專利名稱：蘇云金芽胞桿菌cry1Ca基因，表達(dá)蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物防治技術(shù)領(lǐng)域，特別是進(jìn)一歩，本發(fā)明涉及對(duì)鱗翅目害蟲具有高毒力的Bt crylCa基因及由該基因所編碼的蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt)是ー種分布廣泛的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，是ー種對(duì)害蟲毒力強(qiáng)且對(duì)天敵無(wú)毒性的昆蟲病原微生物，對(duì)高等動(dòng)物和人無(wú)毒性。它是目前研究最為深入、使用最為廣泛的微生物殺蟲劑，對(duì)16個(gè)目3000多種害蟲有活性。Bt在芽胞形成期可形成殺蟲晶體蛋白(Insecticidal CrystalProteins, ICPs)， 也稱δ-內(nèi)毒素(delta-endotoxin)，它的形狀、結(jié)構(gòu)和大小均與其毒力有著密切關(guān)系 [Schnepf. E, Crickmore. N, Van Rie. J. , Lereclus. D, Baum. J, Feitelson. J, Zeigler. D. R., Dean. D. H. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiol. Mol. Biol. Rev, 1998,62(3) :775-806.]。自 1981 年 khn印f 等克隆了 Bt 的第一個(gè) ICPs 基因，并于1985年發(fā)表了它的DNA堿基序列及其編碼蛋白的氨基酸序列起，目前(2011年10 月)已發(fā)現(xiàn)種殺蟲晶體蛋白605種，被分為70類cry蛋白和2類cyt蛋白。當(dāng)今，采用噴施化學(xué)農(nóng)藥防治手段固然可以減輕害蟲對(duì)農(nóng)作物的為害，但化學(xué)農(nóng)藥造成環(huán)境污染，長(zhǎng)期以來(lái)，大量噴施化學(xué)殺蟲劑，不僅會(huì)增強(qiáng)害蟲的抗藥性，使益蟲及其它生態(tài)區(qū)系遭受破壞， 而且嚴(yán)重污染環(huán)境，提高生產(chǎn)成本，破壞生態(tài)平衡。蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白因其殺蟲效果好、安全、高效等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛的應(yīng)用于蟲害防治。蘇云金芽胞桿菌除了直接作為生物農(nóng)藥以外，1996年全世界第一例轉(zhuǎn)基因抗蟲植物在美國(guó)獲準(zhǔn)應(yīng)用，它使用的基因來(lái)自Bt cryIAc。在接下來(lái)的幾年里，轉(zhuǎn)cryIAb基因的抗蟲玉米，轉(zhuǎn)cry3Aa基因的抗蟲土豆等相距問(wèn)世。在中國(guó)，自1998年開始正式推廣含有crylAc/cryIAb基因的抗蟲棉以來(lái)，已經(jīng)被普遍種植。在轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化的第一個(gè)12年(1996-2007)中，由于能得到持續(xù)穩(wěn)定的收益， 農(nóng)民種植轉(zhuǎn)基因作物量逐年増加。2010年，25個(gè)國(guó)家種植了轉(zhuǎn)基因作物，全球轉(zhuǎn)基因作物累計(jì)種植面積超過(guò)十億公頃，19個(gè)為發(fā)展中國(guó)家，排名前十位的國(guó)家種植面積都超過(guò)100 萬(wàn)公頃，其中，有8個(gè)是發(fā)展中國(guó)家，90%都是小型農(nóng)戶。同吋，有30多個(gè)國(guó)家新近批準(zhǔn)種植轉(zhuǎn)基因作物，日本、新加坡等國(guó)家批準(zhǔn)進(jìn)ロ轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物?？偟膩?lái)說(shuō)，已經(jīng)有59個(gè)國(guó)家同意種植或進(jìn)ロ轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，中國(guó)則批準(zhǔn)了所有的商業(yè)化生物技木，2010我國(guó)種植轉(zhuǎn)基因作物350萬(wàn)公頃，排世界第六。轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化給エ業(yè)化國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家的農(nóng)民都帶來(lái)了經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益。蘇云金芽胞桿菌及其基因發(fā)掘已成為可持續(xù)發(fā)展農(nóng)業(yè)中重要課題。由于目前商品化的轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的抗蟲基因種類比較單一，如此大面積推廣種植存在害蟲避難所減少與害蟲抗藥性上升的風(fēng)險(xiǎn)。因此需要不斷分離高毒力的或者新的基因組合來(lái)避免害蟲抗藥性上升的風(fēng)險(xiǎn)。因此，篩選分離克隆新的、高毒力的Bt殺蟲基因，可以豐富殺蟲基因資源，為轉(zhuǎn)基因作物與工程菌株提供新的基因來(lái)源，提高Bt轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的抗蟲效果，并且可以降低害蟲對(duì)Bt毒蛋白的抗性風(fēng)險(xiǎn)，避免新的生態(tài)災(zāi)難降臨，具有重要的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供ー種對(duì)鱗翅目害蟲小菜蛾、甜菜夜蛾高毒力的蘇云金芽胞桿菌 LB-R-78，及其殺蟲新基因CrylCal3基因和其晶體殺蟲蛋白，以應(yīng)用于轉(zhuǎn)化微生物和植物， 使之表現(xiàn)出對(duì)相關(guān)害蟲的毒性，并克服、延緩害蟲對(duì)工程菌和轉(zhuǎn)基因植物的抗藥性產(chǎn)生。蘇云金芽胞桿菌菌株LB-R-78，其保藏編號(hào)為CGMCC No. 5567。蘇云金芽胞桿菌菌株LB-R-78在殺殺滅小菜蛾，棉鈴蟲，甜菜夜蛾中的應(yīng)用。殺蟲蛋白CrylCal3，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。crylCal3基因，編碼殺蟲蛋白CrylCal3。優(yōu)選其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示。ー種表達(dá)載體，其特征是含有crylCal3基因。所述表達(dá)載體為pEB-crylCa，其骨架載體為pEB，其結(jié)構(gòu)如圖6所示。所述表達(dá)載體為pSTK-crylCa，其骨架載體為pSTK，其結(jié)構(gòu)如圖7所示。ー種微生物轉(zhuǎn)化體，其特征是含有crylCal3基因。crylCal3基因在殺滅小菜蛾，棉鈴蟲，甜菜夜蛾害蟲中的應(yīng)用。所述應(yīng)用是將CrylCal3基因表達(dá)的蛋白作為生物殺蟲劑的有效成分。本發(fā)明從遼寧千山圓通觀附近土壌中分離得到一株蘇云金芽胞桿菌菌株 LB-R-78，其保藏編號(hào)為CGMCC No. 5567，該菌株生物學(xué)特性為在生長(zhǎng)周期中可以產(chǎn)生芽胞， 并且同時(shí)產(chǎn)生有毒殺鞘翅目害蟲作用的伴胞晶體，其對(duì)小菜蛾具有很強(qiáng)的殺滅能力；從該菌株中得到ー個(gè)新基因的陽(yáng)性克隆，即pEB-crylCa (見圖6)，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)克隆 crylCa中含有3573個(gè)堿基，見SEQ ID NOl，編碼1191個(gè)氨基酸，見SEQ ID N02。與已發(fā)表的基因相比，與crylCa5相似性最高，相差5個(gè)氨基酸；從上述陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入受體菌，得到表達(dá)菌株，測(cè)定基因的表達(dá)蛋白的活性，基因crylCa表達(dá)的蛋白對(duì)小菜蛾，甜菜夜蛾的初篩生測(cè)結(jié)果為校正死亡率為100%，見表1。crylCal3基因可按生物技術(shù)的常規(guī)方法轉(zhuǎn)化微生物、植物，表現(xiàn)出對(duì)相關(guān)鱗翅目害蟲的毒性。將上述基因轉(zhuǎn)化菌株，表達(dá)得到的蛋白可以制成生物農(nóng)藥用于殺死鱗翅目害蟲。 同吋，可以轉(zhuǎn)入植物構(gòu)建抗蟲轉(zhuǎn)基因植物，用于害蟲的防治。