專利名稱：一種抑制煙草愈傷組織繼代培養(yǎng)中褐化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種抑制煙草愈傷組織繼代培養(yǎng)中褐化的方法。適用于煙草等茄科植物愈傷組織繼代培養(yǎng)中褐化現(xiàn)象的抑制。
背景技術(shù)：
煙草是茄科煙草屬的一年生草本植物，本屬約有60種。原產(chǎn)于美洲和大洋洲，中國栽培4種煙草、黃花煙草、光煙草和花煙草，其中煙草種植面積最大。煙草具有藥用、工業(yè)用、保腱美容等價(jià)值，其中卷煙是煙草的主要產(chǎn)品，從煙葉中提取的蛋白質(zhì)其營養(yǎng)價(jià)值高于任何奶類的蛋白質(zhì)，而煙堿有殺菌止血的功能，是醫(yī)院必備的藥品。在中國煙葉和卷煙的銷量很大，是國家的高積累、高稅率商品，在國民經(jīng)濟(jì)中占有重要的地位。此外，煙草作為植物組織培養(yǎng)的“模式植物”之一，在植物細(xì)胞工程的研究中占有重要地位。有關(guān)煙草組織和細(xì)胞培養(yǎng)有不少研究和報(bào)道。褐變這一在許多木本植物組培中常見的現(xiàn)象，也是煙草組織培養(yǎng)的一大障礙。褐變是指外植體在培養(yǎng)過程中，自身組織從表面培養(yǎng)基釋放褐色物質(zhì)，以致培養(yǎng)基逐漸變成褐色，外植體也隨之進(jìn)一步變褐而死亡的現(xiàn)象。為了提高組織培養(yǎng)的成功率及維持愈傷組織較高的新陳代謝活性，必須對褐變現(xiàn)象加以嚴(yán)格控制。目前，國內(nèi)外針對煙草組織培養(yǎng)過程中褐變現(xiàn)象的發(fā)生及引起褐變的因素有一定研究和報(bào)道。煙草細(xì)胞繼代培養(yǎng)過程中的褐化誘因可歸結(jié)為兩大因素1.材料的遺傳基礎(chǔ)及生長發(fā)育等內(nèi)在因子；2.培養(yǎng)方式及條件等外部因子。盡管引起煙草愈傷組織繼代培養(yǎng)中褐變的因素很多，但如下這一點(diǎn)是清楚的選擇適宜的培養(yǎng)基，再配合使用一些抗氧化劑，調(diào)節(jié)外源激素的種類與含量，在適宜的溫度及黑暗中培養(yǎng)，方能使愈傷組織處于旺盛生長狀態(tài)，且能夠有效地控制褐變。我們研究發(fā)現(xiàn)，固體培養(yǎng)基的凝固情況對愈傷材料生長的影響較大。如果培養(yǎng)基偏軟，植物愈傷材料會因沉入培養(yǎng)基中造成缺氧，胞內(nèi)多酚氧化酶被激活，細(xì)胞里的酚類物質(zhì)氧化成棕褐色的醌類物質(zhì)，這種致死性的褐化物向外擴(kuò)散致使培養(yǎng)基逐漸變成褐色，最終愈傷組織生長不好，直至死亡。如果培養(yǎng)基偏硬，則植物材料吸收水分和養(yǎng)分困難，同樣生長不好。培養(yǎng)基的凝固狀況(體現(xiàn)為軟硬度)與瓊脂用量和培養(yǎng)基的PH值有關(guān)。在實(shí)際操作過程中，培養(yǎng)基的pH值都是在滅菌前調(diào)至預(yù)定值的，但高溫滅菌后由于培養(yǎng)基營養(yǎng)成分發(fā)生化學(xué)變化，會導(dǎo)致培養(yǎng)基的PH值也隨之改變，這是造成高溫滅菌后固體培養(yǎng)基凝固不好、甚至不凝固的主要原因之一。調(diào)高培養(yǎng)基PH值或增加瓊脂用量均可改善培養(yǎng)基的凝固效果。因此在配制培養(yǎng)基時(shí)瓊脂的用量、培養(yǎng)基滅菌前PH值的設(shè)定以及滅菌時(shí)如何控制培養(yǎng)基成分的有效性及各營養(yǎng)成分的順序都是抑制煙草愈傷組織繼代培養(yǎng)褐化的關(guān)鍵。