專利名稱：一種高效的兔眼藍(lán)莓組培快繁方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種高效的兔眼藍(lán)莓組培快繁方法。
背景技術(shù)：
藍(lán)莓(Vacciniumspp.)屬于杜胃$花科(Ericaceae)越桔屬(Vaccinium)多年生落葉或常綠灌木果樹(shù)。藍(lán)莓果實(shí)具有極高的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它水果，常被譽(yù)為“世界漿果之王”;藍(lán)莓果實(shí)具有防止腦神經(jīng)衰老、增強(qiáng)心臟功能、明目抗癌等獨(dú)特功效，被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)確定為人類五大健康食品之一。由于藍(lán)莓獨(dú)特的風(fēng)味和極高的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值，其果實(shí)及產(chǎn)品風(fēng)靡世界，供不應(yīng)求，在國(guó)際市場(chǎng)上售價(jià)昂貴。雖然目前世界藍(lán)莓種植規(guī)模逐年增長(zhǎng)，但目前每年的市場(chǎng)缺口依然達(dá)到40萬(wàn)噸以上， 發(fā)展?jié)摿薮蟆＝鼛啄晡覈?guó)藍(lán)莓種植面積增長(zhǎng)很快，但是根據(jù)世界藍(lán)莓發(fā)展規(guī)律和中國(guó)藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展預(yù)測(cè)，我國(guó)的藍(lán)莓適度種植規(guī)模應(yīng)在2萬(wàn)hm2以上，因此，存在著很大的開(kāi)發(fā)空間。由于藍(lán)莓具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和獨(dú)特的保健功效，發(fā)展勢(shì)頭強(qiáng)勁，常見(jiàn)的繁殖方法如扦插、分根等已難以滿足日益增長(zhǎng)的藍(lán)莓苗木市場(chǎng)需求。為此，國(guó)內(nèi)外進(jìn)行了藍(lán)莓的組織培養(yǎng)快速繁殖研究，已有的研究認(rèn)為藍(lán)莓組織培養(yǎng)以WPM基本培養(yǎng)基為最佳，添加一定濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)玉米素后可獲得較高的藍(lán)莓組織培養(yǎng)增殖系數(shù)；但與蘋(píng)果和草莓等植物的組織培養(yǎng)相比，藍(lán)莓在試管內(nèi)生根較慢，且生根率低。蘋(píng)果和草莓一般在接種后20 天內(nèi)可完成生根過(guò)程，生根率達(dá)95%以上，而藍(lán)莓在1/2WPM添加IBA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)20天后生根率還不到10 %，培養(yǎng)40天后生根率也僅30 % 70 %，有些品種在培養(yǎng)基中培養(yǎng)60 天或更長(zhǎng)時(shí)間后才能在新梢基部生根，或者在培養(yǎng)基的外面長(zhǎng)出氣生根，難以建立高效的藍(lán)莓組織培養(yǎng)快繁體系，從而無(wú)法實(shí)現(xiàn)藍(lán)莓大規(guī)模工廠化生產(chǎn)。2007年11月14日公開(kāi)的申請(qǐng)?zhí)枮?00710024502. 8的發(fā)明創(chuàng)造公開(kāi)了一種兔眼藍(lán)莓組織培養(yǎng)方法，該方法分為誘導(dǎo)、增殖、生根、煉苗四個(gè)階段。其誘導(dǎo)階段的培養(yǎng)基組分為WPM+Zt 10mg/L，增殖階段的培養(yǎng)基組分為WPM+Zt 5mg/L，生根階段的培養(yǎng)基為常規(guī)培養(yǎng)基。該方法提高了兔眼藍(lán)莓莖的誘導(dǎo)和增殖，并提高了成活率。百度文庫(kù)中公開(kāi)了一種越橘使用的改良WPM基質(zhì)組培技術(shù)(http://wenku. baidu. com/view/7f801748c850ad02de804126. html)。其誘導(dǎo)階段的培養(yǎng)基組分為改良 WPM+Zt 2mg/L，增殖階段的培養(yǎng)基組分為改良WPM+Zt lmg/L，生根階段的培養(yǎng)基組分為 改良 WPM+IBA O. lmg/L。