本發(fā)明分離克隆的Bt crylCal3基因序列及其基因表達(dá)產(chǎn)物能夠?qū)η食崮亢οx產(chǎn)生強(qiáng)毒力，特別是對(duì)小菜蛾有高活性，是很好的生物殺蟲基因，有很廣泛的應(yīng)用前景。通過(guò)該crylCal3基因與crylAc、cryIAb, crylBa、cry2Ab等基因表達(dá)產(chǎn)物組合，可擴(kuò)大對(duì)鱗翅目害蟲的蟲譜。通過(guò)應(yīng)用于轉(zhuǎn)化微生物和植物，使它們表現(xiàn)出對(duì)相關(guān)害蟲的毒性，可克服或延緩昆蟲對(duì)工程菌和轉(zhuǎn)基因植物抗藥性的產(chǎn)生。菌株保藏信息菌種分類命名蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)保藏機(jī)構(gòu)中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏日期2011年12月12日保藏編號(hào)CGMCCNo. 556

圖1光學(xué)顯微鏡下觀察菌株LB-R-78菌體的形態(tài)，圖2電鏡下菌株LB-R-78菌體形態(tài)圖3含有目的基因的基因組PCR鑒定，其中1 菌株 LB-R-78PCR-RFLP 結(jié)果，2 菌株LB-R-78PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M =Marker (100, 200、500、750、1000、2000bp)圖4crylCal3基因全長(zhǎng)PCR結(jié)果M :Marker(300、500、800、1500、2000、3000、5000bp)，1 :pEB_crylCa質(zhì)粒 DNA 的 Sal I 消化產(chǎn)物；2 :pEB-crylCa 質(zhì)粒 DNA 的 Sma I/Sal I 消化產(chǎn)物；3 :pEB_crylCa 質(zhì)粒 DNA 3. 6kb全長(zhǎng)擴(kuò)增產(chǎn)物；4，5 :pSTK-cry ICa酶切圖譜圖5crylCal3基因在大腸桿菌中表達(dá)蛋白的SDS-PAGE其中a為pEB-crylCa重組質(zhì)粒的表達(dá)，b為pSTK-crylCa重組質(zhì)粒的表達(dá)。M 蛋白高分子量 marker (200，116，97，66，44kDa)，1 :IPTG 誘導(dǎo)的 pEB-crylCa 可溶組分；2 =IPTG誘導(dǎo)的pEB空載體可溶組分；3 =IPTG誘導(dǎo)的pEB-crylCa非可溶組分；4 IPTG誘導(dǎo)的pEB空載體非可溶組分；5，6 =BSA ；7 :pSTK-crylCa重組質(zhì)粒在Bt無(wú)晶體突變株中的表達(dá)圖6pEB_crylCa結(jié)構(gòu)示意圖，圖 7pSTK_crylCa 結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、分離得到蘇云金芽胞桿菌菌株LB-R-78本申請(qǐng)人的實(shí)驗(yàn)室工作人員從黑龍江省五常市拉林鎮(zhèn)附近土壌中分離的得到一株蘇云金芽胞桿菌，蘇云金芽胞桿菌的芽胞由外向內(nèi)依次為芽胞外壁、芽胞衣、皮層、芽胞內(nèi)壁，原生質(zhì)膜和原生質(zhì)體。其中皮層的主要成分是肽聚糖，不含營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的多聚糖磷壁酸，它保持著芽胞的脫水狀態(tài)和耐熱性，另ー方面，芽胞形成過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生大量DPA-Ca 鰲合物，使得芽胞中的生物大分子形成耐熱凝膠，在80°C下熱處理20min，蘇云金芽胞桿菌芽胞也不會(huì)死亡并且休眠的芽胞在75°C的亞致死溫度下處理15min，活化效果最好，不但促其快速萌發(fā)，還可提高芽胞的成活率(喻子牛1990)。依據(jù)這ー特性，可實(shí)施溫度篩選(Knowles B H, Ellar D J. Colloid-osmotic lysis is a general feature of the mechanism of action of Bacillus thuringiensis d-endotoxins with different specificity[J]. Biochimica et biophysica acta, 1987,924 :509-518.；戴蓮音與，王學(xué)聘等.