另外，向培養(yǎng)基中加入適量吸附劑聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)，以吸收愈傷組織生長過程中產(chǎn)生的有毒物質(zhì)也是抑制煙草愈傷組織繼代過程中褐化的一個新思路。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種抑制煙草愈傷組織繼代培養(yǎng)過程中褐化的方法。方法簡單易行，操作方便，有效抑制了煙草愈傷組織繼代過程中的褐變，效果好，煙草愈傷組織增殖率可達(dá)11.29(倍)；另外，該發(fā)明為煙草愈傷組織懸浮培養(yǎng)提供了優(yōu)良的細(xì)胞種源。該方法培養(yǎng)的煙草愈傷組織松軟，為獲得分散均勻的懸浮細(xì)胞系提供了良好的條件。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)措施一種抑制煙草愈傷組織繼代培養(yǎng)過程中褐化的方法，其步驟是A :配制KCMS培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的成分組成及工作濃度如下大量元素為硝酸銨(NH4NO3) I. 65g/L、硝酸鉀(KNO3) I. 9g/L、二水合氯化鈣(CaCl2 · 2H20) O. 44g/L、 七水合硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) O. 37g/L、磷酸二氫鉀(KH2PO4) O. 17g/L ;微量元素碘化鉀(KI) O. 83mg/L、硼酸(H3BO3) 6. 2mg/L、四水合硫酸錳(MnSO4 · 4H20) 22. 3mg/L、七水合硫酸鋅(ZnSO4 · 7H20) 8. 6mg/L、二水合錳酸鈉(Na2MnO4 · 2H20) O. 25mg/L、五水合硫酸銅 (CuSO4 · 5H20) O. 025mg/L、六水合氯化鈷(COCl2 · 6H20) O. 025mg/L ;鐵鹽七水合硫酸亞鐵 (FeSO4 ·7Η20) 27. 8mg/L、二水合乙二胺四乙酸二鈉(Na2-EDTA ·2Η20) 37. 3mg/L ;肌醇 O. 5mg/ L ;維生素B1L 3mg/L ;2，4-二氯苯氧乙酸(2，4_D)0. 2mg/L、激動素(KT)O. lmg/L ;聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)O. 5g/L ;磷酸二氫鉀(KH2PO4) 200mg/L ;瓊脂8_10g/L ;蔗糖30g/L。滅菌前將培養(yǎng)基PH調(diào)節(jié)至5. 6-6。B =KCMS培養(yǎng)基滅菌將A步驟中所述KCMS培養(yǎng)基成分分成三部分獨(dú)立滅菌。 三部分分別為鐵鹽(七水合硫酸鐵(FeSO4 · 7H20) 27. 8mg/L、二水合乙二胺四乙酸二鈉 (Na2-EDTA · 2H20) 37. 3mg/L)、微量元素(碘化鉀(KI) O. 83mg/L、硼酸(H3BO3) 6. 2mg/L、 四水合硫酸錳(MnSO4 · 4H20) 22. 3mg/L、七水合硫酸鋅(ZnSO4 · 7H20) 8. 6mg/L、二水合錳酸鈉(Na2MnO4 · 2H20) O. 25mg/L、五水合硫酸銅(CuSO4 · 5H20)0. 025mg/L、六水合氯化鈷 (CoCl2 · 6H20)O. 025mg/L)和KCMS培養(yǎng)基其他營養(yǎng)成分(大量元素、肌醇、維生素B1^, 4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、激動素(KT)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、 瓊脂和蔗糖)。