改良 WPM 即以 Ca(NO3)2 · 4H20、KNO3> C10H13FeN2NaO8 和鹽酸硫胺素代替原 WPM 培養(yǎng)基中的 K2SO4, CaCl2, FeSO4 和 Na2_EDTA。王大平教授2009年在安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)雜志上發(fā)表了一篇名為《不同因素對(duì)兔眼藍(lán)莓離體培養(yǎng)芽誘導(dǎo)效果的影響》的文章，其得出的結(jié)論是兔眼藍(lán)莓離體培養(yǎng)芽誘導(dǎo)的最佳外植體為莖段，最佳培養(yǎng)基為改良WPM+Zt I 4mg/L，莖段在最佳培養(yǎng)基中的萌芽率為
46.7%。
2008年5月14日公開(kāi)的申請(qǐng)?zhí)枮?00710157193. I的發(fā)明創(chuàng)造公開(kāi)了一種適宜藍(lán)莓試管苗增殖的培養(yǎng)基組合物及其方法，其增殖培養(yǎng)基的組分為WPM+TDZ O. 2 O. 5mg/ L+IBA O. I O. 2mg/L+GA O. lmg/L。同樣 2008年 5 月 14 日公開(kāi)的申請(qǐng)?zhí)枮?200710157194. 6 的發(fā)明創(chuàng)造公開(kāi)了一種適宜藍(lán)莓試管苗生根的培養(yǎng)基組合物及其方法，其生根培養(yǎng)基的組分為:1/2 改良 WPM+IBA O. 03 O. lmg/L。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效的兔眼藍(lán)莓組培快繁方法。本發(fā)明解決所述技術(shù)問(wèn)題的方案是一種高效的兔眼藍(lán)莓組培快繁方法，包括如下幾個(gè)步驟步驟一從健壯兔眼藍(lán)莓植株上獲取帶腋芽的藍(lán)莓莖段外植體，外植體經(jīng)常規(guī)消毒后接種于初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，所述初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良WPM+Zt I. O I. 5mg/L ；步驟二 將初代誘導(dǎo)得到的藍(lán)莓無(wú)菌苗的莖段或莖尖無(wú)菌接種于繼代增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，所述繼代增殖培養(yǎng)基為改良WPM+ZtO. 5 O. 8mg/L ；步驟三將繼代增殖的藍(lán)莓無(wú)菌苗基部在100 500mg/L IBA無(wú)菌溶液中浸5 15s,隨后接種至藍(lán)莓生根培養(yǎng)基中，所述生根培養(yǎng)基為1/2改良WPM+IAA O. I O. 2mg/ L+AC O.5g/L ；步驟四將生根組培苗培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)室移至塑料大棚煉苗4 7d，移栽前開(kāi)蓋鍛煉3 5d，將幼苗移栽入穴盤中的栽培基質(zhì)內(nèi)，覆膜保濕5 7d，其間每天通風(fēng)透氣5 15min兩次，7d后完全揭除塑料薄膜，此后進(jìn)行正常的栽培管理。科研人員在不斷探索著藍(lán)莓的組培快繁方法，正如背景技術(shù)提到的，科研人員的研究方向集中在培養(yǎng)基的配方研究上，通過(guò)改變組培流程中各培養(yǎng)基的配方以期摸索出一種高效的藍(lán)莓組培快繁方法。本發(fā)明使用改良WPM培養(yǎng)基比傳統(tǒng)的WPM基本培養(yǎng)基更有利于藍(lán)莓無(wú)菌苗的誘導(dǎo)、增殖和生長(zhǎng)。而且玉米素(Zt)的濃度較小，由于Zt價(jià)格昂貴，較小濃度的Zt能夠節(jié)約成本。經(jīng)申請(qǐng)人反復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)將繼代增殖的藍(lán)莓無(wú)菌苗基部在100 500mg/L IBA無(wú)菌溶液中浸5 15s后再接種至藍(lán)莓生根培養(yǎng)基中，有利于提高藍(lán)莓無(wú)菌苗的生根率，根數(shù)較多，根系生長(zhǎng)正常，效果優(yōu)于單純?cè)谏囵B(yǎng)基中直接添加IBA或IAA。