專利名稱：大果紅花油茶組織培養(yǎng)快速繁殖的育苗方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種珍稀食用植物油種苗繁育方法，具體地說，涉及一種大果紅花油茶的組織培養(yǎng)快速繁殖的育苗方法。
背景技術(shù)：
大果紅花油茶屬山茶科山茶屬，為常綠小喬木，每年12月至次年3月開花，花果大，是生產(chǎn)食用油、觀賞植物和荒山綠化的優(yōu)良樹種；秋季采果榨油。大果紅花油茶經(jīng)濟(jì)價(jià)值大，全樹是寶。油茶果實(shí)，是由果殼、種殼、種仁組成，比例為63. 64 14.38 21. 98，單果重在0. 5 1. 5公斤，干籽出油率在50 62%，樹木葉片大而厚常綠，有利于涵養(yǎng)水源、保護(hù)生態(tài)環(huán)境。果殼可提取栲膠，制糠醛、碳酸鉀、活性炭、木糠醇等，還可以與鋸木屑搭配可做成食用菌培養(yǎng)基質(zhì)。茶餅是油茶籽加工后的殘?jiān)?，可提取粗茶油，提皂素，還應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、化肥、有機(jī)肥、飼料。茶油是天然木本油料之一，生長(zhǎng)于野外山地，可不施任何化肥農(nóng)藥，不含普通茶油中的芥酸，不含豆油、花生油中的黃曲霉素、不含動(dòng)物油中的高膽固醇，屬純天然綠色食品。精制茶油已被國內(nèi)外營養(yǎng)學(xué)界、醫(yī)療界廣泛公認(rèn)富含油酸和亞油酸，富含多種氨基酸和維生素，對(duì)肝炎、高血壓、肥胖癥、心腦血管、動(dòng)脈硬化、哮喘、胃潰瘍等疾病具有療效，長(zhǎng)期食用有提高人體機(jī)能、延年益壽等功效， 被譽(yù)為“油中之王”，成為最新的高級(jí)烹調(diào)食用油。是食、藥并用的保健佳品。由于普通油茶分布范圍廣，油茶果小，結(jié)實(shí)率低，出油低，多含多酚、芥酸等不良物質(zhì)；傳統(tǒng)繁殖方法用實(shí)生苗和嫁接苗，育苗時(shí)間要2 3年，開花掛果投產(chǎn)慢，實(shí)生苗要種植 10 15年才能開花掛果，嫁接苗也要6 7年才開花掛果。采用藤縣天平鎮(zhèn)羅漫村大果紅花油茶原種源(原產(chǎn)地)作外植體進(jìn)行組織細(xì)胞培養(yǎng)，培育成小苗，再培育成可移栽的中苗，本方法具有繁殖快，增殖達(dá)3倍以上，3 8個(gè)月可以成苗；移栽成活率高；基因不變異， 能保持原來品種的優(yōu)良性狀；開花掛果快；出油高，油質(zhì)優(yōu)；豐產(chǎn)期長(zhǎng)等特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種通過組織培養(yǎng)技術(shù)可以脫除多種植物病毒，避免病毒引起的品種退化和減產(chǎn)造成的損失，使原來的優(yōu)良種性得到保持；繁殖快且量大、成苗快、 種苗品質(zhì)好、移栽成活率高，品種遺傳物質(zhì)變異小，開花掛果快、出油高、油質(zhì)優(yōu)、豐產(chǎn)期長(zhǎng)的大果紅花油茶的種苗繁殖方法。本發(fā)明人通過選定的大果紅花油茶樹芽苞和葉片作為外植體，經(jīng)消毒去掉雜質(zhì)， 將芽尖組織和葉片放在分化培養(yǎng)基上進(jìn)行無菌培育成小植株，將誘導(dǎo)出的小植株切割后接入新的分化培養(yǎng)基中，多次繼代采用分化培養(yǎng)，結(jié)果叢生芽數(shù)量多，生長(zhǎng)快。再轉(zhuǎn)移到壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成袋裝苗，經(jīng)過自然光照下煉苗后出袋栽培，移栽到營養(yǎng)杯中育中苗，成活率達(dá)到98%以上。經(jīng)十三年摸索篩選，由于靠本發(fā)明人利用了培養(yǎng)基上培養(yǎng)出壯苗，終于找到適合細(xì)胞分化，壯苗的培養(yǎng)基作為發(fā)明點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明。本發(fā)明的大果紅花油茶組織培養(yǎng)快速繁殖的育苗方法，包括以下技術(shù)工藝步驟
