專利名稱：采用病毒唑脫除馬鈴薯病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種采用病毒抑制劑脫除植物病毒的方法，特別涉及一種采用病毒唑脫除幾種常見的馬鈴薯病毒的方法。
背景技術(shù)：
馬鈴薯栽培分布較廣，是世界上第四大栽培作物。中國則為馬鈴薯栽培面積最大的國家，馬鈴薯在我國的工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位，發(fā)展我國的馬鈴薯種植業(yè)則具有重要的戰(zhàn)略意義。然而，馬鈴薯作為無性繁殖作物，它易感染各種病毒。通過研究發(fā)現(xiàn)，危害馬鈴薯生長發(fā)育的病毒主要有30余種，其中在我國普遍存在而且危害嚴(yán)重的有馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)，馬鈴薯Y病毒(PVY)，馬鈴薯X病毒(PVX)，馬鈴薯A病毒(PVA)，馬鈴薯S 病毒(PVS)，馬鈴薯M病毒(PVM)，馬鈴薯類病毒(PSTVd)等病毒或類病毒。馬鈴薯體內(nèi)病毒的積累可使品系種性退化，品質(zhì)與質(zhì)量降低，對其生長造成嚴(yán)重危害。只有采用現(xiàn)代生物技術(shù)將種薯內(nèi)的病毒去掉，恢復(fù)馬鈴薯品種本身的生理功能和生產(chǎn)特性，才能防止馬鈴薯的退化，使之達(dá)到育種家培育之初品種的商品性狀和產(chǎn)量。目前，常用的馬鈴薯病毒脫除方法包括以下三種(I)物理方法。利用一些物理因素如X射線，紫外線，超短波和高溫或冷凍處理等處理種薯使病毒鈍化，可以達(dá)到脫除病毒獲得脫毒種薯的目的。其中以熱處理鈍化病毒的方法最為有效，在35°C下處理56天，或在36°C處理39天，可以除去某些馬鈴薯品種塊莖中的PLRV。其優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，短時間內(nèi)處理大批種薯。缺點(diǎn)是對大多數(shù)病毒不能根除，有很大的局限性，而且脫毒效果不理想，同時會造成材料干枯或者死亡。(2)莖尖分生組織脫毒技術(shù)。目前應(yīng)用最廣泛而且在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和商業(yè)生產(chǎn)中取得巨大成功的植物脫毒技術(shù)，是生物技術(shù)中的植株莖尖分生組織培養(yǎng)脫毒技術(shù)。根據(jù)脫毒難易的程度可排列為PLRV < PVA < PVY < PAMV < PVM < PVX < PVS < PVTVd0但是該方法操作難度大，技術(shù)含量高。(3)化學(xué)方法。最近研究表明，一些化學(xué)藥劑能有效地脫除正在生長的植物體內(nèi)的病毒，其原理為病毒抑制劑在三磷酸狀態(tài)下會阻止病毒RNA帽子結(jié)構(gòu)形成，從而影響病毒RNA的復(fù)制，干擾病毒的正常生長，達(dá)到除去病毒的目的。目前常見的病毒抑制劑有三氮唑核苷(病毒唑)，5-二氫尿嘧啶(DHT)，雙乙酰-二氫-5-氮尿嘧啶(DA-DHT)等。在實際應(yīng)用中，人們往往將這些藥物直接加到正常植株生長的培養(yǎng)基上，用以預(yù)防病毒感染植物本身。然而，這些病毒抑制劑的加入對植株本身也產(chǎn)生了毒害，即使在非常低的濃度條件下，植株的生長發(fā)育也會受到嚴(yán)重影響。因此，采用病毒抑制劑提前預(yù)防正常植株感染病毒的方法顯得很不科學(xué)。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，發(fā)明人通過綜合研究各種脫毒方法的優(yōu)缺點(diǎn)，提供了一種采用病毒唑脫除馬鈴薯病毒的方法。該方法能有效脫除多種常見的馬鈴薯病毒，且脫毒植株內(nèi)病毒含量長時間不會出現(xiàn)恢復(fù)現(xiàn)象，同時簡單易行，操作方便，可廣泛應(yīng)用于馬鈴薯脫毒后的無毒種植與生產(chǎn)。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種采用病毒唑脫除馬鈴薯病毒的方法，其特征在于將感染病毒的馬鈴薯苗接種于含有病毒唑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)45-135天，且病毒唑在所述培養(yǎng)基中的濃度為75-150mg/ L0優(yōu)選地，所述采用病毒唑脫除馬鈴薯病毒的方法，將感染病毒的馬鈴薯苗接種于含有病毒唑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)90-135天。優(yōu)選地，所述采用病毒唑脫除馬鈴薯病毒的方法，病毒唑在所述培養(yǎng)基中的濃度為 75-100mg/L。優(yōu)選地，所述采用病毒唑脫除馬鈴薯病毒的方法，所述培養(yǎng)基的成分為MS+病毒唑。優(yōu)選地，所述采用病毒唑脫除馬鈴薯病毒的方法，所述的培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度為 50-80mol/m2/s，光照時間為16h/D，培養(yǎng)溫度為20°C。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的病毒選自如下的一種或多種馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)，馬鈴薯Y病毒(PVY)，馬鈴薯X病毒(PVX)，馬鈴薯A病毒(PVA)，馬鈴薯S病毒(PVS)，馬鈴薯 M病毒(PVM)和馬鈴薯類病毒(PSTVd)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明創(chuàng)造性地采用病毒唑脫除馬鈴薯病毒，通過大量試驗摸索出了病毒唑的最佳使用濃度，可以大批量有效脫除幾種常見的馬鈴薯病毒，病毒脫除率高，且脫毒植株內(nèi)病毒含量長時間不會出現(xiàn)恢復(fù)現(xiàn)象，同時簡單易行，操作方便，可廣泛應(yīng)用于馬鈴薯脫毒后的無毒種植與生產(chǎn)。


