專(zhuān)利名稱(chēng)：超旱生植物準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆DREB轉(zhuǎn)錄因子EsDREB及編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種超旱生植物準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆DREB轉(zhuǎn)錄因子EsDREB及編碼基因，利用該基因在提高酵母抗旱、耐低溫及高溫脅迫等抗逆性方面的應(yīng)用，屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
干旱是限制植物生長(zhǎng)發(fā)育和作物產(chǎn)量的主要因素，每年導(dǎo)致作物減產(chǎn)達(dá)50%以上。植物耐旱性大多屬于多基因控制的數(shù)量性狀，利用常規(guī)育種方法改良作物的抗旱性受到周期長(zhǎng)、優(yōu)異種質(zhì)資源缺乏的限制。近年來(lái)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)和基因表達(dá)調(diào)控的研究初步揭示了植物干旱脅迫的作用分子機(jī)理。目前，利用干旱脅迫相關(guān)基因提高植物的抗旱能力，已經(jīng)成為植物抗逆分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)和植物抗逆基因工程重要的研究方向。DREB 轉(zhuǎn)錄因子(Dehydration Responsive Element Binding protein)，艮口干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白，屬于AP2/EREBP類(lèi)基因家族，特異存在于植物中。DREB與抗逆基因啟動(dòng)子區(qū)域中的DRE/CRT (dehydration-responsive element)順式作用元件結(jié)合，其核心序 TACCGACAT，啟動(dòng)下游一系列的有DRE順式作用元件的抗逆基因的表達(dá)，廣泛參與干旱、高鹽，熱等脅迫應(yīng)答反應(yīng)，從而能從整體上提高植物的抗逆性。自1994年Yamaguchi-Siinozaki從擬南芥中首次檢測(cè)到DRE作用的蛋白因子并命名為DREBl到1997年Mockinger等首次從擬南芥cDNA文庫(kù)中克隆到AtCBFl以來(lái)， DREB/CBF轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆一直是植物分子生物學(xué)的熱點(diǎn)。目前已從擬南芥、水稻、玉米、小麥、黑麥、大豆、西紅菜，棉花，蘆薈等幾十種植物中分離并鑒定出調(diào)控干早、高鹽及低溫耐性的DREB基因，并利用這些基因得到了抗逆性增強(qiáng)的擬南芥、煙草、油菜、西紅柿、小麥等轉(zhuǎn)基因植株。但目前關(guān)于DREB的研究主要集中于草本植物領(lǐng)域，對(duì)于木本植物研究較少。由于木本植物生命周期長(zhǎng)，并且其抵御外界不良環(huán)境侵害的因素會(huì)多于草本植物，注定其分子機(jī)制更為復(fù)雜。對(duì)木本植物DREB的研究主要以楊樹(shù)為主，包括:Wang等Q008)從河北楊中分離出2個(gè)CBF，其功能待進(jìn)一步研究；Chen等Q009)利用35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的胡楊PeDREB2基因轉(zhuǎn)入煙草內(nèi)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株的抗寒性明顯增加；陳金煥等Q010)從胡楊中分離出2個(gè)編碼DREB2類(lèi)蛋白基因，酵母單雜交試驗(yàn)證明這兩個(gè)基因具有轉(zhuǎn)錄活性；^lou 和Li (2010)利用RT-PCR手段克隆得到1個(gè)毛白楊CBF基因，研究證明該基因在植物適應(yīng)寒冷和干旱的過(guò)程中可能有著重要作用。另外，有關(guān)DREB/CBF類(lèi)抗逆境轉(zhuǎn)錄因子DREB的功能及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究大部分來(lái)自模式植物擬南芥及經(jīng)濟(jì)作物水稻，小麥等，而對(duì)自然界天然存在的抗逆能力極強(qiáng)的植物資源卻嘗試較少，近幾年來(lái)，一些學(xué)者開(kāi)始在一些天然的抗逆植物資源中挖掘基因資源， 并取得了一些綜合抗逆能力很強(qiáng)的DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，如鹽生植物二色補(bǔ)血草(Qiaoying Ban，2011)，海篷子(Kapil Gupta，2010)，荒漠旱生植物資源如檸條錦雞兒(Xuemin Wang， 2010)及苔蘚類(lèi)植物小立碗蘚(Ning Liu，2007)，其中從二色補(bǔ)血草中克隆的LbDREB基因除了常見(jiàn)的抗鹽等抗性外，還表現(xiàn)出了很強(qiáng)的抗重金屬能力。