始有暗黃色愈傷產(chǎn)生，培養(yǎng)30 d后，愈傷團直徑約I I. 5cm，80%的外植體可形成愈傷團。把大塊愈傷團分成小塊轉入繼代增殖培養(yǎng)。實例2 :將消毒好的成熟合子胚接種到改良WPM+6-BA1. 5 mg L—1+蔗糖30000mg*!/1+瓊脂4000 mg*的培養(yǎng)基上進行誘導培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為25±2°C，1250LX,每天光照12 h為宜。培養(yǎng)10 d后，開始有暗黃色愈傷產(chǎn)生，培養(yǎng)30 d后，愈傷團直徑約I 1.5cm，80%的外植體可形成愈傷團。把大塊愈傷團分成小塊轉入繼代增殖培養(yǎng)。實例3 :將消毒好的成熟合子胚接種到改良WPM+6-BA2. 0 mg L—1+蔗糖30000mg*!/1+瓊脂4000 mg*的培養(yǎng)基上進行誘導培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為25±2°C，1500LX,每天光照14 h為宜。培養(yǎng)10 d后，開始有暗黃色愈傷產(chǎn)生，培養(yǎng)30 d后，愈傷團直徑約I 1.5cm，80%的外植體可形成愈傷團。把大塊愈傷團分成小塊轉入繼代增殖培養(yǎng)。所述改良WPM培養(yǎng)基的組成為
KNO3900mg L-1
NH4NO3400 mg L—1
CaCl2. 2H20264 mg L—1
MgSO4. 7H20370 mg L-1
Ca (NO3) 2. 4 H2O556 mg.L-1
KH2PO3270 mg.171
MnSO4. 4 H2O22. 3 mg.L-1
ZnSO4. 7 H2O8. 6 mg.171
FeSO4 7H2027. 8mg*L_1
Na2-EDTA 2H2037. 3mg*L_1
CuSO4. 5 H2O0. 025 mg.L-1
H3BO36. 2 mg*L 1Na2MoO4. 2 H2O0. 25 mg*L 1
KI0. 83 mg.L-1
CoCl2. 6 H2O0. 025 mg.L-1
維生素 BI0. 4 mg*!/1
維生素 B60. 5 mg L_1
煙酸0. 5 mg.171
甘氨酸2. 0 mg L_1
肌醇100 mg*L^102. 3、愈傷增殖培養(yǎng)
實例I :把生長健康，無褐化的大塊愈傷團分成小塊轉入增殖培養(yǎng)。轉接到改良WPM+6-BA0. 5 mg L-I+蔗糖30000 mg-L^1+瓊脂4000 mg-L^1的增殖培養(yǎng)基上，以促進愈傷組織增殖。愈傷組織需及時轉接，否則會出現(xiàn)褐化死亡的現(xiàn)象。愈傷增殖在23°C條件下，約35d轉接一次，培養(yǎng)30 d，愈傷團直徑約I I. 5cm，可分成3塊小愈傷團，即增殖系數(shù)為3。實例2 :把生長健康，無褐化的大塊愈傷團分成小塊轉入增殖培養(yǎng)。轉接到改良WPM+6-BA0. 75mg L-I+蔗糖30000 mg-L^1+瓊脂4000 mg-L^1的增殖培養(yǎng)基上，以促進愈傷組織增殖。愈傷組織需及時轉接，否則會出現(xiàn)褐化死亡的現(xiàn)象。愈傷增殖在24°C條件下，約32d轉接一次，培養(yǎng)30 d，愈傷團直徑約I I. 5cm，可分成4塊小愈傷團，即增殖系數(shù)為4。實例3 :把生長健康，無褐化的大塊愈傷團分成小塊轉入增殖培養(yǎng)。轉接到改良WPM+6-BA1. 0 mg L-I+蔗糖30000 mg-L^1+瓊脂4000 mg-L^1的增殖培養(yǎng)基上，以促進愈傷組織增殖。愈傷組織需及時轉接，否則會出現(xiàn)褐化死亡的現(xiàn)象。愈傷增殖在25°C條件下，約30d轉接一次，培養(yǎng)30 d，愈傷團直徑約I I. 5cm，可分成5塊小愈傷團，即增殖系數(shù)為5。2. 4、芽分化培養(yǎng)
