專利名稱：突變型生長激素受體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及突變型生長激素受體及其應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明涉及分離的突變型生長激素受體、分離的寡核苷酸、構(gòu)建體、轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞或其培養(yǎng)物、制備轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞的方法、制備非人轉(zhuǎn)基因動物的方法、非人轉(zhuǎn)基因動物或其后代以及篩選治療侏儒癥的藥物的方法。
背景技術(shù)：
目前市面上的寵物豬主要是巴馬香豬、貴州小香豬、五指山老鼠豬等，這些豬的成年體重約35-4^g，體型較大，不能滿足寵物市場的需要。此外，一些外貌漂亮的地方豬，如榮昌豬又名熊貓豬，成年體重為90kg，同樣不適合作為寵物豬。此外，豬與人類相比，在遺傳水平、生理機理、代謝功能及器官大小等方面都極為相近，是良好的實驗動物模型。然而，目前的豬品種并不能滿足生活和科研的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出這樣的方案，利用該方案能夠有效地獲得小型化動物，例如與野生型相比，體型較小的豬。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種分離的突變型生長激素受體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，與野生型生長激素受體相比，所述突變型生長激素受體至少缺失胞內(nèi)區(qū)段的氨基酸序列?；谠撏蛔冃蜕L激素受體缺失胞內(nèi)區(qū)段，借助該突變型生長激素受體的表達(dá)，能夠有效地干擾動物生長軸通路，從而可以抑制動物的生長，使得動物的體型比野生型動物小。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種分離的寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述寡核苷酸包含編碼前述的分離的突變型生長激素受體的核酸序列。該分離的寡核苷酸能夠編碼前述的突變型生長激素受體，從而通過將該寡核苷酸引入到動物中，可以表達(dá)缺失胞內(nèi)區(qū)段的突變型生長激素受體，能夠有效地干擾動物生長軸通路，從而可以抑制動物的生長，使得動物的體型比野生型動物小。根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該構(gòu)建體包含第一核酸分子，所述第一核酸分子包括編碼突變型生長激素受體的序列，其中，與野生型生長激素受體相比，所述突變型生長激素受體至少缺失胞內(nèi)區(qū)段的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的實施例，借助該構(gòu)建體，能夠?qū)⒕幋a突變型生長激素受體的核酸序列引入到動物細(xì)胞中，從而可以使得動物的體型比野生型動物小。根據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞或其培養(yǎng)物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞的基因組中具有編碼突變型生長激素受體的核酸序列，其中，與野生型生長激素受體相比，所述突變型生長激素受體至少缺失胞內(nèi)區(qū)段的氨基酸序列。由此，該動物細(xì)胞或其培養(yǎng)物，可以作為細(xì)胞模型用于篩選能夠治療侏儒癥的藥物，另外，利用該轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞或其培養(yǎng)物，可以有效地獲得體型比野生型動物小的動物。根據(jù)本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出了一種制備上述轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括以下步驟使用前面所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；以及分離轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞，其中，所述轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞的基因組中具有編碼突變型生長激素受體的核酸序列，與野生型生長激素受體相比，所述突變型生長激素受體至少缺失胞內(nèi)區(qū)段的氨基酸序列。利用該方法，能夠有效地制備前面所述的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞。從而可以獲得用于篩選能夠治療侏儒癥的藥物的細(xì)胞模型，或者進(jìn)一步利用該轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞或其培養(yǎng)物， 可以有效地獲得體型比野生型動物小的動物。根據(jù)本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提出了一種制備非人轉(zhuǎn)基因動物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括以下步驟提取動物細(xì)胞的細(xì)胞核；將所述細(xì)胞核引入所述動物的無核卵母細(xì)胞中，以便獲得融合卵母細(xì)胞；以及將所述融合卵母細(xì)胞在適宜的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，以便獲得所述非人轉(zhuǎn)基因動物，其中，所述動物細(xì)胞的基因組中具有編碼突變型生長激素受體的核酸序列，與野生型生長激素受體相比，所述突變型生長激素受體至少缺失胞內(nèi)區(qū)段的氨基酸序列。利用該方法，能夠有效地獲得小型化動物，從而可以適合作為寵物，或者作為篩選治療侏儒癥藥物的動物模型。根據(jù)本發(fā)明的第七方面，本發(fā)明提出了一種非人轉(zhuǎn)基因動物或其后代。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述非人轉(zhuǎn)基因動物是根據(jù)前面所述的制備非人轉(zhuǎn)基因動物的方法獲得的。 該非人轉(zhuǎn)基因動物或其后代的體型比野生型動物要小，從而可以適合作為寵物，或者作為篩選治療侏儒癥藥物的動物模型。根據(jù)本發(fā)明的第八方面，本發(fā)明提出了前面所述的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞或其培養(yǎng)物、 或前面所述的非人轉(zhuǎn)基因動物或其后代在篩選治療侏儒癥的藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的第九方面，本發(fā)明提出了一種篩選治療侏儒癥的藥物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括下列步驟將前面所述的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞或其培養(yǎng)物、或前面所述的非人轉(zhuǎn)基因動物或其后代與藥物候選物接觸，并檢測與所述藥物候選物接觸前后， 所述轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞或其培養(yǎng)物、或非人轉(zhuǎn)基因動物或其后代中野生型生長激素受體的表達(dá)量，以便分別獲得第一表達(dá)量和第二表達(dá)量；以及第二表達(dá)量高于第一表達(dá)量為所述藥物候選物為治療侏儒癥的藥物的指示。與藥物候選物接觸后，野生型生長激素受體的表達(dá)量比接觸前有所提高，可以確定該藥物候選物可以作為治療侏儒癥的藥物，因而利用該方法，能夠有效地篩選治療侏儒癥的藥物。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。