綜上，植物中還存在大量的DREB基因及其家族尚待挖掘和研究。尤其從極端抗旱的超旱生木本資源植物中克隆DREB基因并進(jìn)行抗逆育種尚鮮見(jiàn)報(bào)道。而從本土抗逆植物資源中克隆抗逆相關(guān)基因并改良農(nóng)作物不失為一種新的嘗試。因此，從本土超旱生荒漠植物中尋找新的DREB轉(zhuǎn)錄因子，在基因工程水平上培育抗旱，耐低溫，耐高鹽等新的作物品種具有重要意義。準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆(Eremosparton songoricum(Litv. ) Vass.)系豆科無(wú)葉豆屬超旱生無(wú)葉灌木，僅片斷化分布于新疆古爾班通古特沙漠流動(dòng)沙丘上，是典型的流沙先鋒植物。該種是我國(guó)的單屬種植物類(lèi)群，西北荒漠植被中的標(biāo)志性種，稀有種。由于長(zhǎng)期生活在極端惡劣的流動(dòng)沙丘環(huán)境中，沙漠干旱、少雨、大風(fēng)、沙埋等環(huán)境塑造了準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆抗旱的形態(tài)學(xué)及生理學(xué)特性，表現(xiàn)在該種為小半灌木，葉極端退化，以營(yíng)養(yǎng)枝執(zhí)行光合作用，故稱(chēng)“無(wú)葉豆”;具有超強(qiáng)的根吸水能力以及細(xì)胞持水能力，并保持高效的光合能力。此外，長(zhǎng)期的環(huán)境壓力使得該種具有抗旱，抗高溫，抗風(fēng)蝕沙埋等抵抗多種非生物脅迫的能力，其體內(nèi)必定蘊(yùn)含著豐富的抗逆基因資源。準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆作為天然抗逆性極強(qiáng)的典型荒漠沙生植物，開(kāi)展該種的抗旱相關(guān)DREB轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆，對(duì)于深入理解該種的耐旱機(jī)理及開(kāi)發(fā)利用抗逆基因資源，定向培育植物新品種均有重要價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的在于為了解決目前可利用的DREB轉(zhuǎn)錄因子比較少的問(wèn)題， 提供一種超旱生沙漠植物準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆DREB轉(zhuǎn)錄因子&DREB基因，其氨基酸序列由SEQ ID NO 3 所示。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種編碼準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆DREB轉(zhuǎn)錄因子EsDREB的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于，所述準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆DREB轉(zhuǎn)錄因子基因在培育抗逆生物，尤其是抗非生物脅迫生物品種中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的一種超旱生植物準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆DREB轉(zhuǎn)錄因子EsDREB，它具有SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列，其中轉(zhuǎn)錄因子&DREB為207個(gè)氨基酸。所述的準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆DREB轉(zhuǎn)錄因子EsDREB的基因，該基因?yàn)楹塑账嵝蛄蠸EQ ID NO 2所示，其中基因編碼區(qū)長(zhǎng)為624bp。將所示的核苷酸序列按常規(guī)方法進(jìn)行酵母表達(dá)載體構(gòu)建，酵母表達(dá)載體導(dǎo)入宿主，其中宿主為酵母菌株INV&1，得到具備抗逆能力的轉(zhuǎn)EsDREB基因的轉(zhuǎn)化體的功能測(cè)
