專(zhuān)利名稱(chēng)：一種培育大葉藻無(wú)菌苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及大葉藻的培育方法，尤其涉及大葉藻無(wú)菌苗的培育方法。
現(xiàn)有技術(shù)大葉藻(Zostera marina L.)是一種營(yíng)沉水生活的海洋高等植物，俗稱(chēng)海帶草，屬于被子植物門(mén)(Angiospermae),單子葉植物綱(Monocotyledoneae,或稱(chēng)百合綱 Liliopsida),澤 寫(xiě)目(Alismales),眼子菜科(Potamogetonaceae),大葉藻屬(Zostera L.)，多年生草本，廣泛分布在近海生態(tài)系統(tǒng)中，在海洋生態(tài)環(huán)境保護(hù)中起著重要的作用。近年來(lái)對(duì)大葉藻的生物特性，種子萌發(fā)等各方面的研究也逐漸成為熱點(diǎn)之一。若能快速地培養(yǎng)大葉藻無(wú)菌苗，可為后期進(jìn)行大葉藻的組織培養(yǎng)等深入研究工作奠定基礎(chǔ)。因?yàn)榇笕~藻的種子在不適的生活環(huán)境中會(huì)發(fā)生休眠，而且休眠時(shí)間有的可長(zhǎng)達(dá)一年，使得種子的萌發(fā)時(shí)間不一致。目前的技術(shù)主要是通過(guò)低溫保存種子，打破種子的休眠狀態(tài)，再進(jìn)行無(wú)菌處理，然后用專(zhuān)門(mén)的培養(yǎng)基進(jìn)行無(wú)菌苗的培養(yǎng)。因低溫處理種子需要一個(gè)月或更長(zhǎng)的時(shí)間，過(guò)程緩慢，而且要頻繁地更換培養(yǎng)基，增加成本的同時(shí)也增加了工作量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種快速高效和低成本的培育大葉藻無(wú)菌苗的方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種培育大葉藻無(wú)菌苗的方法，其步驟是(I)選取形態(tài)飽滿完整的大葉藻種子，用滅菌天然海水涮洗2次，用吸水紙吸干， 移至無(wú)菌室超凈工作臺(tái)上；(2)在無(wú)菌室超凈工作臺(tái)上用濃度為75%乙醇溶液浸泡10分鐘，再用滅菌天然海水涮洗2次,用吸水紙吸干；(3)再將大葉藻種子移至濃度為I. 5%的碘化鉀溶液中浸泡20分鐘，再用滅菌海水涮洗2次,用吸水紙吸干；(4)將步驟(3)消毒處理好的大葉藻種子接種到鹽度為5%。的滅菌海水中，并放入恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)，在溫度15°C，濕度60%，光照強(qiáng)度40μπιΟ1 ·πΓ2: D = 12 : 12 條件下培養(yǎng)7 14天，其中L D = 12 12為光照時(shí)間比黑暗時(shí)間，即光照12小時(shí)，黑暗12小時(shí)，模擬晝夜切換；(5)萌發(fā)后的大葉藻種子轉(zhuǎn)接到正常鹽度的滅菌海水中，在溫度保持15°C，濕度 60%,光照強(qiáng)度40 μ mol · m_2 · s_\ L D = 12 12條件下再培養(yǎng)7 14天。在上述步驟(I)、步驟(2)、步驟(3)和步驟(5)所述滅菌天然海水為先將天然海水煮沸5分鐘，然后冷卻到室溫后再使用過(guò)濾器進(jìn)行抽濾。在上述步驟(2)中，所述濃度為75%乙醇溶液是無(wú)水乙醇和純水配制而成。在上述步驟(3)所述濃度為I. 5%的碘化鉀溶液是用天然海水和碘化鉀配置而
3成，并抽濾除菌。在上述步驟(4)中，在所述鹽度為5%。的滅菌海水是用人工海水素和純水配制而成，并抽濾除菌。本發(fā)明的技術(shù)效果是本發(fā)明是先將大葉藻種子進(jìn)行消毒處理后，用低鹽度滅菌海水促大葉藻種子萌發(fā)，然后再用正常鹽度的滅菌海水來(lái)培養(yǎng)萌發(fā)的大葉藻種子，使大葉藻種子無(wú)菌苗培育迅速而簡(jiǎn)便，而且成本低。本發(fā)明能夠快速地打破大葉藻種子的休眠，使大葉藻種子快速進(jìn)入萌發(fā)生長(zhǎng)階段，低鹽度滅菌海水促大葉藻種子萌發(fā)耗時(shí)短，效率高，后期培養(yǎng)過(guò)程只需用正常鹽度的滅菌海水即可，不需用額外的培養(yǎng)基和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，節(jié)約成本，操作簡(jiǎn)便。