本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中圖1是根據(jù)本發(fā)明一個實施例的制備轉(zhuǎn)基因豬的方法的流程示意圖；圖2是根據(jù)本發(fā)明一個實施例的構(gòu)建構(gòu)建體的方法的流程示意圖；圖3是根據(jù)本發(fā)明一個實施例構(gòu)建的pCAG-GHRdm-IRES-GFP-Neo的結(jié)構(gòu)示意圖4是根據(jù)本發(fā)明一個實施例，篩選得到的陽性細(xì)胞系的顯微鏡照片，其中圖4A 是在白光下放大40倍的照片，圖4B是在綠色激發(fā)光下放大100倍的照片；圖5是根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，對陽性克隆的RNA進(jìn)行PCR鑒定的結(jié)果。圖5A 顯示了利用突變體GHR引物進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果，圖5B顯示了利用野生型GHR引物進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果。在圖5A和5B中，M表示DL2000Marker泳道，+表示利用構(gòu)建的表達(dá)載體作為陽性對照的結(jié)果，1-8泳道表示轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞系的結(jié)果；圖6是根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，對轉(zhuǎn)基因豬進(jìn)行成纖維細(xì)胞建系后，顯微鏡觀察的結(jié)果。圖6A是在白光放大100倍的照片，圖6B是在綠色激發(fā)光下放大100倍的照片；圖7是根據(jù)本發(fā)明一個實施例，對兩頭轉(zhuǎn)基因小豬進(jìn)行PCR檢測的結(jié)果。其中M 表示Marker 500bp泳道，+表示以構(gòu)建的載體作為陽性對照的泳道，-表示以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞系作為陰性對照的泳道，115和106表示轉(zhuǎn)基因小豬細(xì)胞系的泳道；圖8是根據(jù)本發(fā)明的實施例，所得到的轉(zhuǎn)基因豬的實際照片。其中，圖8A表示 PM-GHRdm-EGFP-1022出生后3天的照片，圖8B表示DB-GHRdm_EGFP-1034出生后20天的照片，圖8C表示120-DB-GHRdm-EGFP-1034出生后2個月與藏香小豬1個月的對比圖。
具體實施例方式下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。術(shù)語“第一”、“第二”等僅用于方便描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性。在本發(fā)明的描述中，除非另有說明，“多個”的含義是兩個或兩個以上。1、突變型生長激素受體及其編碼核酸和構(gòu)建體1. 1、突變型生長激素受體根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種分離的突變型生長激素受體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，與野生型生長激素受體相比，所述突變型生長激素受體至少缺失胞內(nèi)區(qū)段的氨基酸序列。通常，動物例如人、豬和小鼠等的生長是由生長軸來調(diào)控的。生長軸是動物體內(nèi)從下丘腦一垂體一靶器官的一系列激素及其受體所組成的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，由生長激素釋放因子(GRF)、生長激素(GH)和胰島素樣生長因子(IGF)構(gòu)成。下丘腦根據(jù)機體需要分泌生長激素釋放激素(growth hormone releasing hormone,GHRH)禾口生長 φ素(somatostatin, SS)，以雙重作用于垂體，控制生長激素的分泌；生長激素經(jīng)血液循環(huán)至肝臟，與細(xì)胞膜表面的生長激素受體(growth hormone receptor,GHR)結(jié)合，啟動細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，促進(jìn)胰島素樣生長因子(insulin-like growthfactors, IGFs)的表達(dá)；IGFs再通過血液循環(huán)到達(dá)機體的局部組織，促進(jìn)組織細(xì)胞的生長和分化。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的實施例的突變型生長激素受體缺失胞內(nèi)區(qū)段，從而借助該突變型生長激素受體的表達(dá)，可以抑制野生型生長激素受體的表達(dá)，從而能夠有效地干擾動物生長軸通路，以便抑制動物的生長，使得動物的體型比野生型動物小。根據(jù)本發(fā)明的實施例，野生型生長激素受體的來源并不受到特別限制。根據(jù)本發(fā)明的具體實例，野生型生長激素受體的來源為動物例如人、豬和小鼠的至少一種，更具體地，可以為選自大白豬和廣西巴馬香豬的至少一種。即，本發(fā)明的突變型生長激素受體可以衍生自人、豬或小鼠的生長激素受體。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過將上述的動物的生長激素受體的胞內(nèi)區(qū)段進(jìn)行突變?nèi)笔?，可以十分有效地使得上述動物的生長變慢，并最終可以得到體型相對于自然生長的野生型動物較小的動物。所得到的最終動物的體型較小，可以作為家庭的寵物，滿足目前日益增長的人們對寵物新品種的需求，另外，可以有效地應(yīng)用于實驗室的研究，例如可以獲得體型較小的豬，從而便于以豬為試驗對象的研究的開展。發(fā)明人還驚奇地發(fā)現(xiàn)，在將豬的生長激素受體進(jìn)行突變處理后，所得到的體型較小的豬，其并不影響其他生理功能的運行，因而可以有效地作為研究動物生理機理的實驗對象。另外，豬與人類相比，在遺傳水平、 生理機理、代謝功能及器官大小等方面都極為相近，是良好的實驗動物模型。因而，通過將根據(jù)本發(fā)明實施例的突變型生長激素受體在豬中表達(dá)，可以獲得能夠有效進(jìn)行人類疾病研究的動物模型。根據(jù)本發(fā)明的實施例，突變型生長激素受體所缺失的部分的具體氨基酸序列并不受特別限制，只要突變型生長激素受體活性低于野生型生長激素受體即可。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，對于來源于豬生長激素受體的突變型生長激素受體，與野生型生長激素受體相比，該突變型生長激素受體至少缺失由第9外顯子所編碼的氨基酸序列。優(yōu)選，與野生型生長激素受體相比，該突變型生長激素受體進(jìn)一步缺失由第10外顯子的至少一部分所編碼的氨基酸序列。更優(yōu)選，缺失由第9外顯子和大部分第10外顯子所編碼的氨基酸序列， 進(jìn)一步優(yōu)選，與野生型生長激素受體相比，該突變型生長激素受體缺失由第9和第10外顯子所編碼的氨基酸序列，換言之，突變型生長激素受體是由第2-8外顯子所編碼的氨基酸序列構(gòu)成的(第1號外顯子是非翻譯區(qū))。最優(yōu)選地，對于來源于豬生長激素受體的突變型生長激素受體，其氨基酸序列為MDLWQLLLTLAVAGSSDAFSGSEATPAVLVRASQSLQRVHPGLETNSSG KPKFTKCRSPELETFSCHWTDGVRHGLQSPGSIQLFYIRRSTQEWTQEWKECPDYVSAGENSCYFNSSYTSIWIPYC IKLTSNGGTVDQKCFSVEEIVQPDPPIGLNWTLLNISLTGIHADIQVRWEPPPNADVQKGWIVLEYELQYKEVNETQ WKMMDPVLSTSVPVYSLRLDKEYEVRVRSRQRNSEKYGEFSEVLYVTLPQMSPFACEEDFRFPWFLIIIFGIFGLTV ILFLLIFSKQQRKE(SEQ ID NO :1)所示。根據(jù)本發(fā)明的實施例，與野生型生長激素受體相比， 突變型生長激素受體還可以進(jìn)一步缺失由第8外顯子所編碼的氨基酸序列。本發(fā)明的發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過在動物例如豬中表達(dá)上述突變型生長激素，可以有效地獲得體型比野生型動物小的動物，并且不會影響轉(zhuǎn)基因動物的其他生理功能，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)基因動物的存活率。在本文中所使用的表達(dá)方式“體型比野生型動物小”應(yīng)做廣義理解，即可以是表達(dá)突變型生長激素受體的動物最終發(fā)育的尺寸比野生型動物小，也可以是在特定的生長階段，表達(dá)突變型生長激素受體的動物的尺寸比野生型動物小。1. 2、編碼突變型生長激素受體的寡核苷酸根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種分離的寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述寡核苷酸包含編碼前述的分離的突變型生長激素受體的核酸序列。該分離的寡核苷酸能夠編碼前述的突變型生長激素受體，從而通過將該寡核苷酸引入到動物中，可以表達(dá)缺失胞內(nèi)區(qū)段的突變型生長激素受體，能夠有效地干擾動物生長軸通路，從而可以抑制動物的生長，使得動物的體型比野生型動物小。關(guān)于該分離的寡核苷酸所表達(dá)的突變型生長激素受體的功能和優(yōu)點，前面已經(jīng)進(jìn)行了詳細(xì)描述，不再贅述。
