專利名稱：一種長期培養(yǎng)無菌松苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及無菌松苗的培養(yǎng)方法，具體涉及一種長期培養(yǎng)無菌松苗的方法。
背景技術(shù)：
松材線蟲病，又稱為松樹萎蔫病，是松樹的一種毀滅性病害。國內(nèi)外許多學(xué)者對該病的病因及其致病機理進行了研究，但至今尚無定論。關(guān)于松材線蟲病的病原，目前主要存在兩種觀點。一種觀點認為松材線蟲是惟一病原。Mamiya (1972)用松材線蟲在林分中接種黑松和赤松，造成這兩種松樹死亡。 Kuroda等(199 研究了松樹線蟲侵入黑松后的擴散和其他微生物相的變化，發(fā)現(xiàn)接種一周后松樹體內(nèi)水分輸導(dǎo)受阻礙，但其微生物相和健康松樹的一樣，直至接種5周后，藍變菌 Cerattocystis spp.和細菌才開始增多。因此，認為接種松材線蟲能單獨引起松樹萎蔫，與其他微生物無關(guān)。上述研究結(jié)果表明松材線蟲可單獨引起松樹萎蔫，為松樹萎蔫病的病原。 另一種觀點認為松樹萎蔫是由松材線蟲和細菌共同引起的。Kawazu和Kaneko (1997)在無菌條件下用無菌松材線蟲接種30天苗齡的無菌赤松苗，松苗不死亡；而帶細菌的松材線蟲在同樣條件下，卻導(dǎo)致無菌松苗萎蔫枯死，因此認為細菌才是松材線蟲病的真正病原。洪英娣等(2003)和Han等(2003)用無菌松材線蟲或擬松材線蟲接種2個月生無菌黑松苗，未能使其褐變和枯萎；而用無菌松材線蟲和擬松材線蟲與分離自松材線蟲體表的細菌分別混合接種卻使黑松無菌苗發(fā)生枯萎，因此認為松苗萎蔫與所接種線蟲的種類無關(guān)，而是由其伴生細菌的種類所決定。^iao et al. (2003)在無菌條件下用松材線蟲體表細菌和無菌松材線蟲單獨接種4個月生無菌黑松苗，不能使松苗發(fā)病，但二者的混合物卻可使無菌苗萎蔫， 提出松萎蔫病是松材線蟲與細菌共同侵染引起的復(fù)合侵染病害的假說。從上述研究可以看出，認為松材線蟲是惟一病原的試驗寄主是自然條件下或溫室中的盆栽松苗或大樹，而另一種觀點所用試驗材料是廣4個月生、尚未完全木質(zhì)化的無菌幼嫩松苗。許多學(xué)者認為，幾個月生的幼嫩松苗與自然界感病松樹在結(jié)構(gòu)上差異較大，不一定能代表松樹對松材線蟲的反應(yīng)。為了了解無菌松材線蟲的致病性，Tamura (1983)曾用無菌松材線蟲于自然條件下接種3年生赤松，結(jié)果使其萎蔫枯死，枯萎率達90%。對此結(jié)果， Kawazu et al. (1998)認為，由于致病細菌在自然界中普遍存在，當(dāng)無菌松材線蟲重新感染上這些細菌時，從而又獲得致病性。綜上所述，在錯綜復(fù)雜的自然條件下對松苗或成年松樹進行接種，或在無菌條件下以生理和結(jié)構(gòu)上與成年松樹有很大差別的無菌幼苗進行試驗，均較難對松材線蟲或其伴生細菌的作用進行準確評價。為了準確研究松材線蟲及其伴生細菌與宿主松樹間的相互關(guān)系，要求研究者構(gòu)建一個新的測定體系，即在嚴格控制的無菌條件下，培育完全木質(zhì)化的無菌苗木進行接種試驗。然而，關(guān)于無菌松苗的培養(yǎng)，通常是將無菌萌發(fā)的幼苗接種于瓊脂固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。若想更換新鮮培養(yǎng)基，需將松苗從原有培養(yǎng)基中拔起，由于松苗的根系伸展于瓊脂固體培養(yǎng)基中，較難拔起，即使將其拔起，也很難再將幼苗移植于新鮮培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。所以，該方法通常只能培養(yǎng)幾十天到3、4個月，時間再長，幼苗常出現(xiàn)頂枯梢死的現(xiàn)象。這可能是由于培養(yǎng)基失水或由于松苗根系分泌物在培養(yǎng)基中堆積造成微環(huán)境不適所致。至今尚無長期培養(yǎng)無菌松苗的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種長期培養(yǎng)無菌松苗的方法，以實現(xiàn)為松材線蟲病相關(guān)研究提供一種簡易可行的制備多年生無菌松苗的方法。技術(shù)方案為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為 一種長期培養(yǎng)無菌松苗的方法，包括以下步驟