1、一種大果紅花油茶組織培養(yǎng)快速繁殖的育苗方法，其特征在于采用大果紅花油茶樹芽苞和葉片作為外植體，消毒，配制分化培養(yǎng)基，壯苗培養(yǎng)基，用定向聚丙烯薄膜袋作為培養(yǎng)皿器，接種，培養(yǎng)，其技術(shù)工藝步驟如下，(1)采外植體，選定大果紅花油茶樹的嫩枝條剪下，連芽和葉片保濕保鮮采集，選取芽苞和嫩葉放清水沖洗，然后用飽和洗衣粉水清洗，再用流動(dòng)的清水漂洗2 5分鐘，(2)無菌分化，把漂洗干凈的油茶樹芽苞或嫩葉片作為外植體，在無菌接種室工作臺(tái)上用72 % 75 %的酒精消毒10 15秒后，用無菌水沖洗2 5次后置于0. 1 % 0. 2 % 的升汞中消毒8 15分鐘，再用無菌水漂洗4 6次，去掉外表雜物。把所消毒的芽苞、葉片放到150倍以上的電子顯微鏡下，用解剖刀切割外表的雜物，清理外表雜物后取下最頂?shù)难考?. 2 0. 25mm組織，用接種針接種到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 20天得到小植株，所述的分化培養(yǎng)基每升含椰子汁50 150ml，蔗糖15 45g，卡拉膠6 10g，肌醇50 150mg， 甘氨酸1 3mg,煙酸0. 1 0. 35mg, D-泛酸鈣0. 1 0. 54mg,吡哆辛鹽酸0. 2 3. 5mg,生長(zhǎng)素0. 09 0. 25mg,分裂素6BA0. 1 0. 3mg,羥烯腺嘌呤0. 1 0. 3mg,烯腺嘌呤0. 01 0. 0:3mg，其余為MS培養(yǎng)基中的1/2大量元素和微量元素成分，(3)快速增殖，培養(yǎng)15 20天后，將誘導(dǎo)出的小植株切割成0. 3 0. 5mm后接入新的分化培養(yǎng)基中，多次繼代采用分化培養(yǎng)基，在每次轉(zhuǎn)袋過程中，不斷淘汰白化苗和污染袋苗，剪除枯黃葉片，經(jīng)3 5次轉(zhuǎn)袋培養(yǎng)后，得到的小植株再進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，(4)壯苗培養(yǎng)，將無菌分化增殖獲得的小植株接種到壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)60 80 天得到小苗，所述的壯苗培養(yǎng)基每升含水解酪蛋白0. 1 0. 5g，蔗糖10 35g，卡拉膠6 10g, a-萘乙酸0. 2 5. Omg,肌醇20 120mg,鹽酸硫胺4. 5 15mg,甘氨酸1. 5 6. Omg, 煙酸0. 5 5. 5mg,吲哚丁酸0. 1 3mg, D-泛酸鈣1 6mg,吡哆辛鹽酸0. 4 1. 5mg,生長(zhǎng)素0. 09 0. 25mg,蘋果汁10 15g，其余為MS培養(yǎng)基中的1/2大量元素和1/2微量元素成分。2、如權(quán)利要求1所述的大果紅花油茶組織培養(yǎng)快速繁殖的育苗方法，其特征在于步驟⑵分化培養(yǎng)基每升含椰子汁100ml，蔗糖25 30g，卡拉膠8g，肌醇lOOmg，甘氨酸 2mg,煙酸0. 25mg, D-泛酸鈣0. 44mg,吡哆辛鹽酸0. 4 1. 5mg,生長(zhǎng)素0. 09 0. 25mg,分裂素6BA0. Img,羥烯腺嘌呤0. 2mg,烯腺嘌呤0. 02mg,其余為MS培養(yǎng)基中的1/2大量元素和微量元素成分。3、如權(quán)利要求1所述的大果紅花油茶組織培養(yǎng)快速繁殖的育苗方法，其特征在于步驟(4)壯苗培養(yǎng)基每升含水解酪蛋白0. 12g，蔗糖22g，卡拉膠8g，a-萘乙酸0. 8mg，肌醇 60mg，鹽酸硫胺6mg，甘氨酸3. Omg,煙酸1. 5mg,吲哚丁酸0. 3mg, D-泛酸鈣1. 5mg,吡哆辛鹽酸0. 8mg,生長(zhǎng)素0. 12mg,蘋果汁12g，其余為MS培養(yǎng)基中的1/2大量元素和1/2微量元素成分。4、如權(quán)利要求1所述的大果紅花油茶組織培養(yǎng)快速繁殖的育苗方法，其特征在于步驟O) ⑷中所用的培養(yǎng)基PH為4. 5 7. 