需要說明的是，如前所述，野生型生長激素受體的來源并不受到特別限制。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，野生型生長激素受體的來源為動物例如人、豬和小鼠的至少一種，更具體地，可以為選自大白豬和廣西巴馬香豬的至少一種。即，本發(fā)明的突變型生長激素受體可以衍生自人、豬或小鼠的生長激素受體。因而，本發(fā)明實施例的用于編碼突變型生長激素受體的寡核苷酸可以衍生自相應(yīng)的野生型生長激素受體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以人工合成相應(yīng)的寡核苷酸序列，也可以通過分子生物學(xué)手段，通過對野生型生長激素受體進(jìn)行改造，獲得相應(yīng)的突變型生長激素受體的編碼核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的實施例，優(yōu)選分離的寡核苷酸的核苷酸序列為ATGGATCTCTGGCAGCTTCTGTTGACCTTGGCAGTGGCAGGCTCAAGTGATGCTTTTTCTGGGAGT GAAGCCACACCAGCTGTCCTTGTCAGAGCATCTCAGAGTCTGCAGAGAGTTCATCCAGGCCTAGAGACAAATTCTTC TGGAAAGCCTAAATTCACCAAGTGCCGTTCACCTGAACTAGAGACGTTTTCATGCCACTGGACAGATGGGGTCCGTC ACGGTTTACAGAGCCCTGGATCCATACAGCTGTTCTATATTAGAAGGAGCACTCAAGAGTGGACTCAAGAATGGAAA GAGTGCCCTGATTATGTCTCTGCTGGAGAAAACAGCTGTTACTTTAATTCATCTTATACCTCCATTTGGATACCCTA CTGTATCAAGCTGACTAGCAATGGTGGGACTGTGGATCAAAAGTGTTTCTCCGTTGAGGAAATAGTGCAACCGGATC CACCCATTGGCCTCAACTGGACTCTACTGAATATCAGTTTAACAGGGATTCATGCAGATATCCAAGTGAGATGGGAA CCACCTCCCAATGCAGATGTTCAGAAGGGATGGATAGTCCTGGAGTATGAACTGCAATACAAAGAAGTAAATGAGAC CCAGTGGAAAATGATGGACCCTGTATTGTCAACATCAGTTCCGGTGTACTCCTTGAGACTGGATAAAGAGTATGAAG TGCGTGTGAGATCCAGACAACGAAACTCTGAAAAATATGGAGAGTTCAGTGAAGTGCTGTATGTAACACTTCCTCAG ATGAGCCCATTTGCATGTGAAGAAGATTTCCGGTTTCCATGGTTCTTAATTATCATCTTTGGAATATTTGGGCTAAC GGTGATATTATTTTTACTCATATTTTCTAAACAGCAAAGGAAGGAAAATTAG(SEQ ID NO :2)所示。申請人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用該寡核苷酸時，其在動物細(xì)胞中的表達(dá)率要比其他能夠編碼相同氨基酸序列的寡核苷酸高得多，從而可以提高后續(xù)獲得轉(zhuǎn)基因動物，以及篩選藥物的效率。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“寡核苷酸”可以是任何包含脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于經(jīng)過修飾的或者未經(jīng)修飾的DNA、RNA，其長度不受任何特別限制。對于用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物的構(gòu)建體，優(yōu)選所寡核苷酸為DNA，因為DNA相對于RNA而言，其更穩(wěn)定，并且易于操作。1.3、構(gòu)建體根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該構(gòu)建體包含第一核酸分子，該第一核酸分子包括編碼突變型生長激素受體的序列，其中，與野生型生長激素受體相比，突變型生長激素受體至少缺失胞內(nèi)區(qū)段的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該構(gòu)建體可以作為外源核酸的表達(dá)載體，也可以稱為過表達(dá)載體。借助該構(gòu)建體，能夠?qū)⒕幋a突變型生長激素受體的核酸序列引入到動物細(xì)胞中，從而可以獲得體型比野生型動物小的轉(zhuǎn)基因動物或其轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，由此可以作為研究對象，也可以作為寵物。 根據(jù)本發(fā)明的實施例，突變型生長激素受體所缺失的部分的具體氨基酸序列并不受特別限制，只要突變型生長激素受體活性低于野生型生長激素受體即可。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，對于來源于豬生長激素受體的突變型生長激素受體，與野生型生長激素受體相比，該突變型生長激素受體至少缺失由第9外顯子所編碼的氨基酸序列。優(yōu)選，與野生型生長激素受體相比，該突變型生長激素受體進(jìn)一步缺失由第10外顯子的至少一部分所編碼的氨基酸序列。更優(yōu)選，缺失由第9外顯子和大部分第10外顯子所編碼的氨基酸序列，進(jìn)一步優(yōu)選，與野生型生長激素受體相比，該突變型生長激素受體缺失由第9和第10外顯子所編碼的氨基酸序列，換言之，突變型生長激素受體是由第2-8外顯子所編碼的氨基酸序列構(gòu)成的(第1號外顯子是非翻譯區(qū))。最優(yōu)選地，對于來源于豬生長激素受體的突變型生長激素受體，其氨基酸序列為如SEQID N0:1所示。根據(jù)本發(fā)明的實施例，與野生型生長激素受體相比，突變型生長激素受體還可以進(jìn)一步缺失由第8外顯子所編碼的氨基酸序列。本發(fā)明的發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過在動物例如豬中表達(dá)上述突變型生長激素，可以有效地獲得體型比野生型動物小的動物，并且不會影響轉(zhuǎn)基因動物的其他生理功能，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)基因動物的存活率。根據(jù)本發(fā)明的實施例，構(gòu)建體中所包含的第一核酸分子的序列可以衍生自相應(yīng)的野生型生長激素受體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以人工合成相應(yīng)的寡核苷酸序列，也可以通過分子生物學(xué)手段，通過對野生型生長激素受體進(jìn)行改造，獲得相應(yīng)的突變型生長激素受體的編碼核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的實施例，優(yōu)選第一核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。申請人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用該寡核苷酸時，其在動物細(xì)胞中的表達(dá)率要比其他能夠編碼相同氨基酸序列的寡核苷酸要高得多，從而可以提高后續(xù)獲得轉(zhuǎn)基因動物，以及篩選藥物的效率。關(guān)于突變型生長激素受體，以及編碼該突變型生長激素受體的寡核苷酸，前面已經(jīng)進(jìn)行了詳細(xì)描述，此處不再贅述。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“構(gòu)建體”是指這樣的一種遺傳載體，其包含特定核酸序列，并且能夠?qū)⒛康暮怂嵝蛄修D(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中，使目的核酸序列整合到宿主細(xì)胞的基因組上，以獲得重組細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，構(gòu)建體的形式不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的實施例，其可以為質(zhì)粒、噬菌體、人工染色體、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，構(gòu)建體呈質(zhì)粒的形式。質(zhì)粒作為遺傳載體，具有操作簡單，可以攜帶較大片段的性質(zhì)，便于操作和處理。