經(jīng)實(shí)驗(yàn)對(duì)比，本發(fā)明大葉藻種子在鹽度為5%。的海水促萌發(fā)效果最好。本發(fā)明是在無(wú)菌環(huán)境下促進(jìn)大葉藻萌發(fā)成長(zhǎng)為苗，此處長(zhǎng)成的大葉藻苗為無(wú)菌苗，可直接用于后續(xù)的原生質(zhì)體分離和組織培養(yǎng)，能夠滿足實(shí)驗(yàn)室中要求的無(wú)菌組織培養(yǎng)、原生質(zhì)體制備和遺傳轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)。


圖I為消毒后的大葉藻種子的照片。圖2為大葉藻種子接種在5%。鹽度海水中培養(yǎng)3天的照片。圖3為大葉藻種子接種在5%。鹽度海水中培養(yǎng)10天的照片。圖4為大葉藻種子接種在正常鹽度天然海水中培養(yǎng)14天的照片。圖5為大葉藻種子一直在正常鹽度天然海水中培養(yǎng)30天仍未萌發(fā)的照片。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明對(duì)大葉藻種子無(wú)菌苗的培養(yǎng)分為無(wú)菌消毒處理，低鹽度滅菌海水促種子萌發(fā)，正常鹽度滅菌海水培養(yǎng)三步驟進(jìn)行，具體步驟如下(I)選取形態(tài)飽滿完整的大葉藻種子，一般選擇形狀完整，質(zhì)地堅(jiān)硬，顆粒飽滿，成熟并具有活力的大葉藻種子，用滅菌天然海水涮洗2次，即將大葉藻種子放入裝有滅菌天然海水的培養(yǎng)皿中，用鑷子夾住種子，在滅菌天然海水中涮洗，依次涮洗2次，直到?jīng)]有明顯的附著物和雜質(zhì)即可，滅菌天然海水的水溫一般保持常溫即可。涮洗后的大葉藻種子用吸水紙吸干，并移至無(wú)菌室的無(wú)菌操作臺(tái)上。本實(shí)施例滅菌天然海水為無(wú)菌抽濾海水在抽濾前，先將天然海水煮沸5分鐘， 然后冷卻到室溫后再使用過(guò)濾器進(jìn)行抽濾。本實(shí)施例過(guò)濾器采用上海領(lǐng)德儀器有限公司生產(chǎn)的I升規(guī)格的不銹鋼圓筒式正壓過(guò)濾器，抽濾前將過(guò)濾器出水口和正壓口用牛皮紙包扎好，并準(zhǔn)備4個(gè)250毫升規(guī)格的藍(lán)蓋血清瓶，每個(gè)藍(lán)蓋血清瓶瓶口擰上瓶蓋，但瓶蓋不要擰緊，留一圈瓶蓋螺紋絲扣有益于滅菌和防止在消毒時(shí)瓶?jī)?nèi)空氣壓力增大而導(dǎo)致血清瓶炸裂。然后將血清瓶和過(guò)濾器放入布袋并扎好布袋口，放入高壓鍋進(jìn)行滅菌，本實(shí)施例高壓鍋采用上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠的YXQ-LS-50 Sll型高壓鍋，在溫度為121°C、相對(duì)壓力(高出空氣大氣壓力)103kPa 115kPa條件下滅菌25分鐘。取出布袋放入無(wú)菌緩沖間的干燥箱中烘干I個(gè)小時(shí)，本實(shí)施例干燥箱采用龍口市先科儀器公司生產(chǎn)的DGL-2003型電熱鼓風(fēng)干燥箱。然后布袋放入無(wú)菌操作臺(tái)用紫外光燈通過(guò)紫外線常規(guī)滅菌30分鐘，再打開(kāi)布袋，取出過(guò)濾器和血清瓶，取出前在布袋中將血清瓶瓶蓋擰緊，將擰好瓶蓋的血清瓶放在無(wú)菌操作臺(tái)上備用。將過(guò)濾器支架用紫外光通過(guò)紫外線常規(guī)照射消毒30分鐘，再用濃度 75%乙醇溶液擦拭過(guò)濾器支架一遍，在酒精燈火焰的外焰燒過(guò)濾器支架30秒，然后過(guò)濾器支架連接在過(guò)濾器上，去掉過(guò)濾器正壓口的牛皮紙，接上真空泵，本實(shí)施例真空泵采用天津奧特賽恩斯儀器有限公司生產(chǎn)的型號(hào)為AP-OlP真空泵，把煮沸5分鐘的I升天然海水從過(guò)濾器進(jìn)口倒入過(guò)濾器中，擰好過(guò)濾器進(jìn)口濾器蓋，拿掉過(guò)濾器出水口牛皮紙，用酒精燈火焰的外焰燒過(guò)濾器出水口 I分鐘，將250毫升的藍(lán)蓋血清瓶的瓶口接近過(guò)濾器出水口接滅菌天然海水，單手操作，接水時(shí)，抒開(kāi)血清瓶蓋，并掀起血清瓶蓋一端，血清瓶蓋另一端不能離開(kāi)血清瓶的瓶口，以避免空氣中的雜質(zhì)進(jìn)入，接好滅菌天然海水的4瓶血清瓶放入恒溫培養(yǎng)箱備用。