5，培養(yǎng)溫度18 32°C，每天光照6 16 小時(shí)，光照度800 2500Lx，芽尖為芽苞生長(zhǎng)點(diǎn)0. 1 0. 5mm組織，葉片為頂尖葉片1/2處 0. 1 0. 8mm組織，小植株的高度最好為1 3cm，小苗最好為苗高3 8cm，每株苗有2 8條根，無變異苗，白化苗。5、如權(quán)利要求1所述的大果紅花油茶組織培養(yǎng)快速繁殖的育苗方法，其特征在于步驟O) 中所用的培養(yǎng)基均分裝入薄膜袋中，每袋20ml，分裝好后密封、高溫消毒 10 20分鐘，取出放在無菌室降溫貯存，在無菌室的超凈工作臺(tái)上接上對(duì)應(yīng)的外植體或小植株后，用封口機(jī)把接好種的培養(yǎng)基袋封口，再放到培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)基分裝的薄膜袋，均為定向聚丙烯薄膜袋。6、如權(quán)利要求1所述的大果紅花油茶組織培養(yǎng)快速繁殖的育苗方法，其特征在于步驟(4)當(dāng)小苗形成的植株長(zhǎng)至3 8厘米時(shí)，將培養(yǎng)袋苗轉(zhuǎn)移到自然光下煉苗7 14天， 然后將其從袋中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，移至裝有營養(yǎng)土的營養(yǎng)杯栽培，經(jīng)2 8個(gè)月生長(zhǎng)得到中苗，成為生產(chǎn)栽培的種苗。7、如權(quán)利要求1所述的大果紅花油茶組織培養(yǎng)快速繁殖的育苗方法，其特征在于中苗最好為苗高50cm以上，每株苗有分枝2 8條，有3 10條根以上，須根多，葉片厚濃綠，無病蟲，無變異苗，白化苗。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的優(yōu)點(diǎn)是國內(nèi)外沒有關(guān)于利用組培技術(shù)生產(chǎn)油茶類種苗的專利和相關(guān)報(bào)道，只有實(shí)生苗和嫁接育苗繁殖的應(yīng)用。本發(fā)明采用獨(dú)創(chuàng)的培養(yǎng)基，使用定向聚丙烯薄膜袋作培養(yǎng)器皿，降低成本，可以脫除多種植物病毒，避免病毒引起的品種退化和減產(chǎn)造成的損失，使原來的優(yōu)良種性得到保持；繁殖快且量大、成苗快、種苗品質(zhì)好、 移栽成活率高，品種遺傳物質(zhì)變異小，開花掛果快、出油高、油質(zhì)優(yōu)、豐產(chǎn)期長(zhǎng)。本發(fā)明具有操作性強(qiáng)，應(yīng)用價(jià)值高，環(huán)保，對(duì)環(huán)境無任何不良影響，具有獨(dú)創(chuàng)性等特點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的最佳實(shí)施例是這樣的，以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，不是對(duì)本發(fā)明的限制實(shí)施例1(1)采外植體選用廣西藤縣天平鎮(zhèn)羅漫村大果紅花油茶百年老茶樹的嫩枝條剪下，連芽和葉片保濕保鮮采回，選取芽苞放清水沖洗，然后用洗衣粉水清洗，再用流動(dòng)的清水漂洗。(2)無菌分化把漂洗干凈的油茶樹芽苞作為外植體，在無菌接種室工作臺(tái)上用 72% 75%的酒精消毒10 15秒后，用無菌水沖洗2 5次后置于0. 0.2%的升汞中消毒8 15分鐘，再用無菌水漂洗4 6次，去掉外表雜物。把所消毒的芽苞放到 150倍以上的電子顯微鏡下，用解剖刀切割外表的雜物，清理外表雜物后用接種針將芽尖 0. 2 0. 25mm組織接種到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到小植株。所述的分化培養(yǎng)基每升含椰子汁 100ml、蔗糖25 30g、卡拉膠8g、肌醇lOOmg、甘氨酸ang、煙酸0. 25mg、D_泛酸鈣0. Mmg、 吡哆辛鹽酸0. 4 1. 5mg、生長(zhǎng)素0. 09 0. 25mg、分裂素6BA0. lmg、羥烯腺嘌呤0. 