試ο該基因在制備植物抗逆性育種和改良的用途。本發(fā)明為植物準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆DREB轉(zhuǎn)錄因子EsDREB的基因，具體方法為取光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的兩周大準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆幼苗，以20%聚乙二醇6000處理4h 后取樣，提取總RNA;用總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板PCR擴(kuò)增得到DRra轉(zhuǎn)錄因子基因， 命名為&DREB ；構(gòu)建&DREB酵母表達(dá)載體pbridge，轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109，利用該系統(tǒng)驗(yàn)證該轉(zhuǎn)錄因子基因的轉(zhuǎn)錄激活活性；構(gòu)建EsDREB植物表達(dá)載體pBI221，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，觀察該轉(zhuǎn)錄因子基因的亞細(xì)胞定位情況；構(gòu)建&DREB酵母表達(dá)載體PYES2，轉(zhuǎn)化酵母菌株INVkl，用酵母體系驗(yàn)證該轉(zhuǎn)錄因子基因的功能。本發(fā)明以超旱生沙漠植物準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆為材料，克隆了一種DREB轉(zhuǎn)錄因子基因 EsDREB，并對(duì)該基因的轉(zhuǎn)錄激活活性和亞細(xì)胞定位進(jìn)行了研究。同時(shí)，利用酵母表達(dá)體系驗(yàn)證了該轉(zhuǎn)錄因子基因具有抗旱，低溫和高溫脅迫的能力。本發(fā)明所述的植物準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆DREB轉(zhuǎn)錄因子&DREB的基因?yàn)镾EQ ID NO 1 EsDREB基因的AP2保守域的核苷酸序列TGAAACACTGGCAAAATGGATAGAGTATAATGCCCGGCTTGAATCGGGTAATGAAGCCGAGAAGCCGGT TAGGAAAGTTCCTGCCAAGGGATCAAAAAAGGGGTGTATGAAAGGTAAAGGAGGACCCGAGAATTCGCGCTGTAACT ACAGAGGTGTTAGGCAAAGGACTTGGGGCAAGTGGGTTGCTGAGATTCGAGAGCCAAACAGAGGGAATAGGCTCTGG TTGGGGACGTTTTCGAATGCAGTTGGCGCTGCTCTTGCATATGACGAAGCTGCTATGGCTATGTATGGSEQ ID NO 2 EsDREB基因的核苷酸序列TTCTTCCTCAAATGCCTTCTGGGTCGTTCTTCTTTCGATCCAGCTTGGGATTATTTTGCCAGCAAATTA GGTATTTGTTTCAACTATTTTATTGATTGACATTTTCCCTGTATATAATMATGAGTGCAACTTGCATGCACAAGTT AGTGAAAAATCACAACAAAGGGGATGCATCTAAGTCCCTGGCCGATACATTGGCAAGATGGAAAGAGTATAATGCCC GGCTTGAATTGAGTAATGAAGCCGAGAAGCCTGTTAGGAAAGTTCCTGCCAAGGGATCAAAAAAGGGGTGTATGAAA GGTAAAGGAGGACCCGAGAATTCGCGCTGTAACTACAGAGGTGTTAGGCAAAGGACTTGGGGCAAGTGGGTTGCTGA GATTCGAGAGCCAAACAGAGGGAATAGGCTCTGGTTGGGGACGTTTTCGAATGCAGTTGGCGCTGCTCTTGCTTATG ATGAAGCTGCAAGGGCAATGTATGGTTCTTGTGCGCGCCTCAACTTTCCCAATGTACA AGTTTCCAATTTCTCTCA GCTGGAAGCTTCAAAAGCTTCTCCAGCCGGCTCTGCGATGGTAATATCAGAGAATACCGAGTCCATGATATTGCCAA ACAACTCGGGGGTAGATGCAACTGAAGATGTTGACATGGAACGTCTTTCATTATCGCTAAGCGTGGCTGTGAATCAT GAGGAAGGGGAGGGTGACTCAGGGTCAGGGACCAGTTCCTCCGATCCTTCATTGTCTTGATGTAAGTTTTGCATSEQ ID NO 3 EsDREB基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列MSATCMHKLVKNHNKGDASKSLADTLARWKEYNARLELSNEAEKPVRKVPAKGSKKGCMKGKGGPENSR CNYRGVRQRTWGKWVAEIREPNRGNRLWLGTFSNAVGAALAYDEAARAMYGSCARLNFPNVQVSNFSQLEASKASPA GSAMVISENTESMILPNNSGVDATEDVDMERLSLSLSVAVNHEEGEGDSGSGTSSSDPSLS