打開(kāi)無(wú)菌室和無(wú)菌操作臺(tái)上的紫外光燈，通過(guò)紫外線提前常規(guī)消毒30分鐘，并間隔一段時(shí)間(關(guān)閉紫外線燈15分鐘后)，等到無(wú)菌室內(nèi)的臭氧味散盡了人員再進(jìn)入無(wú)菌室操作。在進(jìn)無(wú)菌室之前，先進(jìn)入緩沖間換拖鞋和實(shí)驗(yàn)服，進(jìn)入無(wú)菌室前要對(duì)操作人員胳膊和手用浸有濃度為75%乙醇溶液的棉球擦拭消毒，再進(jìn)入無(wú)菌室并在無(wú)菌操作臺(tái)操作。(2)涮洗后的大葉藻種子用濃度為75%的乙醇溶液浸泡10分鐘，再用滅菌天然海水涮洗2次，并用吸水紙吸干。這里滅菌天然海水同步驟(I)用的滅菌天然海水制備方法 —致。本實(shí)施例濃度為75%的乙醇溶液采用75毫升無(wú)水乙醇加入25毫升的純水配制成濃度為75%乙醇溶液100毫升，本實(shí)施例純水由青島紫泉儀器有限公司生產(chǎn)的FMN1001-R0 型純水機(jī)用自來(lái)水在實(shí)驗(yàn)室制備，本實(shí)施例無(wú)水乙醇采用天津市瑞金特化學(xué)品有限公司生產(chǎn)的規(guī)格為500毫升的無(wú)水乙醇。(3)將大葉藻種子移至濃度為I. 5%的碘化鉀溶液中浸泡20分鐘，再用滅菌天然海水涮洗2次，用吸水紙吸干。這里滅菌天然海水同步驟(I)用的滅菌天然海水制備方法一致。圖I為消毒后的大葉藻種子的照片。本實(shí)施例I. 5%的碘化鉀溶液是用天然海水和碘化鉀配置而成，并在無(wú)菌臺(tái)上抽濾除菌。所用天然海水需要經(jīng)過(guò)人工煮沸5分鐘并冷卻到室溫，本實(shí)施例I. 5%的碘化鉀溶液配置過(guò)程是先稱(chēng)取I. 5克碘化鉀溶解到100毫升煮沸過(guò)的天然海水中，完全溶解后再用一次性的O. 22 μ m針頭濾器抽濾備用。本實(shí)施例O. 22 μ m針頭濾器由美國(guó)密理博公司生產(chǎn)；碘化鉀采用國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司出品的碘化鉀，規(guī)格為每瓶500克。(4)將上述消毒處理好的大葉藻種子接種到鹽度為5%。的滅菌海水中，然后將盛有大葉藻種子鹽度為5%。的滅菌海水的容器放入恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)，在溫度15°C，濕度 60%,光照強(qiáng)度40 μ mol · πΓ2 · S4, L D = 12 12條件下培養(yǎng)7天,大葉藻種子一般在 5%。的滅菌海水中培養(yǎng)3 5天即可實(shí)現(xiàn)完全萌發(fā)。圖2為在5%。鹽度海水中培養(yǎng)3天大葉藻種子的照片，圖3為大葉藻種子接種在5%。鹽度海水中培養(yǎng)10天的照片。本實(shí)施例恒溫光照培養(yǎng)箱采用上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)的MGC-300H型恒溫光照培養(yǎng)箱，該恒溫光照培養(yǎng)箱能夠模擬自然光照條件，在一定光照和溫度情況下，能晝夜自動(dòng)切換。本實(shí)施例鹽度為5%。的滅菌海水是用人工海水素和純水配制而成，即在1000毫升純水中加入5. 025克人工海水素，本實(shí)施例人工海水素采用昌邑市海瑞海水素有限公司生產(chǎn)的海水素，規(guī)格500克/袋。鹽度為5%。的滅菌海水在無(wú)菌臺(tái)上需抽濾除菌，抽濾過(guò)程和使用設(shè)備同本實(shí)施例步驟(I)無(wú)菌天然海水的抽濾過(guò)程一致。(5)大葉藻種子萌發(fā)7天后，即大葉藻種子在5%。鹽度海水中培養(yǎng)10天轉(zhuǎn)接到正常鹽度的滅菌天然海水中，然后將盛有已萌發(fā)大葉藻種子的正常鹽度的滅菌天然海水容器放入恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)，在溫度15 °C，濕度60 %，光照強(qiáng)度40 μ mo I · m_2 · s—1，L D = 12 12條件下培養(yǎng)7 14天。其中L : D= 12 : 12為光照時(shí)間比黑暗時(shí)間，即光照12 小時(shí)，黑暗12小時(shí)，模擬晝夜切換。培養(yǎng)7 14天后萌發(fā)的大葉藻種子的子葉長(zhǎng)度可長(zhǎng)至 2 3厘米。圖4為大葉藻種子接種在正常鹽度天然海水中培養(yǎng)14天的照片。正常鹽度天然海水的鹽度一般為32%。，滅菌天然海水由天然海水經(jīng)煮沸后再抽濾，本實(shí)施例天然海水煮沸是將天然海水放在5000ml三角瓶中在煤氣灶上煮沸5分鐘,抽濾同本實(shí)施例步驟(I)用的滅菌天然海水抽濾方法一致。