2mg、烯腺嘌呤0. Oang，其余為MS培養(yǎng)基中的1/2大量元素和微量元素成分。(3)壯苗培養(yǎng)將無菌分化獲得的小植株接種到壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到小苗。所述的壯苗培養(yǎng)基每升含水解酪蛋白0. 1 0. 5g，蔗糖20 25g，卡拉膠8g，a_萘乙酸0. 5 3. Omg,肌醇40 IOOmg,鹽酸硫胺4. 5 12mg,甘氨酸1. 5 4. Omg,煙酸1. 0 2. 5mg,吲哚丁酸0. 3mg, D-泛酸鈣1. 5mg,吡哆辛鹽酸0. 4 1. 5mg,生長(zhǎng)素0. 09 0. 25mg,蘋果汁 10 15g，其余為MS培養(yǎng)基中的1/2大量元素和1/2微量元素成分。(4)袋裝苗移栽當(dāng)小苗形成的植株長(zhǎng)至4 6厘米時(shí)，將培養(yǎng)袋苗轉(zhuǎn)移到自然光下煉苗7 14天，然后將其從袋中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，移至裝有營養(yǎng)土的營養(yǎng)杯栽培，得到中苗，成為生產(chǎn)栽培的種苗。在上述⑵ (3)各步驟中所用的培養(yǎng)基均為PH5.4 5.8，培養(yǎng)溫度對(duì) 觀1， 每天光照10 12小時(shí)，光照度1500 2000Lx。步驟(1)所述的采外植體為當(dāng)年開花成年樹嫩枝條的芽苞。步驟O)所述的芽尖為芽苞生長(zhǎng)點(diǎn)。步驟O)所述的小植株的高度最好為1 2cm。步驟(3)所述的小苗最好為苗高4 6cm，每株苗有3 5條根。實(shí)施例2(1)采外植體選用廣西藤縣天平鎮(zhèn)羅漫村大果紅花油茶百年老茶樹的嫩枝條剪下，連芽和葉片保濕保鮮采回，選取嫩葉放清水沖洗，然后用洗衣粉水清洗，再用流動(dòng)的清水漂洗。(2)無菌分化把漂洗干凈的油茶樹嫩葉片作為外植體，在無菌接種室工作臺(tái)上用72% 75%的酒精消毒10秒，用無菌水沖洗2 5次后，置于0. 的升汞中消毒5 15分鐘，再用無菌水漂洗4 6次。把所消毒的葉片放到150倍以上的電子顯微鏡下，用解剖刀切割嫩葉葉尖下1/2處0. 3 0. 5mm組織，接種到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到小植株。所述的分化培養(yǎng)基每升含椰子汁120ml、蔗糖22 30g、卡拉膠7 8g、肌醇lOOmg、甘氨酸ang、 煙酸0. 25mg、D-泛酸鈣0. Mmg、吡哆辛鹽酸0. 4 1. 5mg、生長(zhǎng)素0. 09 0. 25mg、分裂素 6BA0. ang、羥烯腺嘌呤0. ang、烯腺嘌呤0. 03mg，其余為MS培養(yǎng)基中的1/2大量元素和微量元素成分。(3)壯苗培養(yǎng)將無菌分化獲得的小植株接種到壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到小苗。所述的壯苗培養(yǎng)基每升含水解酪蛋白0. 1 0. 5g，蔗糖20 25g，卡拉膠8g，a_萘乙酸0. 5 3. Omg,肌醇40 IOOmg,鹽酸硫胺4. 5 12mg,甘氨酸1. 5 4. Omg,煙酸1. 0 2. 5mg,吲哚丁酸0. 2mg, D-泛酸鈣1. 5mg,吡哆辛鹽酸0. 4 1. 5mg,生長(zhǎng)素0. 09 0. 25mg,蘋果汁 25g，其余為MS培養(yǎng)基中的大量元素和1/2微量元素成分。(4)袋裝苗移栽當(dāng)小苗形成的植株長(zhǎng)至4 6厘米時(shí)，將培養(yǎng)袋苗轉(zhuǎn)移到自然光下煉苗7 14天，然后將其從袋中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，移至裝有營養(yǎng)土的營養(yǎng)杯栽培，得到中苗，成為生產(chǎn)栽培的種苗。在上述⑵ (3)各步驟中所用的培養(yǎng)基均為PH5. 4 6. 1，培養(yǎng)溫度M 30°C， 每天光照10小時(shí)，光照度1500 2000LX。步驟(1)所述的采外植體為當(dāng)年開花成年樹嫩枝條的葉片。