(1)制備PDA平板備用；
(2)制備無菌松樹成熟種子，移入PDA瓊脂平板，250C，培養(yǎng)至萌發(fā)，獲得無菌幼苗；
(3)制備DCR液體培養(yǎng)基，pH5.8，分裝于培養(yǎng)容器；
(4)在底部帶小孔容器底部墊上脫脂棉，上部填入珍珠巖，將該容器置于盛有DCR液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器中，121°C高壓滅菌，備用；
(5)將無菌幼苗移植于珍珠巖中，于溫度24 26°C、光照2000Lux、每日光照14 18h條件下培養(yǎng)，定期更換DCR新鮮培養(yǎng)液，直至獲得所需年齡的無菌松苗。步驟(2)中，制備無菌松樹成熟種子的方法為取松樹成熟種子，用洗潔精將其表面洗凈，0. 1%高錳酸鉀浸泡12h，流水沖洗lh，在無菌條件下剝除種殼，用無菌紗布包裹去殼種子，置于70%乙醇表面消毒3(T3k后再用0. 1%升汞處理3、min，用無菌水沖洗3、 次。步驟(3)中，分裝于培養(yǎng)容器，每個容量為3(T40mL。步驟(5)中，定期更換為每1個半月到2個半月更換一次。有益效果本發(fā)明的培育無菌松苗的方法，先將無菌萌發(fā)的幼苗植入裝載于底部帶孔的小燒杯的珍珠巖中，再將小燒杯連同幼苗置于盛營養(yǎng)液的容器中，培養(yǎng)一段時間后可重新將小燒杯及其承載的幼苗轉(zhuǎn)入新鮮營養(yǎng)液中，達到長期培養(yǎng)的目的。小燒杯底部打孔可使營養(yǎng)液從底部滲入燒杯中，小燒杯底部鋪墊的脫脂棉可以幫助持有營養(yǎng)液并防止珍珠巖落入營養(yǎng)液中。珍珠巖疏松，有利于根系在其中伸展；同時該基質(zhì)透水、質(zhì)量較輕，便于在無菌條件下用鑷子夾取整個小燒杯進行轉(zhuǎn)移。多次重復(fù)轉(zhuǎn)接結(jié)果表明，采用該培養(yǎng)方法對無菌松苗進行轉(zhuǎn)移不會對其根系或上部組織造成傷害，無菌松苗可在無菌的容器中茁壯生長，是一種簡易且成功的長期培養(yǎng)無菌松苗的方法。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例來解釋本發(fā)明。以下實施例中，PDA瓊脂平板和DCR營養(yǎng)液均為常規(guī)培養(yǎng)基，具體參照生物學(xué)實驗手冊。實施例1
取馬尾松成熟種子，用洗潔精將其表面洗凈，0. 1%高錳酸鉀浸泡12h，流水沖洗lh，在無菌條件下剝除種殼，用無菌紗布包裹去殼種子，置于70%乙醇表面消毒3(T3k后再用 0. 1%升汞處理3、min，用無菌水沖洗3飛次后，移入PDA瓊脂平板中，置于25°C條件下培養(yǎng)。5 7天后于無菌條件下將無菌萌發(fā)的幼苗植入裝載于底部帶孔的小燒杯的無菌珍珠巖中，再將小燒杯連同幼苗置于盛無菌DCR營養(yǎng)液的容器中，置于溫度M 26 V，光照2000 Lux、每日光照16 h的條件下培養(yǎng)。每2個月后將小燒杯及其承載的幼苗重新轉(zhuǎn)入新鮮營養(yǎng)液中。經(jīng)4次轉(zhuǎn)移，即約經(jīng)8個月生長后，平均苗高15. 2cm。實施例2