權(quán)利要求
1.一種培育大葉藻無(wú)菌苗的方法，其步驟是(1)選取形態(tài)飽滿完整的大葉藻種子，用滅菌天然海水涮洗2次，用吸水紙吸干，移至無(wú)菌室超凈工作臺(tái)上；(2)在無(wú)菌室超凈工作臺(tái)上用濃度為75%乙醇溶液浸泡10分鐘，再用滅菌天然海水涮洗2次，用吸水紙吸干；(3)再將種子移至濃度為I.5%的碘化鉀溶液中浸泡20分鐘，再用滅菌天然海水涮洗 2次，用吸水紙吸干；(4)將步驟(3)消毒處理好的大葉藻種子接種到鹽度為5%。的滅菌海水中，并放入恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)，在溫度15°C，濕度60%，光照強(qiáng)度40iimol s—1，L : D = 12 : 12條件下培養(yǎng)7 14天，L D = 12 12為光照時(shí)間比黑暗時(shí)間，即光照12小時(shí)，黑暗12小時(shí)，模擬晝夜切換；(5)萌發(fā)后的大葉藻種子轉(zhuǎn)接到正常鹽度的滅菌天然海水中，在溫度15°C，濕度60%， 光照強(qiáng)度40 V- mo I m_2 s_\ L D = 12 12條件下再培養(yǎng)7 14天。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種培育大葉藻無(wú)菌苗的方法，其特征在于步驟(I)、步驟(2)、步驟(3)和步驟(5)所述滅菌天然海水為先將天然海水煮沸5分鐘，然后冷卻到室溫后再使用過(guò)濾器進(jìn)行抽濾。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種培育大葉藻無(wú)菌苗的方法，其特征在于在步驟⑵中，所述濃度為75%乙醇溶液是無(wú)水乙醇和純水配制而成。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種培育大葉藻無(wú)菌苗的方法，其特征在于在步驟(3)所述濃度為I. 5%的碘化鉀溶液是用天然海水和碘化鉀配置而成，并抽濾除 菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種培育大葉藻無(wú)菌苗的方法，其特征在于在步驟⑷中，在所述鹽度為5%。的滅菌海水是用人工海水素和純水配制而成，并抽濾除菌。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種培育大葉藻無(wú)菌苗的方法，其步驟是選取形態(tài)飽滿完整的大葉藻種子，用滅菌天然海水涮洗2次；用濃度為75％乙醇溶液浸泡10分鐘，再用滅菌天然海水涮洗2次；將大葉藻種子移至濃度為1.5％的碘化鉀溶液中浸泡20分鐘，再用滅菌海水涮洗2次；接種到鹽度為5‰的滅菌海水中，并放入恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)7～14天；轉(zhuǎn)接到正常鹽度的滅菌海水中，在溫度保持15℃，濕度60％，光照強(qiáng)度40μmol·m-2·s-1，L∶D＝12∶12條件下再培養(yǎng)7～14天。本發(fā)明使大葉藻種子無(wú)菌苗培育迅速而簡(jiǎn)便，而且成本低，不需用額外的培養(yǎng)基和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，節(jié)約成本，操作簡(jiǎn)便。
文檔編號(hào)A01C1/02GK102577699SQ201210011319
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年1月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月1日
發(fā)明者劉延嶺, 崔翠菊, 張立楠, 李曉捷, 江鑫, 潘金華, 羅世菊, 金光, 錢(qián)瑞, 韓厚偉 申請(qǐng)人:山東東方海洋科技股份有限公司