添加活性炭(AC)可能模擬了植物根系的自然環(huán)境生長(zhǎng)條件，有利于根系的發(fā)育。生根組培苗移至塑料大棚的工藝步驟和參數(shù)，也是申請(qǐng)人反復(fù)摸索而得。與常規(guī)藍(lán)莓組培方法相比，使用該方法可以使兔眼藍(lán)莓試管苗的增殖系數(shù)提高60%，試管苗的瓶?jī)?nèi)生根時(shí)間由90天縮短為30天，生根率由50 %提高到95 %，移栽成活率由40 %上升到95 %，有利于建立快速高效的兔眼藍(lán)莓組培快繁技術(shù)體系。作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，所述步驟一、步驟二、步驟三的培養(yǎng)溫度均為25±2°C，光照強(qiáng)度均為1500 2500Lx，光暗周期比均為12h 12h。穩(wěn)定的環(huán)境條件，更有利于組培苗的生長(zhǎng)。作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，將幼苗移栽入穴盤中的栽培基質(zhì)前，藍(lán)莓幼苗根部用 O. I %多菌靈處理IOs ;揭除塑料薄膜后立即噴施750倍液的普力克。噴施兩種不同的藥劑，有利于提聞移栽成活率。
作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，所述栽培基質(zhì)由草炭蛭石按體積比2 I配制而成。實(shí)驗(yàn)證明草炭與蛭石的組合基質(zhì)有利于兔眼藍(lán)莓組培苗的生長(zhǎng)，效果優(yōu)于草炭與石英砂的組合或草炭與珍珠巖的組合。綜上所述，本發(fā)明不但高效，而且成本較低，有利于規(guī)?；a(chǎn)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I一種高效的兔眼藍(lán)莓組培快繁方法，共分4個(gè)步驟。步驟一從健壯兔眼藍(lán)莓植株上獲取帶腋芽的藍(lán)莓莖段外植體，外植體經(jīng)常規(guī)消毒后接種于初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，所述初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良WPM+Zt 1.0mg/L，培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照強(qiáng)度為1500 2500Lx，光暗周期比為12h 12h;改良WPM即以 Ca (NO3) 2 MH2CKKNO^CiciH13FeN2NaO8 和鹽酸硫胺素代替原 WPM 培養(yǎng)基中的 K2SO4, CaCl2, FeSO4 和Na2-EDTA,其中白糖20g/L,瓊脂5 8g/L，ρΗ5· 2。培養(yǎng)30d后，芽誘導(dǎo)率為90%。步驟二 將初代誘導(dǎo)得到的藍(lán)莓無(wú)菌苗的莖尖或莖段無(wú)菌接種于繼代增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，所述繼代增殖培養(yǎng)基為改良WPM+ZtO. 6mg/L,培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照強(qiáng)度為1500 2500Lx，光暗周期比為12h 12h ;每隔50d繼代增殖一次。下表反映了增殖培養(yǎng)基的配方對(duì)增殖系數(shù)、株高、無(wú)菌苗生長(zhǎng)情況的影響。
增殖培養(yǎng)基增殖系數(shù)株高(cm) 無(wú)菌苗生長(zhǎng)情況
改良 WPM+Zt 0.22.6±0.73.5±1.2較瘦弱
改良 WPM+Zt 0.56.2±1.64.1±1.9健壯良好 改良 WPM+Zt 0.86.3±1.84.0±2.0健壯良好
改良 WPM+Zt 1.56.5±2.03.9±1.7健壯良好
WPM+Zt 0.22.3±0.63.3±1.1較瘦弱