步驟O)所述的葉片為頂尖葉片1/2處0. 3 0. 5mm組織。步驟O)所述的小植株的高度最好為1 2cm。步驟(3)所述的小苗最好為苗高4 6cm，每株苗有3 5條根。實(shí)施例3(1)采外植體選用江西省種植的大果紅花油茶樹的嫩枝條剪下，連芽和葉片保濕保鮮采回，選取芽苞放清水沖洗，然后用洗衣粉水清洗，再用流動(dòng)的清水漂洗。(2)無菌分化把漂洗干凈的油茶樹芽苞作為外植體，在無菌接種室工作臺(tái)上用 71 % 76 %的酒精消毒15秒后，用無菌水沖洗2 5次后置于0. 2 %的升汞中消毒7 15分鐘，再用無菌水漂洗4 6次，去掉外表雜物。把所消毒的芽苞放到150倍以上的電子顯微鏡下，用解剖刀切割外表的雜物，清理外表雜物后用接種針將芽尖0. 3mm組織接種到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到小植株。所述的分化培養(yǎng)基每升含椰子汁100ml、蔗糖25 30g、卡拉膠8g、肌醇lOOmg、甘氨酸2mg、煙酸0. 25mg、D-泛酸鈣0. Mmg、吡哆辛鹽酸0. 4 1. 5mg、 生長(zhǎng)素0. 09 0. 25mg、分裂素6BA0. lmg、羥烯腺嘌呤0. 25mg、烯腺嘌呤0. 03mg，其余為MS 培養(yǎng)基中的大量元素和微量元素成分。(3)壯苗培養(yǎng)將無菌分化獲得的小植株接種到壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到小苗。所述的壯苗培養(yǎng)基每升含水解酪蛋白0. 1 0. 5g，蔗糖20 25g，卡拉膠8g，a_萘乙酸0. 5 3. Omg,肌醇40 120mg,鹽酸硫胺4. 5 12mg,甘氨酸1. 5 5. Omg,煙酸1. 0 2. 5mg,吲哚丁酸0. 6mg, D-泛酸鈣1. 5mg,吡哆辛鹽酸0. 4 1. 5mg,生長(zhǎng)素0. 09 0. 25mg,蘋果汁 10 35g，其余為MS培養(yǎng)基中的1/2大量元素和1/2微量元素成分。(4)袋裝苗移栽當(dāng)小苗形成的植株長(zhǎng)至4 6厘米時(shí)，將培養(yǎng)袋苗轉(zhuǎn)移到自然光下煉苗7 14天，然后將其從袋中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，移至裝有營養(yǎng)土的營養(yǎng)杯栽培，得到中苗，成為生產(chǎn)栽培的種苗。在上述⑵ (3)各步驟中所用的培養(yǎng)基均為PH5. 4 6.0，培養(yǎng)溫度23 ^°C， 每天光照12小時(shí)，光照度1500 2000Lx。步驟(1)所述的采外植體為當(dāng)年開花成年樹嫩枝條的芽苞。步驟⑵所述的芽尖為芽苞生長(zhǎng)點(diǎn)。步驟O)所述的小植株的高度最好為1 3cm。步驟(3)所述的小苗最好為苗高4 8cm，每株苗有3 8條根。實(shí)施例4(1)采外植體選用廣西玉林市容縣種植的大果紅花油茶樹的嫩枝條剪下，連芽和葉片保濕保鮮采回，選取芽苞放清水沖洗，然后用洗衣粉水清洗，再用流動(dòng)的清水漂洗。(2)無菌分化把漂洗干凈的油茶樹芽苞作為外植體，在無菌接種室工作臺(tái)上用 72% 75%的酒精消毒10 15秒后，用無菌水沖洗2 5次后置于0. 0.2%的升汞中消毒8 15分鐘，再用無菌水漂洗4 6次，去掉外表雜物。把所用消毒的芽苞、葉片放到150倍以上的電子顯微鏡下，用解剖刀切割外表的雜物，清理外表雜物后用接種針將芽尖0. 2 0. 25mm組織接種到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到小植株。所述的分化培養(yǎng)基每升含椰子汁100ml、蔗糖25 30g、卡拉膠8g、肌醇lOOmg、甘氨酸ang、煙酸0. 25mg、D-泛酸鈣0. Mmg、吡哆辛鹽酸0. 4 1. 5mg、生長(zhǎng)素0. 09 0. 25mg、分裂素6BA0. lmg、羥烯腺嘌呤 0. ang、烯腺嘌呤0. oang，其余為MS培養(yǎng)基中的1/2大量元素和微量元素成分。