圖IPVX病毒唑處理135天病毒含量及后期恢復(fù)情況PVX試管苗1、2、3表示經(jīng)病毒唑處理135天及這3棵試管苗第一節(jié)接種到普通MS 培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)3次后的馬鈴薯試管苗。圖2PVM病毒唑處理135天及后期恢復(fù)病毒含量情況PVM試管苗1、2、3表示經(jīng)病毒唑處理135天及這3棵試管苗第一節(jié)接種到普通MS 培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)3次后的馬鈴薯試管苗。圖3PVS病毒唑處理135天及后期恢復(fù)病毒含量情況PVS試管苗1、2、3表示經(jīng)病毒唑處理135天及這3棵試管苗第一節(jié)接種到普通MS 培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)3次后的馬鈴薯試管苗。圖4PLRV病毒唑處理135天及后期恢復(fù)病毒含量情況PLRV試管苗1、2、3表示經(jīng)病毒唑處理135天及這3棵試管苗第一節(jié)接種到普通 MS培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)3次后的馬鈴薯試管苗。圖5PVA病毒唑處理135天及后期恢復(fù)病毒含量情況PVA試管苗1、2、3表示經(jīng)病毒唑處理135天及這3棵試管苗第一節(jié)接種到普通MS 培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)3次后的馬鈴薯試管苗。
具體實施例方式以下是本發(fā)明的具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步作描述，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于這些實施例。凡是不背離本發(fā)明構(gòu)思的改變或等同替代均包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。實施例I病毒唑脫除PVX將感染PVX的馬鈴薯試管苗接種到含一定濃度(0mg/L、75mg/L、100mg/L、150mg/ L、200mg/L)的病毒唑的MS培養(yǎng)基中，在光照強(qiáng)度為50-80mol/m2/S，光照時間為16h/D，培養(yǎng)溫度為20°C的培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，一個培養(yǎng)周期為45天，一周期后將植株頂端接種到下一同濃度培養(yǎng)基中進(jìn)行下一周期的培養(yǎng)，剩下植株部分進(jìn)行ELISA檢測及植株株高、鮮重測定(結(jié)果見表I)。結(jié)果表明單獨(dú)感染PVX的毒源植株在濃度為75mg/L-150mg/L時處理 90天，病毒脫除率可達(dá)到100% (結(jié)果見表6)。表I病毒唑處理侵染PVX的馬鈴薯試管苗不同濃度的株高、鮮重
處理株高平均數(shù)顯著性差異鮮重平均數(shù)顯著性差異(cm)0.05(g)0.050 mg/L8.8208a1.1738a75 mg/L3.8541b1.1125b100 mg/L3.5600b0.0804C150 mg/L2.9000b0.0585C200 mg/L2.2000b0.0530C標(biāo)注表格中a、b、c用來表示各數(shù)據(jù)間的顯著性差異。實施例2病毒唑脫除PVM將復(fù)合侵染MSY的馬鈴薯試管苗接種到含一定濃度(0mg/L、75mg/L、100mg/L、 150mg/L、200mg/L)的病毒唑的MS培養(yǎng)基中，在光照強(qiáng)度為50-80mol/m2/s,光照時間為 16h/D，培養(yǎng)溫度為20°C的培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，一個培養(yǎng)周期為45天，一周期后將植株頂端接種到下一同濃度培養(yǎng)基中進(jìn)行下一周期的培養(yǎng)，剩下植株部分進(jìn)行ELISA檢測及植株株高、鮮重測定(結(jié)果見表2)。對于復(fù)合侵染MSY的馬鈴薯試管苗，處理45天時各濃度對PVM 的脫除率在50% -100%之間，對PVS、PVY的脫除率為0% ;處理90天時，各濃度對PVM的脫除率在50% -100%之間，對PVS的脫除率在40% -67%之間，對PVY的脫除率為0%;處理135天時，各濃度對PVM、PVS的脫除率為100%，對PVY的脫除率為33% (結(jié)果見表7)。