實例I :待愈傷組織數(shù)量較多時，可將部分愈傷組織轉入芽分化培養(yǎng)基改良WPM+e-BAZ.Omg.L-1+蔗糖30000 mg*!/1+瓊脂4000 mg^L'轉入培養(yǎng)約7d，愈傷組織上有綠色芽點產(chǎn)生，培養(yǎng)約15d，可見小葉片抽出，培養(yǎng)約40d，可見I I. 5cm高單芽立于愈傷之上。實例2 :待愈傷組織數(shù)量較多時，可將部分愈傷組織轉入芽分化培養(yǎng)基改良WPM+6-BA2. Omg L ^NAAO. 5 mg L :+ 鹿糖 30000 mg*L :+ 瓊脂 4000 mg*L 1O 轉入培養(yǎng)約7d，愈傷組織上有綠色芽點產(chǎn)生，培養(yǎng)約15d，可見小葉片抽出，培養(yǎng)約40d，可見I I. 5cm高單芽立于愈傷之上。實例3 :待愈傷組織數(shù)量較多時，可將部分愈傷組織轉入芽分化培養(yǎng)基改良WPM+6-BA2. Omg L i+NAAl. 0 mg L 丨+鹿糖 30000 mg*L 丨+瓊脂 4000 mg.L、轉入培養(yǎng)約7d，愈傷組織上有綠色芽點產(chǎn)生，培養(yǎng)約15d，可見小葉片抽出，培養(yǎng)約40d，可見I I. 5cm高單芽立于愈傷之上。2. 5、生根培養(yǎng)
將株高超過1.0 cm的單芽剪下，接種到生根培養(yǎng)基中誘導生根。10 14 d后，芽的基 部開始長出根點，35 d時根長I 3 cm,生根3 4條/株,生根率75%以上。上述生根培養(yǎng)基的組成為
1/2改良WPMIBA0. I I. O mg*L 1
鹿糖20000 mg*!/1
瓊脂粉5000 mg.L—1。權利要求
1. 一種櫸樹無菌播種方法，其特征在于，該方法包括以下步驟1.1外植體的采集、消毒收集櫸樹種子，將采回的種子用清水浸泡I天，再用洗潔精搓洗，然后用去離子水清洗 I 3次，置于超凈工作臺上去種皮，將去除種皮的成熟合子胚用75%乙醇浸泡滅菌10 S， 蒸懼水沖洗I 3次,再用0. 1% HgCl2以振蕩的方式進行滅菌處理4 6 min,用無菌水 沖洗3 5次，1. 2成熟合子胚愈傷誘導、愈傷增殖、芽分化培養(yǎng)、單芽生根培養(yǎng) 將消毒好的成熟合子胚接種到改良WPM+6-BA1.0 2.0 mg L—1+蔗糖30000 mg-L^1+ 瓊脂4000 mg*!/1的培養(yǎng)基上進行誘導培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25±2°C，1000 1500LX，每天光 照10 14 h為宜，30 d后將誘導的大團愈傷組織分割成小團，轉接到改良WPM+6-BA0. 5 1.0 mg L—1+蔗糖30000 mg*!/1+瓊脂4000 mg*!/1的增殖培養(yǎng)基上，以促進愈傷組織的增 殖，愈傷組織增殖到一定數(shù)量后，轉入改良WPM+6-BA2. Omg L^+NAAO I. 0 mg L—1+蔗糖 30000 mg*!/1+瓊脂4000 mg*!/1的分化培養(yǎng)基上，誘導愈傷組織分化出芽，將誘導出的株高I. Ocm以上的單芽剪下，接種到生根培養(yǎng)基1/2改良WPM+ IBA 0. I I. Omg*!/1+ 鹿糖 20000 mg.L-1+ 瓊脂 5000 mg.L-1 中誘導生根，其中，所述改良WPM培養(yǎng)基的組成為KNO3900mg L-1NH4NO3400 mg L—1CaCl2. 2H20264 mg L—1MgSO4. 7H20370 mg L-1Ca (NO3) 2. 4 H2O556 mg L-1KH2PO3270 mg 171MnSO4. 4 H2O22. 3 mg L-1ZnSO4. 7 H2O8. 6 mg 171FeSO4 7H2027. 8mg L-1Na2-EDTA 2H2037. 3mg L-1CuSO4. 5 H2O0. 025 mg L-1H3BO36. 2 mg L-1Na2MoO4. 2 H2O0. 25 mg L-1KI0. 83 mg L-1CoCl2. 6 H2O0. 025 mg L-1維生素 BI0. 4 mg L-1維生素 B60. 5 mg L_1煙酸0. 5 mg.171甘氨酸2. 0 mg L-1肌醇100 mg*L-全文摘要
一種櫸樹無菌播種方法，包括以下步驟外植體采集、消毒；對成熟合子胚的愈傷誘導、愈傷增殖培養(yǎng)、芽分化培養(yǎng)、單芽生根培養(yǎng)。采用本發(fā)明能夠利用萌發(fā)困難的櫸樹成熟合子胚為外植體獲取櫸樹組培生根小苗，增殖系數(shù)達到3～5倍/30天，生根率達75%以上，有效解決了萌芽率低的櫸樹種子繁育再生植株的問題。
文檔編號A01H4/00GK102657089SQ20121014580
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月12日 優(yōu)先權日2012年5月12日
發(fā)明者劉海龍, 吳幼媚, 張日清, 汪靈丹, 王以紅, 蔡玲, 覃子海, 覃玉鳳, 陳曉明, 韋璐陽 申請人:廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學研究院