質(zhì)粒的形式也不受特別限制，既可以是環(huán)形質(zhì)粒，也可以是線性質(zhì)粒，即可以是單鏈的，也可以是雙鏈的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要進(jìn)行選擇。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“核酸”可以是任何包含脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于經(jīng)過修飾的或者未經(jīng)修飾的DNA、RNA，其長度不受任何特別限制。對于用于構(gòu)建重組細(xì)胞的構(gòu)建體，優(yōu)選所述核酸為DNA，因為DNA相對于RNA而言，其更穩(wěn)定，并且易于操作。根據(jù)本發(fā)明的實施例，構(gòu)建體中還可以包含其他的元件，從而為構(gòu)建體賦予額外的有益效果。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要，選擇這些元件在構(gòu)建體上與第一核酸分子的相對位置。即可以設(shè)置在第一核酸分子的上游，也可以設(shè)置在第一核酸分子的下游，只要這些元件能夠發(fā)揮其相應(yīng)的功能即可。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“5’側(cè)”可以與“上游”互換使用，“3’側(cè)”可以與“下游”互換使用。第二核酸序列和第三核酸序列分別位于第一核酸序列的5’側(cè)和3’側(cè)，即指的是第二核酸序列和第三核酸序列分別位于第一核酸序列的上游和下游，可以是分別獨立地與第一核酸序列直接相連，即分別緊鄰設(shè)置在第一核酸序列的5’末端和3’末端，也可以是通過媒介物，例如核酸接頭序列與第一核酸序列相連。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，構(gòu)建體可以進(jìn)一步包含啟動子序列，所述啟動子序列與所述第一核酸分子可操作地相連。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“啟動子”指的是這樣一種核酸序列，其能夠指導(dǎo)與其可操縱地連接的核酸分子的轉(zhuǎn)錄。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“可操縱地”指的是核酸表達(dá)控制序列例如啟動子、信號序列、增強子等與目標(biāo)核酸序列之間的功能連接，其中當(dāng)合適的分子例如轉(zhuǎn)錄活化分子與表達(dá)控制序列結(jié)合時，表達(dá)控制序列影響著對應(yīng)于目標(biāo)核酸序列的核酸的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。由此，可以直接通過構(gòu)建體在動物細(xì)胞中引入特定的啟動子，并且該啟動子可以用于啟動第一核酸分子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，由此，可以提高所獲得的重組細(xì)胞中第一核酸分子的表達(dá)效率。根據(jù)本發(fā)明的具體實例，所述啟動子為CAG啟動子。申請人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用該啟動子時，可以有效地在動物細(xì)胞中表達(dá)突變型生長激素受體基因。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，構(gòu)建體可以進(jìn)一步包括第二核酸分子，該第二核酸分子包括編碼內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點序列(IREQ的序列。由此可以通過在IRES下游設(shè)置其他編碼序列(例如后面所描述的第三核酸分子)，以便使得該編碼序列與突變型生長激素受體均能夠被有效翻譯，并且表達(dá)產(chǎn)物能夠有效地發(fā)揮各自的功能。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，構(gòu)建體可以進(jìn)一步包括第三核酸分子，該第三核酸分子包括編碼報告蛋白的序列。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“報告蛋白”是指這樣的一種蛋白質(zhì)，其在表達(dá)后，能夠產(chǎn)生可以直接或者間接檢測的信號，進(jìn)而能夠反映構(gòu)建體所攜帶的外源核酸序列是否已經(jīng)在細(xì)胞中被成功表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，報告蛋白的種類并不受特別限制，只要其具有可檢測的活性即可。根據(jù)本發(fā)明的實施例，報告蛋白可以是一種能夠產(chǎn)生光學(xué)信號的蛋白質(zhì)例如發(fā)光蛋白或者熒光蛋白例如綠色熒光蛋白等?；蛘邎蟾娴鞍卓梢允且环N能夠與底物相互作用以產(chǎn)生可檢測信號的酶，例如IacZ基因編碼的β -半乳糖苷酶。半乳糖苷酶能催化一系列底物轉(zhuǎn)化成極易檢測的不同顏色的產(chǎn)物。但是IacZ在細(xì)胞內(nèi)本底表達(dá)較高，并且檢測需要破碎細(xì)胞壁，從而限制了其應(yīng)用。因而，根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，報告蛋白可以為選自發(fā)光蛋白、熒光蛋白、酶的至少一種。由此，可以根據(jù)常規(guī)的方法，對所述報告蛋白進(jìn)行監(jiān)測。例如可以采用比色法、熒光法、生物發(fā)光法、化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫法(ELISA)及原位染色法對報告蛋白進(jìn)行檢測。這其中，優(yōu)選發(fā)光蛋白，因為發(fā)光蛋白能夠發(fā)出特定波長的光，因而能夠容易對發(fā)光蛋白進(jìn)行檢測，并且容易對其進(jìn)行定量檢測。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，報告蛋白為綠色熒光蛋白。由此，可以便捷地通過熒光顯微鏡，就能夠確定構(gòu)建體所攜帶的外源核酸序列是否已經(jīng)在細(xì)胞中被成功表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，構(gòu)建體可以進(jìn)一步包括篩選標(biāo)記基因。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“篩選標(biāo)記基因”指的是這樣的一種基因，其編碼的產(chǎn)物能夠賦予連同載體接受該基因的細(xì)胞一種特殊的性質(zhì)，該特殊的性質(zhì)使得接受該基因的細(xì)胞與未接受該基因的細(xì)胞很容易被區(qū)分開。由此，便于篩選接受構(gòu)建體的動物細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，篩選標(biāo)記基因的類型不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的一些示例，所述篩選標(biāo)記基因為藥物抗性基因。 由此，容易地通過接受外源構(gòu)建體的重組細(xì)胞的抗藥性來進(jìn)行篩選，例如在培養(yǎng)基中添加殺菌劑，則相應(yīng)連同載體接受并表達(dá)殺菌劑抗性基因的細(xì)胞將在培養(yǎng)基上能夠存活下來。 根據(jù)本發(fā)明的具體示例，所述篩選標(biāo)記基因為新霉素抗性基因。由此，能夠進(jìn)一步提高篩選接受外源構(gòu)建體的重組細(xì)胞的效率。上面對根據(jù)本發(fā)明實施例的構(gòu)建體進(jìn)行了描述。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的，構(gòu)建體還可以包含其他常規(guī)的元件以促進(jìn)構(gòu)建體被轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中并且整合到宿主細(xì)胞的基因組上，正常發(fā)揮功能，例如復(fù)制起點、多克隆位點等。在此對這些元件不再贅述。2、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、動物及其制備方法2. 1轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞或其培養(yǎng)物根據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞或其培養(yǎng)物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞的基因組中具有編碼突變型生長激素受體的核酸序列，其中，與野生型生長激素受體相比，所述突變型生長激素受體至少缺失胞內(nèi)區(qū)段的氨基酸序列。