WPM+Zt 0.53.9±1.53.7±1.5健壯良好其中，增殖系數(shù)=培養(yǎng)周期內(nèi)的總芽數(shù)/最初接種的芽或莖段數(shù)。從表中，可以明顯發(fā)現(xiàn)改良WPM+Zt O. 5 O. 8mg/L的配方最合理。步驟三將繼代增殖的藍(lán)莓無(wú)菌苗基部在100mg/L IBA無(wú)菌溶液中浸15s，隨后接種至藍(lán)莓生根培養(yǎng)基中，所述生根培養(yǎng)基為1/2改良WPM+IAA O. lmg/L+AC O. 5g/L，培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照強(qiáng)度為1500 2500Lx，光暗周期比為12h 12h ;IBA無(wú)菌溶液的配置方法為將IBA溶于少量95%乙醇中，再加水至一定濃度，定容后將IBA溶液進(jìn)行過(guò)濾滅菌。培養(yǎng)30d后，試管苗即可長(zhǎng)出數(shù)條根系，生根率達(dá)96%。下表反映了生根培養(yǎng)基的配方和是否經(jīng)過(guò)IBA無(wú)菌溶液處理對(duì)生根率和根系生
長(zhǎng)情況的影響。
權(quán)利要求
1.一種高效的兔眼藍(lán)莓組培快繁方法，其特征在于包括如下幾個(gè)步驟步驟一從健壯兔眼藍(lán)莓植株上獲取帶腋芽的藍(lán)莓莖段外植體，外植體經(jīng)常規(guī)消毒后接種于初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，所述初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良WPM+Zt I. O I. 5mg/L ；步驟二 將初代誘導(dǎo)得到的藍(lán)莓無(wú)菌苗的莖段或莖尖無(wú)菌接種于繼代增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，所述繼代增殖培養(yǎng)基為改良WPM+ZtO. 5 O. 8mg/L ；步驟三將繼代增殖的藍(lán)莓無(wú)菌苗基部在100 500mg/L IBA無(wú)菌溶液中浸5 15s， 隨后接種至藍(lán)莓生根培養(yǎng)基中，所述生根培養(yǎng)基為1/2改良WPM+IAA O. I O. 2mg/L+AC O. 5g/L ；步驟四將生根組培苗培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)室移至塑料大棚煉苗4 7d,移栽前開(kāi)蓋鍛煉3 5d，將幼苗移栽入穴盤中的栽培基質(zhì)內(nèi)，覆膜保濕5 7d，其間每天通風(fēng)透氣5 15min 兩次，7d后完全揭除塑料薄膜，此后進(jìn)行正常的栽培管理。
2.如權(quán)利要求I所述的一種高效的兔眼藍(lán)莓組培快繁方法，其特征在于所述步驟一、 步驟二、步驟三的培養(yǎng)溫度均為25±2°C，光照強(qiáng)度均為1500 2500Lx，光暗周期比均為 12h 12h。
3.如權(quán)利要求I或2所述的一種高效的兔眼藍(lán)莓組培快繁方法，其特征在于將幼苗移栽入穴盤中的栽培基質(zhì)前，藍(lán)莓幼苗根部用O. 1%多菌靈處理IOs ;揭除塑料薄膜后立即噴施750倍液的普力克。
4.如權(quán)利要求I所述的一種高效的兔眼藍(lán)莓組培快繁方法，其特征在于所述栽培基質(zhì)由草炭蛭石按體積比2 I配制而成。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種高效的兔眼藍(lán)莓組培快繁方法。該方法的初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良WPM+Zt 1.0～1.5mg/L，繼代增殖培養(yǎng)基為改良WPM+Zt 0.5～0.8mg/L，生根培養(yǎng)基為1/2改良WPM+IAA 0.1～0.2mg/L+AC 0.5g/L；將繼代增殖的藍(lán)莓無(wú)菌苗基部在100～500mg/L IBA無(wú)菌溶液中浸5～15s后接種至藍(lán)莓生根培養(yǎng)基中，生根完成后將生根組培苗培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)室移至塑料大棚煉苗4～7d，移栽前開(kāi)蓋鍛煉3～5d，將幼苗移栽入穴盤中的栽培基質(zhì)內(nèi)，覆膜保濕5～7d，其間每天通風(fēng)透氣5～15min兩次，7d后完全揭除塑料薄膜。本發(fā)明不但高效，而且成本較低，有利于規(guī)模化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102577967SQ20121005447
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月2日
發(fā)明者孫慶俊, 張海洋, 陳建中 申請(qǐng)人:湖州師范學(xué)院