取黑松成熟種子，用洗潔精將其表面洗凈，0. 1%高錳酸鉀浸泡12h，流水沖洗lh，在無菌條件下剝除種殼，用無菌紗布包裹去殼種子，置于70%乙醇表面消毒3(T3k后再用0. 1% 升汞處理3、min，用無菌水沖洗3飛次后，移入PDA瓊脂平板中，置于25°C條件下培養(yǎng)。5 7 天后于無菌條件下將無菌萌發(fā)的幼苗植入裝載于底部帶孔的小燒杯的無菌珍珠巖中，再將小燒杯連同幼苗置于盛40mL無菌DCR營養(yǎng)液的容器中，置于溫度M 26 °C，光照2000 Lux、 每日光照18 h的條件下培養(yǎng)。每2個半月后將小燒杯及其承載的幼苗重新轉(zhuǎn)入新鮮營養(yǎng)液中。經(jīng)5次轉(zhuǎn)移，即約經(jīng)10個月生長后，平均苗高17. 2cm。綜上所述，本發(fā)明利用底部帶孔的小燒杯為載體，通過將無菌幼苗移植于其中的珍珠巖基質(zhì)中，再將小燒杯及其承載的幼苗置于盛有無菌營養(yǎng)液的容器中進行培養(yǎng)。在經(jīng)過一段時間培養(yǎng)后，可將小燒杯及其承載的幼苗重新轉(zhuǎn)移至新鮮營養(yǎng)液中，克服了在瓊脂固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)對松苗進行繼代培養(yǎng)所帶來的不便，容易達到長期無菌培養(yǎng)的目標。
權(quán)利要求
1.一種長期培養(yǎng)無菌松苗的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)制備PDA平板備用；(2)制備無菌松樹成熟種子，移入PDA瓊脂平板，250C，培養(yǎng)至萌發(fā)，獲得無菌幼苗；(3)制備DCR液體培養(yǎng)基，pH5.8，分裝于培養(yǎng)容器；(4)在底部帶小孔容器底部墊上脫脂棉，上部填入珍珠巖，將該容器置于盛有DCR液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器中，121°C高壓滅菌，備用；(5)將無菌幼苗移植于珍珠巖中，于溫度M 26°C、光照2000Lux、每日光照14 18h條件下培養(yǎng)，定期更換DCR新鮮培養(yǎng)液，直至獲得所需年齡的無菌松苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的長期培養(yǎng)無菌松苗的方法，其特征在于步驟(2)中，制備無菌松樹成熟種子的方法為取松樹成熟種子，用洗潔精將其表面洗凈，0. 1%高錳酸鉀浸泡 12h，流水沖洗lh，在無菌條件下剝除種殼，用無菌紗布包裹去殼種子，置于70%乙醇表面消毒3(T3k后再用0. 1%升汞處理3、min，用無菌水沖洗3飛次。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的長期培養(yǎng)無菌松苗的方法，其特征在于步驟(3)中，分裝于培養(yǎng)容器，每個容量為3(T40mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的長期培養(yǎng)無菌松苗的方法，其特征在于步驟(5)中，定期更換為每1個半月到2個半月更換一次。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種長期培養(yǎng)無菌松苗的方法，包括(1)制備PDA平板備用；(2)制備無菌松樹成熟種子，移入PDA瓊脂平板，25℃，培養(yǎng)至萌發(fā)，獲得無菌幼苗；(3)制備DCR液體培養(yǎng)基，pH5.8，分裝于培養(yǎng)容器；(4)在底部帶小孔容器底部墊上脫脂棉，上部填入珍珠巖，將該容器置于盛有DCR液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器中，121℃高壓滅菌，備用；(5)將無菌幼苗移植于珍珠巖中，于溫度24~26℃，光照2000Lux、每日光照14~18h條件下長期培養(yǎng)，定期更換新鮮培養(yǎng)液，直至獲得所需年齡的無菌松苗。本發(fā)明的培育無菌松苗的方法，經(jīng)多次重復(fù)轉(zhuǎn)接結(jié)果表明，采用該培養(yǎng)方法對無菌松苗進行轉(zhuǎn)移不會對其根系或上部組織造成傷害，無菌松苗可在無菌的容器中茁壯生長，是一種簡易且成功的長期培養(yǎng)無菌松苗的方法。
文檔編號A01G31/00GK102487822SQ201110388418
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月30日
發(fā)明者葉建仁, 吳小芹, 安會翠, 朱麗華, 李清清 申請人:南京林業(yè)大學(xué)