由此，該動物細(xì)胞或其培養(yǎng)物，可以作為細(xì)胞模型用于篩選能夠治療侏儒癥的藥物，另外，利用該轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞或其培養(yǎng)物，可以有效地獲得體型比野生型動物小的動物。這里所使用的術(shù)語“培養(yǎng)物”指的是，將轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞在適于生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)， 所得到的細(xì)胞衍生物，這些細(xì)胞衍生物具有與原始的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞相同的基因組。根據(jù)本發(fā)明的實施例，突變型生長激素受體所缺失的部分的具體氨基酸序列并不受特別限制，只要突變型生長激素受體活性低于野生型生長激素受體即可。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，對于來源于豬生長激素受體的突變型生長激素受體，與野生型生長激素受體相比，該突變型生長激素受體至少缺失由第9外顯子所編碼的氨基酸序列。優(yōu)選，與野生型生長激素受體相比，該突變型生長激素受體進(jìn)一步缺失由第10外顯子的至少一部分所編碼的氨基酸序列。更優(yōu)選，缺失由第9外顯子和大部分第10外顯子所編碼的氨基酸序列， 進(jìn)一步優(yōu)選，與野生型生長激素受體相比，該突變型生長激素受體缺失由第9和第10外顯子所編碼的氨基酸序列，換言之，突變型生長激素受體是由第2-8外顯子所編碼的氨基酸序列構(gòu)成的(第1號外顯子是非翻譯區(qū))。最優(yōu)選地，對于來源于豬生長激素受體的突變型生長激素受體，其氨基酸序列為如SEQ ID NO :1所示。根據(jù)本發(fā)明的實施例，與野生型生長激素受體相比，突變型生長激素受體還可以進(jìn)一步缺失由第8外顯子所編碼的氨基酸序列。本發(fā)明的發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過在動物例如豬中表達(dá)上述突變型生長激素，可以有效地獲得體型比野生型動物小的動物，并且不會影響轉(zhuǎn)基因動物的其他生理功能，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)基因動物的存活率。2. 2制備轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞的方法根據(jù)本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出了一種制備上述轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括以下步驟使用前面所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；以及分離轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞，其中，所述轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞的基因組中具有編碼突變型生長激素受體的核酸序列，與野生型生長激素受體相比，所述突變型生長激素受體至少缺失胞內(nèi)區(qū)段的氨基酸序列。利用該方法，能夠有效地制備前面所述的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞。從而可以獲得用于篩選能夠治療侏儒癥的藥物的細(xì)胞模型，或者進(jìn)一步利用該轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞或其培養(yǎng)物， 可以有效地獲得體型比野生型動物小的動物。在將上述制備轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞的方法應(yīng)用于動物例如豬的體細(xì)胞時，所得到的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，可以通過手工克隆的方法應(yīng)用于制備轉(zhuǎn)基因動物。根據(jù)本發(fā)明的一些示例，可以通過脂質(zhì)體法進(jìn)行所述轉(zhuǎn)化。由此，可以提高將構(gòu)建體引入宿主細(xì)胞中的效率。由此，可以方便地篩選目的核酸序列與宿主細(xì)胞的染色體成功地發(fā)生整合的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，由此，進(jìn)一步提高制備轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞的效率。需要說明的是， 在本文中所使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”與“轉(zhuǎn)染”是可以互換使用的，均是指將外源核酸序列引入宿主細(xì)胞中的操作。在分離轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞后，可以通過PCR方法驗證轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞的基因組中含有目的核酸序列。當(dāng)然也可以通過分析目的核酸序列表達(dá)蛋白的酶活性來驗證。但從效率角度來考慮，優(yōu)選通過PCR方法驗證，因而，根據(jù)本發(fā)明的實施例，還可以進(jìn)一步包括通過PCR方法驗證轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞的基因組中含有所述目的核酸序列的步驟。2. 3制備轉(zhuǎn)基因動物的方法根據(jù)本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提出了一種制備非人轉(zhuǎn)基因動物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括以下步驟首先，提取動物細(xì)胞的細(xì)胞核。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，能夠采用任何已知的方法提取單細(xì)胞的細(xì)胞核，例如通過顯微操作人工提取。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所采用的動物細(xì)胞可以是前面所得到的轉(zhuǎn)基因動物，即所述動物細(xì)胞的基因組中具有編碼突變型生長激素受體的核酸序列，與野生型生長激素受體相比，所述突變型生長激素受體至少缺失胞內(nèi)區(qū)段的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的實施例，突變型生長激素受體所缺失的部分的具體氨基酸序列并不受特別限制，只要突變型生長激素受體活性低于野生型生長激素受體即可。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，對于來源于豬生長激素受體的突變型生長激素受體，與野生型生長激素受體相比，該突變型生長激素受體至少缺失由第9外顯子所編碼的氨基酸序列。優(yōu)選，與野生型生長激素受體相比，該突變型生長激素受體進(jìn)一步缺失由第10外顯子的至少一部分所編碼的氨基酸序列。更優(yōu)選，缺失由第9外顯子和大部分第10外顯子所編碼的氨基酸序列，進(jìn)一步優(yōu)選，與野生型生長激素受體相比，該突變型生長激素受體缺失由第9和第10外顯子所編碼的氨基酸序列，換言之，突變型生長激素受體是由第2-8外顯子所編碼的氨基酸序列構(gòu)成的(第1號外顯子是非翻譯區(qū))。最優(yōu)選地，對于來源于豬生長激素受體的突變型生長激素受體，其氨基酸序列為如SEQ ID NO :1所示。根據(jù)本發(fā)明的實施例，與野生型生長激素受體相比，突變型生長激素受體還可以進(jìn)一步缺失由第8外顯子所編碼的氨基酸序列。本發(fā)明的發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過在動物例如豬中表達(dá)上述突變型生長激素，可以有效地獲得體型比野生型動物小的動物，并且不會影響轉(zhuǎn)基因動物的其他生理功能，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)基因動物的存活率。接下來，將分離的細(xì)胞核引入動物的無核卵母細(xì)胞中，以便獲得融合卵母細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，無核卵母細(xì)胞的來源并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述無核卵母細(xì)胞是通過手工克隆方法去除卵子中的遺傳物質(zhì)而獲得的。