以上三部分KCMS培養(yǎng)基營養(yǎng)成分分別進(jìn)行濕熱滅菌。鐵鹽部分滅菌條件為121. 30C 30min，微量元素部分滅菌條件為121. 3°C 30min, KCMS培養(yǎng)基其他營養(yǎng)成分部分滅菌條件為121. 30C 20min。滅菌完成后待以上三部分KCMS培養(yǎng)基營養(yǎng)成分均冷卻至 50-60°C，在無菌操作臺上將它們混合均勻，并分裝至IOOmL錐形瓶(錐形瓶提前121. 3°C滅菌30min)，每瓶分裝20mL KCMS培養(yǎng)基。C :待B步驟中IOOmL三角瓶內(nèi)KCMS培養(yǎng)基自然冷卻至室溫(20_25°C，以下相同) 并黑暗水平擱置2-3天后，可將煙草愈傷組織轉(zhuǎn)移到凝固好的KCMS培養(yǎng)基表面，放置在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為22-26h黑暗，培養(yǎng)箱溫度24-26°C，培養(yǎng)箱濕度18% ~20%o 20-24天繼代一次。此方法下培養(yǎng)的煙草愈傷組織生長分裂旺盛，增殖率可達(dá)11. 29 (倍)。 全過程中培養(yǎng)基始終維持亮黃色，表明煙草愈傷組織向培養(yǎng)基中分泌的有毒褐化物質(zhì)少， 褐化現(xiàn)象得到明顯的抑制；此外，新分裂形成的煙草愈傷組織為乳白色且松軟，利于進(jìn)行下一代轉(zhuǎn)接。本發(fā)明具有如下的優(yōu)點(diǎn)和效果I.有關(guān)本發(fā)明的效果請見下表材料顏色材料狀態(tài)材料褐化懸浮培養(yǎng)增殖率 (增重倍數(shù))培養(yǎng)基狀態(tài)本方法乳白- 淺黃松軟輕，繼代 26天出現(xiàn)褐化懸浮細(xì)胞分散均勻，顆粒細(xì)小11.29亮黃色，彈性適中常規(guī)方法黃-白緊實(shí)重，繼代 10-12天出現(xiàn)褐化懸浮細(xì)胞成團(tuán)5.64白色，較堅(jiān)硬2.本發(fā)明無需增加專用設(shè)備，操作方便，有效抑制了煙草愈傷組織繼代過程中的褐化，則大大保證了煙草愈傷組織培養(yǎng)的成功率；同時(shí)該方法也促進(jìn)了煙草愈傷組織的快速生長。3.本發(fā)明中獲得的煙草愈傷組織松軟，可為液體懸浮培養(yǎng)模式提供優(yōu)良的細(xì)胞種源。主要體現(xiàn)在本方法下獲得的煙草愈傷組織經(jīng)過液體懸浮培養(yǎng)時(shí)能分散均勻，不黏粘成團(tuán)；并且僅5-8個煙草細(xì)胞構(gòu)成I個顆粒，故顆粒細(xì)小。這樣不僅保證了煙草細(xì)胞與培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的有效接觸，也保證了煙草細(xì)胞生長的同步性。因此，無論是作為科研材料還是用于工廠化大規(guī)模培養(yǎng)以提取煙堿等的煙草細(xì)胞種源，都是最佳選擇。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :下面對本發(fā)明的實(shí)施例作進(jìn)一步詳細(xì)描述一種抑制煙草愈傷組織繼代過程中褐化的方法，它采用如下步驟步驟一以煙草種子播種后萌發(fā)出的子葉為外植體，用體積比為75%的酒精浸泡 20或24或26或28或30s后，再用質(zhì)量體積比為O. I %的氯化汞消毒6或7分鐘，用無菌水沖洗8或9或10次。步驟二 配制MS固體培養(yǎng)基(大量元素硝酸銨(NH4NO3) I. 65g/L、硝酸鉀 (KNO3) I. 9g/L、二水合氯化鈣(CaCl2 · 2H20) O. 44g/L、七水合硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) O. 37g/ L、磷酸二氫鉀(KH2PO4)O. 17g/L ;微量元素碘化鉀(KI)O. 83mg/L、硼酸(H3BO3) 6. 