(3)壯苗培養(yǎng)將無菌分化獲得的小植株接種到壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到小苗。所述的壯苗培養(yǎng)基每升含水解酪蛋白0. 1 0. 5g，蔗糖20 25g，卡拉膠8g，a_萘乙酸0. 5 3. Omg,肌醇50 120mg,鹽酸硫胺4. 5 12mg,甘氨酸2. 5 5. 5mg,煙酸2. 0 3. 5mg,吲哚丁酸0. 55mg, D-泛酸鈣1. 5mg,吡哆辛鹽酸0. 4 1. 5mg,生長(zhǎng)素0. 1 0. 35mg，蘋果汁 35g，其余為MS培養(yǎng)基中的1/2大量元素和1/2微量元素成分。(4)袋裝苗移栽當(dāng)小苗形成的植株長(zhǎng)至4 6厘米時(shí)，將培養(yǎng)袋苗轉(zhuǎn)移到自然光下煉苗7 14天，然后將其從袋中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，移至裝有營養(yǎng)土的營養(yǎng)杯栽培，得到中苗，成為生產(chǎn)栽培的種苗。
在上述⑵ (3)各步驟中所用的培養(yǎng)基均為PH5. 5 6.0，培養(yǎng)溫度對(duì) 30°〇， 每天光照12小時(shí)，光照度1500 2200Lx。步驟(1)所述的采外植體為當(dāng)年開花成年樹嫩枝條的芽苞。步驟O)所述的芽尖為芽苞生長(zhǎng)點(diǎn)。步驟O)所述的小植株的高度最好為1 2cm。步驟(3)所述的小苗最好為苗高4 6cm，每株苗有5條根。實(shí)施例5(1)采外植體選用廣西藤縣天平鎮(zhèn)羅漫村大果紅花油茶百年老茶樹的嫩枝條剪下，連芽和葉片保濕保鮮采回，選取芽苞放清水沖洗，然后用洗衣粉水清洗，再用流動(dòng)的清水漂洗。(2)無菌分化把漂洗干凈的油茶樹芽苞作為外植體，在無菌接種室工作臺(tái)上用 72% 75%的酒精消毒10 15秒后，用無菌水沖洗2 5次后置于0. 0.2%的升汞中消毒8 15分鐘，再用無菌水漂洗4 6次，去掉外表雜物。把所用消毒的芽苞、葉片放到150倍以上的電子顯微鏡下，用解剖刀切割外表的雜物，清理外表雜物后用接種針將芽尖0. 2 0. 25mm組織接種到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到小植株。所述的分化培養(yǎng)基每升含椰子汁100ml、蔗糖25 30g、卡拉膠8g、肌醇lOOmg、甘氨酸ang、煙酸0. 25mg、D-泛酸鈣0. Mmg、吡哆辛鹽酸0. 4 1. 5mg、生長(zhǎng)素0. 09 0. 25mg、分裂素6BA0. lmg、羥烯腺嘌呤 0. ang、烯腺嘌呤0. oang，其余為MS培養(yǎng)基中的1/2大量元素和微量元素成分。(3)快速增殖培養(yǎng)15 20天后，將誘導(dǎo)出的小植株切割后接入新的分化培養(yǎng)基中，結(jié)果叢生芽數(shù)量多，生長(zhǎng)快。多次繼代采用分化培養(yǎng)基。在每次轉(zhuǎn)袋過程中，應(yīng)切除頂端優(yōu)勢(shì)，且叢生芽塊不能切得太小，以免影響增殖速度。同時(shí)，應(yīng)不斷淘汰白化苗和污染袋苗，剪除枯黃葉片，經(jīng)幾次轉(zhuǎn)袋后，增殖速度可達(dá)2. 5 3倍。(4)壯苗培養(yǎng)將培養(yǎng)增殖獲得的小植株接種到壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到小苗。所述的壯苗培養(yǎng)基每升含水解酪蛋白0. 1 0. 5g，蔗糖20 25g，卡拉膠8g，a_萘乙酸0. 5 3. Omg,肌醇40 IOOmg,鹽酸硫胺4. 5 12mg,甘氨酸1. 5 4. Omg,煙酸1. 0 2. 5mg,吲哚丁酸0. 3mg, D-泛酸鈣1. 5mg,吡哆辛鹽酸0. 4 1. 5mg,生長(zhǎng)素0. 09 0. 25mg,蘋果汁 10 15g，其余為MS培養(yǎng)基中的1/2大量元素和1/2微量元素成分。