由此，可以提高獲得無核卵母細(xì)胞的效率，并且能夠提高接受外源細(xì)胞核的效率。最后，將所述融合卵母細(xì)胞在適宜的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，以便獲得所述非人轉(zhuǎn)基因動物，其中，所述動物細(xì)胞的基因組中具有編碼突變型生長激素受體的核酸序列，與野生型生長激素受體相比，所述突變型生長激素受體至少缺失胞內(nèi)區(qū)段的氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，能夠采用常規(guī)的方法，從卵母細(xì)胞獲得動物個體，例如首先將卵母細(xì)胞培養(yǎng)獲得囊胚，進(jìn)一步將囊胚植入母體中進(jìn)行發(fā)育，獲得動物個體。因而，這里所使用的術(shù)語 “培養(yǎng)”應(yīng)作廣義理解，其涵蓋了從卵母細(xì)胞獲得動物個體過程中所經(jīng)歷的各種為細(xì)胞/細(xì)胞集合體提供能量的操作。在本文中所使用的術(shù)語“適宜的條件”指的是任何能夠?qū)崿F(xiàn)“培養(yǎng)”的各種操作的條件。利用該方法，能夠有效地獲得小型化動物，從而可以適合作為寵物， 或者作為篩選治療侏儒癥藥物的動物模型。2. 4轉(zhuǎn)基因動物及其后代根據(jù)本發(fā)明的第七方面，本發(fā)明提出了一種非人轉(zhuǎn)基因動物或其后代。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述非人轉(zhuǎn)基因動物是根據(jù)前面所述的制備非人轉(zhuǎn)基因動物的方法獲得的。 該非人轉(zhuǎn)基因動物或其后代的體型比野生型動物要小，從而可以適合作為寵物，或者作為篩選治療侏儒癥藥物的動物模型。3、用途如前所述，根據(jù)本發(fā)明的實施例，前面所述的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞或其培養(yǎng)物、或前面所述的非人轉(zhuǎn)基因動物或其后代可以用作篩選藥物的動物模型，例如可以用于篩選治療侏儒癥的藥物。為此，根據(jù)本發(fā)明的第八方面，本發(fā)明提出了前面所述的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞或其培養(yǎng)物、或前面所述的非人轉(zhuǎn)基因動物或其后代在篩選治療侏儒癥的藥物中的用途。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)情況，選擇將上述動物模型或細(xì)胞模型用于篩選藥物的方法。例如，可以檢驗在給藥候選藥物前后，動物的發(fā)育速度變化，如果動物的發(fā)育速度得到提高，或者已經(jīng)停止發(fā)育的動物，其在接受給藥候選藥物之后，繼續(xù)發(fā)育生長，則可以作為該候選藥物為有效的治療侏儒癥的指示。另外，根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以通過判斷候選藥物對正常生長激素受體表達(dá)的作用，來確定候選藥物是否具有治療侏儒癥的功能。因而，根據(jù)本發(fā)明的第九方面，本發(fā)明提出了一種篩選治療侏儒癥的藥物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括下列步驟將前面所述的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞或其培養(yǎng)物、或前面所述的非人轉(zhuǎn)基因動物或其后代與藥物候選物接觸，并檢測與所述藥物候選物接觸前后，所述轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞或其培養(yǎng)物、或非人轉(zhuǎn)基因動物或其后代中野生型生長激素受體的表達(dá)量，以便分別獲得第一表達(dá)量和第二表達(dá)量；以及第二表達(dá)量高于第一表達(dá)量為所述藥物候選物為治療侏儒癥的藥物的指示。與藥物候選物接觸后，野生型生長激素受體的表達(dá)量比接觸前有所提高，可以確定該藥物候選物可以作為治療侏儒癥的藥物，因而利用該方法，能夠有效地篩選治療侏儒癥的藥物。通過該方法，篩選得到的藥物能夠通過提高野生型生長激素受體的表達(dá)量來治療侏儒癥。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“接觸”應(yīng)做廣義理解，只要能夠使得細(xì)胞模型或者動物模型可以攝入候選藥物即可。根據(jù)本發(fā)明的實施例，接觸的時間不受特別限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)具體的情況進(jìn)行確定。這里所使用的術(shù)語“治療”應(yīng)做廣義理解，可以包括預(yù)防性治療，也可以包括任何有助于緩解侏儒癥的處理方法。這里所使用的術(shù)語“侏儒癥”應(yīng)做廣義理解， 可以為動物個體尺寸小于常規(guī)尺寸的任何狀態(tài)。下面參考具體實施例，對本發(fā)明進(jìn)行說明，需要說明的是，這些實施例僅僅是說明性的，而不能理解為對本發(fā)明的限制。若未特別指明，實施例中所采用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，可以參照《分子克隆實驗指南》第三版或者相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行，所采用的試劑和產(chǎn)品也均為可商業(yè)獲得的。未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法，所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時標(biāo)明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同?！惴椒▓D1顯示了實施例的一般方法。即(1)構(gòu)建突變體GHR基因提取豬肝臟RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)Genbank已發(fā)表的豬GHR序列(NCBI索取號NM_214254)設(shè)計引物，在肝臟cDNA中擴(kuò)增出野生型GHR產(chǎn)物。將野生型GHR產(chǎn)物連入 T載體。設(shè)計突變體引物，從T載體上擴(kuò)增出不包含胞內(nèi)區(qū)段的GHR基因(胞內(nèi)區(qū)段缺失， 序列如SEQ ID NO 2所示)的突變體GHR產(chǎn)物。(2)構(gòu)建表達(dá)載體將突變體GHR基因插入到表達(dá)載體pCAG-MCS中，構(gòu)成過表達(dá)GHR突變體載體。(3)轉(zhuǎn)染豬成纖維細(xì)胞將所構(gòu)建的表達(dá)載體用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染豬成纖維細(xì)胞系。(4)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的篩選
利用G418篩選出陽性克隆。(5)利用手工克隆的方法構(gòu)建轉(zhuǎn)基因重構(gòu)胚。(6)成熟囊胚體外移植代孕母豬。(7) PCR檢測外源基因是否正常表達(dá)。分娩出小豬之后，待1個月左右取小豬耳朵建系，提RNA，利用PCR檢測是否表達(dá)突 變體GHR基因。本發(fā)明實施例中所用的材料pCAG-MCS-Neo骨架載體改造于pCDNA-3. 1 (+)(以pCDNA-3. 1 (+)為骨架，利用限制 性內(nèi)切酶Nru I和EcoR I將骨架載體中的CMV啟動子切掉，純化回收骨架載體，并利用限 制性內(nèi)切酶Nru I和EcoR I將CAG啟動子從pCAGGS載體上酶切下來，并利用T4連接酶， 將CAG啟動子連接到純化的骨架載體，經(jīng)鑒定后獲得pCAG-neo載體；然后在生物技術(shù)公司 合成一段包含 EcoR I、Age I、Afl II、BamH I、Nhe I、Kpn I、Hind III、Not I 等酶切位點 的寡核苷酸(5，-AATTCACCGGTCTTAAGGATCCGCTAGCGGTACCAAGCTTGC-3，),并侖名為多克降位 點(MCS)，雙鏈退火后，利用T4連接酶，將MCS連接到經(jīng)EcoRI和NotI酶切純化的pCAG-neo 載體上，獲得pCAG-MCS-Neo載體)。pCDNA-3. 1(+)來自 Invitrogen 公司