2mg/L、 四水合硫酸錳(MnSO4 · 4H20) 22. 3mg/L、七水合硫酸鋅(ZnSO4 · 7H20) 8. 6mg/L、二水合錳酸鈉(Na2MnO4 · 2H20) O. 25mg/L、五水合硫酸銅(CuSO4 · 5H20)0. 025mg/L、六水合氯化鈷 (CoCl2 · 6H20) O. 025mg/L ;鐵鹽七水合硫酸亞鐵(FeSO4 · 7H20) 27. 8mg/L、二水合乙二胺四乙酸二鈉(Na2-EDTA · 2H20) 37. 3mg/L ;有機(jī)物質(zhì)肌醇O. lg/L、煙酸O. 5mg/L、維生素 B6O. 5mg/L、維生素B1O. lmg/L、甘氨酸2. Omg/L ;鹿糖30g/L ;瓊脂7g/L)。將MS培養(yǎng)基濕熱滅菌(121. 3°C，滅菌20min)并冷卻至室溫后，將步驟一中消毒好的煙草種子轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。步驟三此過程在無菌條件下完成取步驟二中生長20d后的煙草子葉切成Imm 左右，在以下培養(yǎng)基中誘導(dǎo)煙草愈傷組織大量元素硝酸銨(NH4NO3) I. 65g/L、硝酸鉀 (KNO3) I. 9g/L、二水合氯化鈣(CaCl2 · 2H20) O. 44g/L、七水合硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) O. 37g/ L、磷酸二氫鉀(KH2PO4)O. 17g/L ;微量元素碘化鉀(KI)O. 83mg/L、硼酸(H3BO3) 6. 2mg/L、
5四水合硫酸錳(MnSO4 · 4H20) 22. 3mg/L、七水合硫酸鋅(ZnSO4 · 7H20) 8. 6mg/L、二水合錳酸鈉(Na2MnO4 · 2H20) O. 25mg/L、五水合硫酸銅(CuSO4 · 5H20)0. 025mg/L、六水合氯化鈷 (CoCl2 · 6H20) O. 025mg/L ;鐵鹽七水合硫酸亞鐵(FeSO4 · 7H20) 27. 8mg/L、二水合乙二胺四乙酸二鈉(Na2-EDTA · 2H20) 37. 3mg/L ;有機(jī)物質(zhì)肌醇O. lg/L、煙酸O. 5mg/L、維生素 B6O. 5mg/L、維生素 B1O. lmg/L、甘氨酸 2. Omg/L ;激素:2,4-二氯苯氧乙酸(2,4_D)0. 5mg/L、 激動素(KT)0.05mg/L ;葡萄糖2% (質(zhì)量體積比)；瓊脂7g/L。本步驟中培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)到5. 6，培養(yǎng)條件為25 °C，14小時(shí)光照，光強(qiáng)40 μ E · m_2 · s'步驟四配制KCMS培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的成分組成及工作濃度如下大量元素 硝酸銨(NH4NO3) I. 65g/L、硝酸鉀(KNO3) I. 9g/L、二水合氯化鈣(CaCl2 · 2H20) O. 44g/L、 七水合硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) O. 37g/L、磷酸二氫鉀(KH2PO4) O. 17g/L ;微量元素碘化鉀(KI) O. 83mg/L、硼酸(H3BO3) 6. 2mg/L、四水合硫酸錳(MnSO4 · 4H20) 22. 3mg/L、七水合硫酸鋅(ZnSO4 · 7H20) 8. 