(5)袋裝苗移栽當(dāng)小苗形成的植株長(zhǎng)至4 6厘米時(shí)，將培養(yǎng)袋苗轉(zhuǎn)移到自然光下煉苗7 14天，然后將其從袋中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，移至裝有營養(yǎng)土的營養(yǎng)杯栽培，經(jīng)2 4個(gè)月得到中苗，成為生產(chǎn)栽培的種苗。在上述⑵ (3)各步驟中所用的培養(yǎng)基均為PH5.4 5.8，培養(yǎng)溫度對(duì) 觀1， 每天光照10 12小時(shí)，光照度1500 2000Lx。步驟(1)所述的采外植體為當(dāng)年開花成年樹嫩枝條的芽苞。步驟O)所述的芽尖為芽苞生長(zhǎng)點(diǎn)。步驟⑵所述的小植株的高度最好為1 2cm。步驟(3) ⑷所述的小苗最好為苗高4 6cm，每株苗有3 5條根。步驟(5)所述的中苗最好為苗高50cm以上，每株苗有8條根以上，須根多。
權(quán)利要求
1.一種大果紅花油茶組織培養(yǎng)快速繁殖的育苗方法，其特征在于采用大果紅花油茶樹芽苞和葉片作為外植體，消毒，配制分化培養(yǎng)基，壯苗培養(yǎng)基，用定向聚丙烯薄膜袋作為培養(yǎng)皿器，接種，培養(yǎng)，其技術(shù)工藝步驟如下，(1)采外植體，選定大果紅花油茶樹的嫩枝條剪下，連芽和葉片保濕保鮮采集，選取芽苞和嫩葉放清水沖洗，然后用飽和洗衣粉水清洗，再用流動(dòng)的清水漂洗2 5分鐘，(2)無菌分化，把漂洗干凈的油茶樹芽苞或嫩葉片作為外植體，在無菌接種室工作臺(tái)上用72% 75%的酒精消毒10 15秒后，用無菌水沖洗2 5次后置于0. 0. 2%的升汞中消毒8 15分鐘，再用無菌水漂洗4 6次，去掉外表雜物。把所消毒的芽苞、葉片放到150倍以上的電子顯微鏡下，用解剖刀切割外表的雜物，清理外表雜物后取下最頂?shù)难考?. 2 0. 25mm組織，用接種針接種到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 20天得到小植株，所述的分化培養(yǎng)基每升含椰子汁50 150ml，蔗糖15 45g，卡拉膠6 10g，肌醇50 150mg， 甘氨酸1 3mg,煙酸0. 1 0. 35mg, D-泛酸鈣0. 1 0. 54mg,吡哆辛鹽酸0. 2 3. 5mg,生長(zhǎng)素0. 09 0. 25mg,分裂素6BA0. 1 0. 3mg,羥烯腺嘌呤0. 1 0. 3mg,烯腺嘌呤0. 01 0. 0:3mg，其余為MS培養(yǎng)基中的1/2大量元素和微量元素成分，(3)快速增殖，培養(yǎng)15 20天后，將誘導(dǎo)出的小植株切割成0.3 0. 5mm后接入新的分化培養(yǎng)基中，多次繼代采用分化培養(yǎng)基，在每次轉(zhuǎn)袋過程中，不斷淘汰白化苗和污染袋苗，剪除枯黃葉片，經(jīng)3 5次轉(zhuǎn)袋培養(yǎng)后，得到的小植株再進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，(4)壯苗培養(yǎng)，將無菌分化增殖獲得的小植株接種到壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)60 80天得到小苗，所述的壯苗培養(yǎng)基每升含水解酪蛋白0. 1 0. 5g，蔗糖10 35g，卡拉膠6 10g， a-萘乙酸0. 2 5. Omg,肌醇20 120mg，鹽酸硫胺4. 5 15mg，甘氨酸1. 5 6. Omg,煙酸0. 5 5. 5mg,吲哚丁酸0. 1 3mg, D-泛酸鈣1 6mg,吡哆辛鹽酸0. 4 1. 5mg,生長(zhǎng)素0. 09 0. 25mg,蘋果汁10 15g，其余為MS培養(yǎng)基中的1/2大量元素和1/2微量元素成分。
2.如權(quán)利要求1所述的大果紅花油茶組織培養(yǎng)快速繁殖的育苗方法，其特征在于步驟( 分化培養(yǎng)基每升含椰子汁100ml，蔗糖^g，卡拉膠8g，肌醇lOOmg，甘氨酸ang，煙酸 0. 25mg, D-泛酸鈣0. 44mg,吡哆辛鹽酸1. 2mg,生長(zhǎng)素0. 15mg,分裂素6BA0. Img,羥烯腺嘌呤ο. ang，烯腺嘌呤o. oang，其余為Ms培養(yǎng)基中的 Λ大量元素和微量元素成分。