圖1為本發(fā)明準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆DREB基因RT-PCR擴(kuò)增電泳圖，其中泳道1 :cDNA為模板的擴(kuò)增；泳道2 =DNA為模板的擴(kuò)增；泳道M 分子量MakerDL2000圖2為本發(fā)明EsDREB轉(zhuǎn)錄因子基因序列分析圖，其中AP2保守結(jié)構(gòu)域用下劃線(xiàn)標(biāo)注，保守的第14位的纈氨(V14)和第19位的谷氨酰胺(E19)位點(diǎn)用方框標(biāo)出。圖3為本發(fā)明EsDREB轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄激活活性實(shí)驗(yàn)的染色結(jié)果圖，其中a示意圖中 1,2,3分別代表未連接基因的pYES2空載，帶目的片段EsDREB基因的pYES2_EsDREB和帶有擬南芥AtDREB基因的pYES2-AtDREB重組載體；b是以上三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞 INVScl菌株并涂布在色氨酸、組氨酸缺陷型(SD/His-Trp)培養(yǎng)基上的篩選情況；c是以上三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞INVScl菌株后，陽(yáng)性菌落經(jīng)β -半乳糖苷酶顯色分析結(jié)果； d是以上三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞INVScl菌株后，菌液經(jīng)半乳糖苷酶顯色分析結(jié)^ ο圖4為本發(fā)明EsDREB轉(zhuǎn)錄因子在植物細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位分析的激光共聚焦顯微鏡觀察圖，其中a，b，c分別為暗視野觀察，亮視野觀察和疊加效果，且圖的上半部分為帶 EsDREB基因的pBI221-EsDREB重組載體在洋蔥表皮細(xì)胞的瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果，圖的下半部分表示pBI221空載在洋蔥表皮細(xì)胞的瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果。圖5為本發(fā)明重組載體pYES2_EsDREB轉(zhuǎn)化酵母菌株INVkl的菌液PCR圖，其中 M泳道為分子量Maker DL2000,泳道1為PCR的NTC陰性對(duì)照，泳道2為pYES2空載，泳道 3-6是帶檢測(cè)的轉(zhuǎn)化子，泳道7為帶EsDREB目的片段的陽(yáng)性質(zhì)粒。圖6為本發(fā)明INVk 1-pYES2_EsDREB重組酵母質(zhì)粒成功構(gòu)建的雙酶切圖，其中 1為陽(yáng)性質(zhì)粒，2-5為以上四個(gè)經(jīng)菌液PCR鑒定為陽(yáng)性的酵母轉(zhuǎn)化子，M為分子量Maker DL2000。圖7為本發(fā)明轉(zhuǎn)EsDREB轉(zhuǎn)錄因子基因的酵母菌在無(wú)脅迫條件和干旱脅迫下的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，其中a為無(wú)脅迫條件下的空載質(zhì)粒PYES2 (上)和帶目的片段的重組載體 pYES2-EsDREB (下)的生長(zhǎng)情況；b是2M山梨醇模擬干旱脅迫條件下兩者的生長(zhǎng)情況。圖8為本發(fā)明轉(zhuǎn)&DREB轉(zhuǎn)錄因子基因的酵母菌在低溫，高溫脅迫下的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，其中a為低溫脅迫)，b為高溫脅迫(42°C )
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述。下列實(shí)施例中，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行，如《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(F. M奧斯伯，R.E.金斯頓，J. G塞德曼主編，馬學(xué)軍，舒躍龍譯，北京 科學(xué)出版社，2004)中所述的方法進(jìn)行實(shí)施例1 準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆中DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子&DREB的克隆植物材料的獲得本試驗(yàn)中的最初植物材料均為室內(nèi)光照培養(yǎng)箱內(nèi)萌發(fā)的兩周大準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆幼苗，準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆種子在播種前用濃度98%硫酸處理10-15min，清水沖洗5次，播種于兩層濾紙的玻璃培養(yǎng)皿中，溫度25°C，iai/d照光培養(yǎng)，每隔一天添加蒸餾水，兩周后收獲幼苗并用20 %聚乙二醇6000模擬干旱脅迫，處理無(wú)葉豆幼苗，處理4小時(shí)后，用蒸餾水沖洗干凈植物材料并立即置于液氮中凍存，之后轉(zhuǎn)移至溫度-80°C超低溫冰箱中保存；準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄RNA提取用TAKARA的RNAiso reagent試劑，具體步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)測(cè)定后，完整性和純度都較好的RNA樣本可用于下游反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，用1 μ g RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄試劑是TAKARA的I^rimei^cript RT-PCR試劑盒，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)如下5XPrimeScript Buffer 4μ 1PrimerScript 反轉(zhuǎn)錄酶混合液1 μ 1Oligo dT 引物(50μΜ) 1 μ 1
總RNA IUg去 RNA 酶的水up to 20 μ 1反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為溫度37 °C，時(shí)間30min ；溫度85 °C，時(shí)間k ；cDNA全長(zhǎng)序列的獲得基因保守片段的簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增根據(jù)DREB轉(zhuǎn)錄因子家族的AP2保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)保守片段擴(kuò)增的簡(jiǎn)并引物，引物序列見(jiàn)下表的P5，P3引物對(duì)
權(quán)利要求
1.一種超旱生植物準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆DREB轉(zhuǎn)錄因子^^1 8，其特征在于它具有SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列，其中轉(zhuǎn)錄因子&DREB為207個(gè)氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆DREB轉(zhuǎn)錄因子&DREB的基因，其特征在于該基因?yàn)楹塑账嵝蛄蠸EQ ID NO 2所示，其中基因編碼區(qū)長(zhǎng)為624bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于將所示的核苷酸序列按常規(guī)方法進(jìn)行酵母表達(dá)載體構(gòu)建，酵母表達(dá)載體導(dǎo)入宿主，其中宿主為酵母菌株INVkl，得到具備抗逆能力的轉(zhuǎn)EsDREB基因的轉(zhuǎn)化體的功能測(cè)試。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于該基因在制備植物抗逆性育種和改良的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子EsDREB基因及其應(yīng)用，所述蛋白具有SEQ ID No3所示的氨基酸序列，該基因編碼區(qū)長(zhǎng)為624bp，編碼207個(gè)氨基酸，亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明該基因定位在細(xì)胞核，酵母單雜交實(shí)驗(yàn)證明，該基因作為轉(zhuǎn)錄因子具有轉(zhuǎn)錄激活活性。同時(shí)，轉(zhuǎn)化該基因的酵母菌在干旱，冷，熱脅迫下的存活率都高于對(duì)照非轉(zhuǎn)基因酵母菌，說(shuō)明沙漠植物準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆的DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子基因EsDREB具有非生物脅迫的抗性。本發(fā)明可以用于作物非生物脅迫轉(zhuǎn)基因育種研究。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102424702SQ20111037796
公開(kāi)日2012年4月25日 申請(qǐng)日期2011年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月24日
發(fā)明者張遠(yuǎn)明, 張道遠(yuǎn), 李小雙, 楊紅蘭, 蔡明 , 裴金玲 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所