6mg/L、二水合錳酸鈉(Na2MnO4 · 2H20) O. 25mg/L、五水合硫酸銅 (CuSO4 · 5H20) O. 025mg/L、六水合氯化鈷(CoCl2 · 6H20) O. 025mg/L ;鐵鹽七水合硫酸亞鐵 (FeSO4 ·7Η20) 27. 8mg/L、二水合乙二胺四乙酸二鈉(Na2-EDTA ·2Η20) 37. 3mg/L ;肌醇 O. 5mg/ L ;維生素B1L 3mg/L ;2，4-二氯苯氧乙酸(2，4_D)0. 2mg/L、激動素(KT)O. lmg/L ;聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)O. 5g/L ;磷酸二氫鉀(KH2PO4) 200mg/L ;瓊脂8_10g/L ;蔗糖30g/L。滅菌前將培養(yǎng)基pH調(diào)節(jié)至5.8。步驟五KCMS培養(yǎng)基滅菌。將步驟四中所述KCMS培養(yǎng)基成分分成三部分獨(dú)立滅菌。三部分分別為鐵鹽(七水合硫酸鐵(FeSO4 · 7H20) 27. 8mg/L、二水合乙二胺四乙酸二鈉(Na2-EDTA · 2H20) 37. 3mg/L)、微量元素(碘化鉀(KI)O. 83mg/L、硼酸(H3BO3) 6. 2mg/ L、四水合硫酸錳(MnSO4 · 4H20) 22. 3mg/L、七水合硫酸鋅(ZnSO4 · 7H20) 8. 6mg/L、二水合錳酸鈉(Na2MnO4 · 2H20) O. 25mg/L、五水合硫酸銅(CuSO4 · 5H20) O. 025mg/L、六水合氯化鈷 (CoCl2 ·6Η20)0. 025mg/L)和KCMS培養(yǎng)基其他營養(yǎng)成分(大量元素、肌醇、維生素&、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、激動素(KT)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、瓊脂和蔗糖-各成分工作濃度請見步驟四)。以上三部分KCMS培養(yǎng)基營養(yǎng)成分分別進(jìn)行濕熱滅菌。鐵鹽部分滅菌條件為121. 3 °C 30min，微量元素部分滅菌條件為121. 3 °C 30min，KCMS培養(yǎng)基其他營養(yǎng)成分部分滅菌條件為121. 30C 20min。滅菌完成待以上三部分KCMS培養(yǎng)基營養(yǎng)成分均冷卻至50或52或54或56或58或60°C后在無菌操作臺上將它們混合均勻，并分裝至IOOmL三角瓶，每瓶分裝20mL KCMS培養(yǎng)基。步驟六待步驟五中IOOmL三角瓶內(nèi)KCMS培養(yǎng)基自然冷卻至室溫并黑暗水平擱置 2或4天后，將步驟三中誘導(dǎo)形成的煙草愈傷組織轉(zhuǎn)移到凝固好的KCMS培養(yǎng)基表面，放置在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為24h黑暗，培養(yǎng)箱溫度25°C，培養(yǎng)箱濕度18% -20%, 20 或21或22或23或24天繼代一次。實(shí)驗(yàn)例經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，常規(guī)方法誘導(dǎo)出的煙草愈傷組織增殖過程中的褐化率為52. 4%，本方法中的煙草愈傷組織的褐變率為12. 1%。
權(quán)利要求