表2病毒唑處理復(fù)合侵染YSM的馬鈴薯試管苗不同濃度的株高、鮮重處理株高平均數(shù)顯著性差異鮮重平均數(shù)(g)顯著性差異(cm)0.050.050 mg/L7.6407a0.1533a75 mg/L6.6414a0.1459ab100 mg/L5.4400b0.1110be150 mg/L2.5133C0.0871C200 mg/L1.9625C0.0568C標(biāo)注表格中a、b、c用來表示各數(shù)據(jù)間的顯著性差異。實施例3病毒唑脫除PVS將感染PVS的馬鈴薯試管苗接種到含一定濃度(0mg/L、75mg/L、100mg/L、150mg/ L、200mg/L)的病毒唑的MS培養(yǎng)基中，在光照強(qiáng)度為50-80mol/m2/S，光照時間為16h/D，培養(yǎng)溫度為20°C的培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，一個培養(yǎng)周期為45天，一周期后將植株頂端接種到下一同濃度培養(yǎng)基中進(jìn)行下一周期的培養(yǎng)，剩下植株部分進(jìn)行ELISA檢測及植株株高、鮮重測定(結(jié)果見表3)。結(jié)果表明單獨(dú)侵染處理90天時，其脫除率可達(dá)到75%以上；處理135 天時，各個濃度均可以將PVS完全脫除(結(jié)果見表6)。表3病毒唑處理侵染PVS的馬鈴薯試管苗不同濃度的株高、鮮重
處理株高平均數(shù) (cm)顯著性差異鮮重平均數(shù)(g)顯著性差巳 升0.050.050 mg/L15.3381a0.3385a75 mg/L7.9750a1.1723b100 mg/L5.4046a0.1087C150 mg/L2.9000a0.0916C200 mg/L————————標(biāo)注表格中a、b、c用來表示各數(shù)據(jù)間的顯著性差異。實施例4病毒唑脫除PLRV將感染PLRV的馬鈴薯試管苗接種到含一定濃度(0mg/L、75mg/L、100mg/L、150mg/ L、200mg/L)病毒唑的MS培養(yǎng)基中，在光照強(qiáng)度為50-80mol/m2/s，光照時間為16h/D，培養(yǎng)溫度為20°C的培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，一個培養(yǎng)周期為45天，一周期后將植株頂端接種到下一同濃度培養(yǎng)基中進(jìn)行下一周期的培養(yǎng)，剩下植株部分進(jìn)行ELISA檢測及植株株高、鮮重測定(結(jié)果見表4)。結(jié)果表明單獨(dú)侵染PLRV的毒源植株在處理90天時，濃度為75mg/L， 100mg/L的病毒唑?qū)υ摬《镜牟《久摮蕿?3%，濃度為150mg/L可以完全脫除PLRV ;當(dāng)處理135天時，75mg/L, 100mg/L的病毒唑?qū)LRV的脫除率達(dá)到100% (結(jié)果見表6)。表4病毒唑處理侵染PLRV的馬鈴薯試管苗不同濃度的株高、鮮重
權(quán)利要求
1.采用病毒唑脫除馬鈴薯病毒的方法，其特征在于將感染病毒的馬鈴薯苗接種于含有病毒唑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)45-135天，且病毒唑在所述培養(yǎng)基中的濃度為75-150mg/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于將感染病毒的馬鈴薯苗接種于含有病毒唑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)90-135天。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于病毒唑在所述培養(yǎng)基中的濃度為 75-lOOmg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基的成分為MS+病毒唑。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度為 50-80mol/m2/s，光照時間為16h/D，培養(yǎng)溫度為20°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的方法,其特征在于所述的病毒選自如下的一種或多種PVX、PVY、PVM, PVS, PLRV、PSTVd 和 PVA0
全文摘要
采用病毒唑脫除馬鈴薯病毒的方法，本發(fā)明涉及一種采用病毒抑制劑脫除植物病毒的方法，包括將感染病毒的馬鈴薯苗接種于含有病毒唑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)45-135天，且病毒唑在所述培養(yǎng)基中的濃度為75-150mg/L。本發(fā)明方法簡單易行，操作方便，對常見的幾種馬鈴薯病毒均具有極高的脫除效率，可以在生產(chǎn)過程中使用，便于大批量處理材料，是一種高效的馬鈴薯病毒脫除技術(shù)。
文檔編號A01H4/00GK102599057SQ20121007817
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月22日
發(fā)明者宋波濤, 楊立杰, 柳俊 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)