3.如權(quán)利要求1所述的大果紅花油茶組織培養(yǎng)快速繁殖的育苗方法，其特征在于步驟 (4)壯苗培養(yǎng)基每升含水解酪蛋白0. 12g，蔗糖22g，卡拉膠8g，a-萘乙酸0. 8mg，肌醇60mg， 鹽酸硫胺6mg,甘氨酸3. Omg,煙酸1. 5mg,吲哚丁酸0. 3mg, D-泛酸鈣1. 5mg,吡哆辛鹽酸 0. 8mg,生長(zhǎng)素0. 12mg,蘋果汁12g，其余為MS培養(yǎng)基中的1/2大量元素和1/2微量元素成分。
4.如權(quán)利要求1所述的大果紅花油茶組織培養(yǎng)快速繁殖的育苗方法，其特征在于步驟 ⑵ (4)中所用的培養(yǎng)基PH為4. 5 7. 5，培養(yǎng)溫度18 32°C，每天光照6 16小時(shí)， 光照度800 2500Lx，芽尖為芽苞生長(zhǎng)點(diǎn)0. 1 0. 5mm組織，葉片為頂尖葉片1/2處0. 1 0. 8mm組織，小植株的高度最好為1 3cm，小苗最好為苗高3 8cm，每株苗有2 8條根，無變異苗，白化苗。
5.如權(quán)利要求1所述的大果紅花油茶組織培養(yǎng)快速繁殖的育苗方法，其特征在于步驟 (2) (4)中所用的培養(yǎng)基均分裝入薄膜袋中，每袋20ml，分裝好后密封、高溫消毒10 20分鐘，取出放在無菌室降溫貯存，在無菌室的超凈工作臺(tái)上接上對(duì)應(yīng)的外植體或小植株后， 用封口機(jī)把接好種的培養(yǎng)基袋封口，再放到培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)基分裝的薄膜袋，均為定向聚丙烯薄膜袋。
6.如權(quán)利要求1所述的大果紅花油茶組織培養(yǎng)快速繁殖的育苗方法，其特征在于步驟 (4)當(dāng)小苗形成的植株長(zhǎng)至3 8厘米時(shí)，將培養(yǎng)袋苗轉(zhuǎn)移到自然光下煉苗7 14天，然后將其從袋中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，移至裝有營養(yǎng)土的營養(yǎng)杯栽培，經(jīng)2 8個(gè)月生長(zhǎng)得到中苗，成為生產(chǎn)栽培的種苗。
7.如權(quán)利要求1所述的大果紅花油茶組織培養(yǎng)快速繁殖的育苗方法，其特征在于中苗最好為苗高50cm以上，每株苗有分枝2 8條，有3 10條根以上，須根多，葉片厚濃綠， 無病蟲，無變異苗，白化苗。
全文摘要
本發(fā)明公開一種大果紅花油茶組織培養(yǎng)快速繁殖的育苗方法，包括用來繁殖的外植體采集、無菌分化、壯苗培養(yǎng)和袋裝苗移栽。選取芽尖或葉片作繁殖的外植體，經(jīng)消毒，去除雜質(zhì)，用分化培養(yǎng)基培養(yǎng)形成小植株，將誘導(dǎo)出的小植株切割后接入新的分化培養(yǎng)基中多次繼代，獲得的小植株接種到特制的壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)，最后進(jìn)行袋裝苗移栽。本發(fā)明采用獨(dú)創(chuàng)的培養(yǎng)基成分，培養(yǎng)基使用定向聚丙烯薄膜袋作為培養(yǎng)皿器。茶苗繁殖快；可以脫除多種植物病毒，使原來的優(yōu)良種性得到保持；種苗品質(zhì)好、移栽成活率高；開花掛果快；出油高、油質(zhì)優(yōu)；豐產(chǎn)期長(zhǎng)。具有操作性強(qiáng)，應(yīng)用價(jià)值高，具有獨(dú)創(chuàng)性，為油茶種苗繁殖開辟了一條新的快速繁殖，投產(chǎn)快的途徑。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102405843SQ20111036955
公開日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2011年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月21日
發(fā)明者馮志祥, 張桂琴, 邱先強(qiáng), 黃雪娟 申請(qǐng)人:馮志祥, 張桂琴, 邱先強(qiáng), 黃雪娟