1 .一種抑制煙草愈傷組織繼代培養(yǎng)過程中褐化的方法，其步驟是A :配制KCMS培養(yǎng)基培養(yǎng)基的成分組成及工作濃度如下大量元素為硝酸銨I. 65g/ L、硝酸鉀I. 9 g/L、二水合氯化鈣O. 44 g/L、七水合硫酸鎂O. 37 g/L、磷酸二氫鉀0.17 g/ L ;微量元素碘化鉀O. 83 mg/L、硼酸6. 2 mg/L、四水合硫酸錳22. 3 mg/L、七水合硫酸鋅 8.6 mg/L、二水合錳酸鈉O. 25 mg/L、五水合硫酸銅O. 025 mg/L、六水合氯化鈷O. 025 mg/ L ;鐵鹽七水合硫酸亞鐵27. 8 mg/L、二水合乙二胺四乙酸二鈉37. 3 mg/L ;肌醇O. 5 mg/L ； 維生素B1 I. 3 mg/L ;激素2，4-二氯苯氧乙酸O. 2mg/L、激動素O. I mg/L ;聚乙烯基卩比咯燒酮O. 5g/L ;磷酸二氫鉀200 mg/L ;瓊脂8_10g/L ;蔗糖30g/L ;滅菌前將培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)至5.6~6 ；B =KCMS培養(yǎng)基滅菌將A步驟中所述KCMS培養(yǎng)基成分分成三部分滅菌，三部分分別為鐵鹽七水合硫酸鐵27. 8 mg/L、二水合乙二胺四乙酸二鈉37. 3 mg/L ;微量元素碘化鉀O.83 mg/L、硼酸6. 2 mg/L、四水合硫酸錳22. 3 mg/L、七水合硫酸鋅8. 6 mg/L、二水合錳酸鈉O. 25 mg/L、五水合硫酸銅O. 025 mg/L、六水合氯化鈷O. 025 mg/L和KCMS培養(yǎng)基其他營養(yǎng)成分大量元素、肌醇、維生素氏、2，4-二氯苯氧乙酸、激動素、聚乙烯基吡咯烷酮、磷酸二氫鉀、瓊脂和蔗糖，以上三部分KCMS培養(yǎng)基營養(yǎng)成分分別進(jìn)行濕熱滅菌，鐵鹽部分滅菌條件為121. 30C 30min，微量元素部分滅菌條件為121. 3°C 30min, KCMS培養(yǎng)基其他營養(yǎng)成分部分滅菌條件為121. 3°C 20min，滅菌完成后以上三部分KCMS培養(yǎng)基營養(yǎng)成分均冷卻至 50-60°C，在無菌操作臺上混合均勻，并分裝至100 mL三角瓶，每瓶分裝20 mL KCMS培養(yǎng)C :待B步驟中100 mL三角瓶內(nèi)KCMS培養(yǎng)基自然冷卻至室溫，并黑暗水平擱置2_3天后，將煙草愈傷組織轉(zhuǎn)移到凝固好的KCMS培養(yǎng)基表面,放置在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)條件為22-26h黑暗，培養(yǎng)箱溫度24-26°C，培養(yǎng)箱濕度18%_20%，20-24天繼代一次。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑制煙草愈傷組織繼代過程中褐化的方法，其步驟A、選取煙草種子萌發(fā)出的子葉為組織培養(yǎng)的外植體；B、通過平衡滅菌前培養(yǎng)基pH值和瓊脂含量使培養(yǎng)基達(dá)到適合愈傷組織生長的最佳凝固效果；C、鐵鹽與微量元素分開滅菌；D、在培養(yǎng)基中加入0.5g/LPVP，并使培養(yǎng)箱濕度控制在18%-20%。該方法簡單易行，操作方便，有效抑制了煙草愈傷組織繼代過程中的褐變，效果好，煙草愈傷組織增殖系數(shù)可達(dá)到11.29(倍)；另外，該發(fā)明為煙草愈傷組織懸浮培養(yǎng)提供了優(yōu)良的細(xì)胞種源。該方法培養(yǎng)的煙草愈傷組織松軟，為獲得分散均勻的懸浮細(xì)胞系提供了良好的條件。
文檔編號A01H4/00GK102577953SQ20121003096
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月13日
發(fā)明者劉永定, 尹黎燕, 畢永紅, 胡征宇, 黃文敏 申請人:中國科學(xué)院水生生物研究所