pIRES2-EGFP 骨架載體來自 Clontech 公司TA 克隆載體pMD 18-T Simple Vector 來自 TaKaRa 公司實施例1 制備轉(zhuǎn)基因pCAG-GHRdm巴馬豬和轉(zhuǎn)基因pCAG_GHRdm大白豬1、突變體GHR基因的構(gòu)建參考圖2，提取豬肝臟RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)Genbank已發(fā)表的豬GHR序列 (NCBI索取號匪214254)設(shè)計引物，在肝臟cDNA中擴(kuò)增出野生型GHR產(chǎn)物。將野生型GHR產(chǎn)物連入T載體。設(shè)計突變體引物，從T載體上擴(kuò)增出不包含9號 和10號外顯子的突變體GHR產(chǎn)物，并且在7號外顯子末端補充9號外顯子上游的12個核苷酸。用于擴(kuò)增的引物用于擴(kuò)增野生型GHR的弓丨物序列WGHRL 1:ATGGATCTCTGGCAGCTTCTGTTG(SEQ ID NO 3)WGHRRl :CTACGGCATGATTTTGTTCAGTTGG (SEQ ID NO :4)用于擴(kuò)增突變體GHR的引物序列
GHRLl TCGGAATTCACCGGTGCCACCATGGATCTCTGGCAGCTGCT ( SEQ ID NO: EcoRI酶切位點
GHRR2: CGGCTAGCTCAATTTTCCTTCCTTTGCTGTTTAG ( SEQ ID NO: 6)
個
NheI酶切位點2、構(gòu)建突變體 GHR 轉(zhuǎn)基因載體 pCAG-GHRdm-IRES-GFP-Neo
參考圖2，借助EcoRI酶切位點和NheI酶切位點，將突變體GHR基因插入到 pCAG-MCS-Neo 骨架載體中，構(gòu)成 ρCAG-GHRdm-Neο 載體。通過PCR擴(kuò)增反應(yīng)，從pIRES2-EGFP骨架載體上擴(kuò)增出IRES-EGFP序列。用于擴(kuò)增IRES-EGFP片段的引物如下
IRESGFPL1: GCTAGCGATCCGCCCCTCTCCCTCCCC ( SEQ ID NO: 7 )
個
NheI酶切位點
IRESGFPR1: CTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATG ( SEQ ID NO: 8 ) t
XhoI酶切位點然后借助BioI酶切位點和NheI酶切位點，將所得到的IRES-EGFP片段插入到 pCAG-GHRdm-Neo載體，最終構(gòu)建出pCAG-GHRdm-IRES_GFP-Neo載體。如此所得到的構(gòu)建體， 即表達(dá)載體，如圖3所示，含有CAG啟動子，突變體GHRdm(dm表示缺失胞內(nèi)端)序列，IRES 序列和報告基因GFP序列，并且?guī)в蠳eo基因(新霉素抗性基因)作為篩選標(biāo)記。3、轉(zhuǎn)染大白豬胚胎成纖維細(xì)胞系和巴馬豬耳源成纖維細(xì)胞系采用1月齡廣西巴馬香豬耳源組織，利用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)。將前述獲得的載體pCAG-GHRdm-IRES-GFP-Neo載體采用常規(guī)方法擴(kuò)增，最后利用無內(nèi)毒素試劑盒提取質(zhì)粒 (Endo-free plasimd Mini kit II, OMEGA D6948-01)。利用 FuGene HD 試劑轉(zhuǎn)染巴馬成纖維細(xì)胞系，試劑與質(zhì)粒的比值為6微升2微克。具體地，大白豬胚胎成纖維細(xì)胞系的建立過程如下1)取妊娠33天的大白豬，處死后取含胎兒的母體，包扎，2小時內(nèi)運往實驗室。2)在超凈工作臺上取出母豬子宮內(nèi)的胎兒(不要破壞羊膜)放入含有200IU/mL 青霉素和200 μ g/mL鏈霉素(IOx雙抗)的PBS液中，漂洗2_3遍。3)用滅菌眼科剪剪破羊膜使胎兒(體長5 6cm)流出，放入含100U/mL青霉素和 100 μ g/mL鏈霉素(lx雙抗)的PBS液中。用眼科剪剪去胎兒頭、內(nèi)臟、四肢，先后用含IOx 雙抗和Ix雙抗的PBS液漂洗2 3遍，再用無Ca2+、Mg2+的PBS溶液沖洗多遍，放入無菌玻璃平皿中待用。4)在直徑60mm的玻璃平皿中用眼科剪把組織剪碎成Imm3大小的組織塊，將組織塊移入組織培養(yǎng)瓶的底壁上，用吸管將組織塊均勻地鋪開，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使有組織塊的一面在上，加入5mL細(xì)胞培養(yǎng)液，放入37°C、5% C02、100%濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5)培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中6 他后(待組織塊完全貼于瓶底)，再慢慢翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶讓組織塊浸沒于含10% FBS (胎牛血清)的DMEM培養(yǎng)液中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2 3d換一次培養(yǎng)液，觀察時注意輕拿輕放，防止組織塊上浮漂動。具體地，巴馬豬耳源成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建過程如下將巴馬小豬耳部用肥皂水清洗一遍，將耳源處的毛用剃刀刮凈，用碘酊向一個方向擦洗約2 3分鐘，再用含75%酒精的棉球擦洗兩遍去除碘酊，用滅菌采耳鉗夾取耳源組織(約1. 5 2cm2)。將剪下部分放于含有Ix雙抗的DMEM(不含F(xiàn)BS)中。3小時之內(nèi)送往實驗室。余下步驟與大白胎豬成纖維細(xì)胞建系過程相同。4、陽性細(xì)胞系的篩選利用500μ g/ml濃度的G418進(jìn)行篩選，篩選1周后，出現(xiàn)陽性克隆，換200 μ g/ml 濃度G418維持。圖4顯示了篩選得到的陽性細(xì)胞系的顯微鏡照片，其中圖4A是在白光下放大40倍的照片，圖4B是在綠色激發(fā)光下放大100倍的照片。擴(kuò)大培養(yǎng)陽性克隆。提取陽性克隆的RNA進(jìn)行PCR鑒定。鑒定引物用擴(kuò)增突變體 GHR引物和野生型GHR引物，擴(kuò)增結(jié)果見圖5，其中，圖5A顯示了利用突變體GHR引物進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果，圖5B顯示了利用野生型GHR引物進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果。如圖5所示，陽性細(xì)胞系能擴(kuò)增出突變體GHR條帶，并且相應(yīng)的野生型GHR的條帶會減弱。選取表達(dá)突變體GHR基因并且野生型GHR表達(dá)下調(diào)的陽性細(xì)胞進(jìn)行手工克隆。需要說明的是，不同的細(xì)胞系G418的致死濃度不一樣，所以要先對細(xì)胞系做G418 致死濃度的測定，本實施例中的巴馬成纖維細(xì)胞系的G418致死濃度為500 μ g/ml。5、手工克隆獲得轉(zhuǎn)基因小豬具體流程如下獲得卵巢，收集卵子，并將其在改良的TL-Hepes-PVA緩沖液中清洗后，放入培養(yǎng)板中，在培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行未成熟卵細(xì)胞體外成熟(in vitro maturation, IVM)培養(yǎng)，得到成熟卵子。其中，改良的TL-H印es-PVA緩沖液的配方為(其中mol指mol/L) :114mol NaCl, 3. 2mol KC1、0. 34mol NaH2PO4UOmol 乳酸鈉、0. 50mol MgCl2 ·6Η20、IOmol H印es、0. 2mol 丙酮酸鈉、12mol 山梨醇、2mol Na2HCO3>2mol CaCl2 · 2Η20、0· 01% PVA。然后，將所得到的成熟卵子在顯微鏡下用小刀片去核，以便獲得成熟去核卵母細(xì)胞。挑取單個前面獲得的陽性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞(包含利用大白豬胎兒成纖維細(xì)胞和巴馬耳源成纖維細(xì)胞制備的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系)，利用融合儀電激將其融入到成熟去核卵母細(xì)胞中， 制成重構(gòu)胚。重構(gòu)胚放入培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)5 6天，形成成熟囊胚。對囊胚進(jìn)行體外移植， 共移植4頭代孕母豬。代孕母豬均為二元雜受體。妊娠114天之后，共產(chǎn)下7頭小豬。出生小豬建系觀察待小豬一個月大時，采尾部組織，建系(建系方法同巴馬豬耳源成纖維細(xì)胞系)觀察。建系結(jié)果見附圖6。圖6A是在白光放大100倍的照片，圖6B是在綠色激發(fā)光下放大 100倍的照片。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因小豬細(xì)胞系在綠光激發(fā)下呈綠色熒光，而非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系則不發(fā)光。PCR法檢測轉(zhuǎn)基因小豬按常規(guī)方法，從所得到的轉(zhuǎn)基因小豬提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR檢測細(xì)胞系是否表達(dá)突變體GHR基因，引物同擴(kuò)增突變體GHR引物。PCR循環(huán)參數(shù)為