中國(guó)八個(gè)自然保護(hù)區(qū)森林土壤中蘇云金芽胞桿的分布[J].微生物學(xué)報(bào)，1994， 30(2) 117-121)。1、1菌株的分離1)取分裝的土樣加入到50ml大離心管中，至錐形管錐形處。2)加滅菌水至15ml處，放入玻璃珠5 10顆。3)用振蕩器將土樣打碎。4)放入水浴鍋中80°C，20分鐘。5)取1. 5ml的EP管，每個(gè)管中加Iml滅菌水，再?gòu)?0ml管中取10微升菌液加入到EP管中混勻。6)從EP管中取100微升噴到1/2LB培養(yǎng)基中，涂勻。7)放入到30°C溫箱中培養(yǎng)2 3天。8)鏡檢觀察。晶體觀察光學(xué)顯微鏡將胞晶混合液滴于載玻片上，涂抹均勻，烘干固定，石炭酸復(fù)紅染液染色;3min， 清水沖洗，IOOx油鏡進(jìn)行鏡檢，石炭酸復(fù)紅染液配制方法參見文獻(xiàn)(Baroy F，Lecadet M M, Deieluse A. Cloning and sequencing οι three new putative toxin genes from Clostridium bifermentans [J]. Gene, 1998,211 :293-295)。見圖 1 所示。在 1/2LB 培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 后形成單菌落，光學(xué)顯微鏡下觀察到菌株LB-R-78菌體為長(zhǎng)桿狀，芽胞為長(zhǎng)圓棒狀，晶體為雙錐形。電鏡顯微觀察掃描電鏡制樣孢晶混合液滴于玻璃片上，干燥，經(jīng)鋨酸固定，而后經(jīng)酒精梯度脫水，臨界點(diǎn)干燥，離子濺射噴金Onm厚)，NewBiO-TEMH-7500掃描電鏡觀察拍照。如圖2所
7J\ ο生物學(xué)測(cè)定表明，對(duì)小菜蛾、甜菜夜蛾的初篩生測(cè)結(jié)果為校正死亡率為100%。實(shí)施例2.獲得新基因2. 1利用cryl類基因通用引物檢測(cè)菌株LB-R-78，引物如下
權(quán)利要求
1.蘇云金芽胞桿菌菌株LB-R-78，其保藏編號(hào)為CGMCCNo. 5567。
2.蘇云金芽胞桿菌菌株LB-R-78在殺滅小菜蛾，棉鈴蟲，甜菜夜蛾中的應(yīng)用。
3.殺蟲蛋白CrylCal3，其氨基酸序列如SEQID NO 2所示。
4.crylCal3基因，編碼殺蟲蛋白CrylCal3。
5.權(quán)利要求4所述的crylCal3基因，其核苷酸序列如SEQID NOl所示。
6.ー種表達(dá)載體，其特征是含有權(quán)利要求4或5所述的CrylCal3基因。
7.權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體為pEB-crylCa，其骨架載體為pEB，其結(jié)構(gòu)如圖6所示； 或者所述表達(dá)載體為pSTK-crylCa，其骨架載體為pSTK，其結(jié)構(gòu)如圖7所示。
8.—種微生物轉(zhuǎn)化體，其特征是含有權(quán)利要求4或5所述的crylCal3基因。
9.權(quán)利要求4或5所述的CrylCal3基因在殺滅小菜蛾，棉鈴蟲，甜菜夜蛾害蟲中的應(yīng)ο
10.權(quán)利要求9所述應(yīng)用，是將權(quán)利要求4或5所述的CrylCal3基因表達(dá)的蛋白作為生物殺蟲劑的有效成分。
全文摘要
本發(fā)明涉及“蘇云金芽胞桿菌cry1Ca13基因，表達(dá)蛋白及其應(yīng)用”，屬于生物防治技術(shù)領(lǐng)域。殺蟲蛋白，具有如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列，及編碼該殺蟲蛋白的基因，優(yōu)選所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。上述基因?qū)[翅目害蟲具有高毒力，以應(yīng)用于轉(zhuǎn)化微生物和植物，使之表現(xiàn)出對(duì)相關(guān)害蟲的毒性，并克服、延緩害蟲對(duì)工程菌和轉(zhuǎn)基因植物的抗藥性產(chǎn)生。
文檔編號(hào)A01N47/44GK102559554SQ20121000411
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月9日
發(fā)明者劉榮梅, 宋福平, 張 杰, 李海濤, 高繼國(guó) 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)