權(quán)利要求
1.一種分離的突變型生長激素受體，其特征在于，與野生型生長激素受體相比，所述突變型生長激素受體至少缺失胞內(nèi)區(qū)段的氨基酸序列；任選地，與野生型生長激素受體相比，所述突變型生長激素受體至少缺失由第9外顯子所編碼的氨基酸序列，任選地進(jìn)一步缺失由第10外顯子的至少一部分編碼的氨基酸序列；任選地，與野生型生長激素受體相比，所述突變型生長激素受體進(jìn)一步缺失由第10外顯子所編碼的氨基酸序列，任選地，與野生型生長激素受體相比，所述突變型生長激素受體進(jìn)一步缺失由第8外顯子所編碼的氨基酸序列。
2.一種分離的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包含編碼權(quán)利要求1所述的分離的突變型生長激素受體的核酸序列。
3.一種構(gòu)建體，其特征在于，包含第一核酸分子，所述第一核酸分子包括編碼突變型生長激素受體的序列，其中，與野生型生長激素受體相比，所述突變型生長激素受體至少缺失胞內(nèi)區(qū)段的氨基酸序列，任選地，與野生型生長激素受體相比，所述突變型生長激素受體至少缺失由第9外顯子所編碼的氨基酸序列，任選地進(jìn)一步缺失由第10外顯子的至少一部分編碼的氨基酸序列；任選地，與野生型生長激素受體相比，所述突變型生長激素受體進(jìn)一步缺失由第10外顯子所編碼的氨基酸序列；任選地，與野生型生長激素受體相比，所述突變型生長激素受體進(jìn)一步缺失由第8外顯子所編碼的氨基酸序列任選地，所述構(gòu)建體進(jìn)一步包含啟動子序列，所述啟動子序列與所述第一核酸分子可操作地相連，優(yōu)選所述啟動子為CAG啟動子；任選地，所述構(gòu)建體進(jìn)一步包括第二核酸分子，所述第二核酸分子包括編碼內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點序列的序列；任選地，所述構(gòu)建體進(jìn)一步包括第三核酸分子，所述第三核酸分子包括編碼報告蛋白的序列，優(yōu)選地所述報告蛋白為發(fā)光蛋白，更優(yōu)選地所述報告蛋白為綠色熒光蛋白；任選地，所述構(gòu)建體進(jìn)一步包括篩選標(biāo)記基因，優(yōu)選地所述篩選標(biāo)記基因為藥物抗性基因，更優(yōu)選地所述藥物抗性基因為新霉素抗性基因；任選地，所述構(gòu)建體呈選自質(zhì)粒、噬菌體、人工染色體、粘粒以及病毒的至少一種的形式。
4.一種轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞或其培養(yǎng)物，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞的基因組中具有編碼突變型生長激素受體的核酸序列，其中，與野生型生長激素受體相比，所述突變型生長激素受體至少缺失胞內(nèi)區(qū)段的氨基酸序列；任選地，與野生型生長激素受體相比，所述突變型生長激素受體至少缺失由第9外顯子所編碼的氨基酸序列，任選地進(jìn)一步缺失由第10外顯子的至少一部分編碼的氨基酸序列；任選地，與野生型生長激素受體相比，所述突變型生長激素受體進(jìn)一步缺失由第10外顯子所編碼的氨基酸序列，任選地，與野生型生長激素受體相比，所述突變型生長激素受體進(jìn)一步缺失由第8外顯子所編碼的氨基酸序列。
5.一種制備權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟 使用權(quán)利要求3所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；以及分離轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞， 其中，所述轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞的基因組中具有編碼突變型生長激素受體的核酸序列，與野生型生長激素受體相比，所述突變型生長激素受體至少缺失胞內(nèi)區(qū)段的氨基酸序列；任選地，與野生型生長激素受體相比，所述突變型生長激素受體至少缺失由第9外顯子所編碼的氨基酸序列，任選地進(jìn)一步缺失由第10外顯子的至少一部分編碼的氨基酸序列，任選地，與野生型生長激素受體相比，所述突變型生長激素受體進(jìn)一步缺失由第10外顯子所編碼的氨基酸序列，任選地，與野生型生長激素受體相比，所述突變型生長激素受體進(jìn)一步缺失由第8外顯子所編碼的氨基酸序列。
6.一種制備非人轉(zhuǎn)基因動物的方法，其特征在于，包括以下步驟 提取動物細(xì)胞的細(xì)胞核；將所述細(xì)胞核引入所述動物的無核卵母細(xì)胞中，以便獲得融合卵母細(xì)胞；以及將所述融合卵母細(xì)胞在適宜的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，以便獲得所述非人轉(zhuǎn)基因動物， 其中，所述動物細(xì)胞的基因組中具有編碼突變型生長激素受體的核酸序列，與野生型生長激素受體相比，所述突變型生長激素受體至少缺失胞內(nèi)區(qū)段的氨基酸序列；任選地，與野生型生長激素受體相比，所述突變型生長激素受體至少缺失由第9外顯子所編碼的氨基酸序列，任選地進(jìn)一步缺失由第10外顯子的至少一部分編碼的氨基酸序列；任選地，與野生型生長激素受體相比，所述突變型生長激素受體進(jìn)一步缺失由第10外顯子所編碼的氨基酸序列，任選地，與野生型生長激素受體相比，所述突變型生長激素受體進(jìn)一步缺失由第8外顯子所編碼的氨基酸序列；任選地，所述無核卵母細(xì)胞是通過手工克隆方法去除卵子中的遺傳物質(zhì)而獲得的。
7.一種非人轉(zhuǎn)基因動物或其后代，其中所述非人轉(zhuǎn)基因動物是根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法獲得的。
8.權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞或其培養(yǎng)物、或權(quán)利要求7所述的非人轉(zhuǎn)基因動物或其后代在篩選治療侏儒癥的藥物中的用途。
9.一種篩選治療侏儒癥的藥物的方法，其特征在于，包括下列步驟檢測權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞或其培養(yǎng)物、或權(quán)利要求7所述的非人轉(zhuǎn)基因動物或其后代中野生型生長激素受體的表達(dá)量，以便獲得第一表達(dá)量；將所述轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞或其培養(yǎng)物、或非人轉(zhuǎn)基因動物或其后代與藥物候選物接觸， 并檢測與所述藥物候選物接觸后，所述轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞或其培養(yǎng)物、或非人轉(zhuǎn)基因動物或其后代中野生型生長激素受體的表達(dá)量，以便獲得第二表達(dá)量；以及第二表達(dá)量高于第一表達(dá)量為所述藥物候選物為治療侏儒癥的藥物的指示。
全文摘要
本發(fā)明涉及突變型生長激素受體及其應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明涉及分離的突變型生長激素受體、分離的寡核苷酸、構(gòu)建體、轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞或其培養(yǎng)物、制備轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞的方法、制備非人轉(zhuǎn)基因動物的方法、非人轉(zhuǎn)基因動物或其后代以及篩選治療侏儒癥的藥物的方法。其中，與野生型生長激素受體相比，所述突變型生長激素受體至少缺失胞內(nèi)區(qū)段的氨基酸序列。借助該突變型生長激素受體的表達(dá)，能夠有效地干擾動物生長軸通路，從而可以抑制動物的生長，使得動物的體型比野生型動物小。
文檔編號A01K67/027GK102558343SQ201110459720
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者戰(zhàn)麗萍, 方劍火, 李勇, 李飛達(dá), 杜玉濤, 楊煥明, 汪建, 牛玉娜, 王俊 申請人:深圳華大基因研究院, 深圳華大基因科技有限公司