專利名稱：鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白及其編碼基因和它們的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白，還涉及鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白的編碼基因，以及含有鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白基因的重組載體和細(xì)胞，以及鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白及其編碼基因含有該基因的重組載體及細(xì)胞在培育具有耐堿性轉(zhuǎn)基因生物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在某些細(xì)菌菌體上具有細(xì)長(zhǎng)而彎曲的絲狀物，稱為鞭毛(flagellum)。鞭毛的長(zhǎng)度常超過菌體若千倍。在某些菌體上附有細(xì)長(zhǎng)并呈波狀彎曲的絲狀物，少則1-2根，多則可達(dá)數(shù)百根，是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官。多數(shù)細(xì)菌就是依靠鞭毛進(jìn)行運(yùn)動(dòng)的，而鞭毛的運(yùn)動(dòng)主要是借助鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白(flagellar motor protein)來完成整個(gè)過程。US 2008095793報(bào)道了衣原體鞭毛蛋白抗原在衣原體的防治與診斷方面的應(yīng)用，將衣原體鞭毛蛋白作為衣原體防治的主要指標(biāo)。WO 2005089429以及US 2007218048報(bào)道了精子的鞭毛能量攜帶蛋白以及精子的鞭毛能量攜帶蛋白早精子活力診斷的應(yīng)用。目前關(guān)于鞭毛及鞭毛蛋白的研究主要集中在細(xì)菌分類鑒定，分子診斷以及鞭毛表位的抗體等方面。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人基于對(duì)鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白的分子生物學(xué)研究，意外地發(fā)現(xiàn)從嗜堿單胞菌(Alkalimonas amylolytica N10,CGMCC N0.0463)中得到了一種鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白及其編碼基因，另一方面還提供了含有鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白基因的重組載體和細(xì)胞，以及鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白及其編碼基因含有該基因的重組載體及細(xì)胞在培育具有耐堿性轉(zhuǎn)基因生物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白，其中，該鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白具有SEQ ID No:2所示的氨基酸序列，或者該鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白具有將SEQ ID No:2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白活性的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了一種鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白基因，其中，該基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，或者該基因具有編碼SEQ ID No:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。另外，本發(fā)明還提供了一種重組載體，其中，該重組載體含有本發(fā)明提供的鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白基因。本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中，該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞含有本發(fā)明提供的鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白基因。本發(fā)明還提供了得到的鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白及其編碼基因、含有該基因的重組載體及轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在培育具有耐堿性轉(zhuǎn)基因生物中的應(yīng)用。鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白在耐鹽堿植物培育等方面具有重要的應(yīng)用潛力。通過克隆得到鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白基因，并通過轉(zhuǎn)基因的操作將微生物來源的鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白導(dǎo)入到植物細(xì)胞中，獲得耐鹽堿性提高的轉(zhuǎn)基因植株成為可能。


圖1 顯示了重組載體 pUC18-AanlO-mot 導(dǎo)入的大腸桿菌 K12 (pUC18-AanlO_mot)的耐堿性的測(cè)定結(jié)果，其中，將重組載體pUC18-AanlO-mot導(dǎo)入的大腸桿菌K12 (pUC18-AanlO-mot)分別接種到 pH 為 8.0、8.5、9.0 和 9.5 (含有 50mM 的 CAPS,HEPES 和TRICINE, 5N NaOH調(diào)節(jié))的LB液體培養(yǎng)基中(100 μ g/ml氨芐青霉素)，培養(yǎng)12小時(shí)后測(cè)定0D_，以導(dǎo)入pUC18空載體的大腸桿菌K12為對(duì)照(每組三個(gè)平行)。圖2顯示了鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白缺失的大腸桿菌K12(Amot)以及導(dǎo)入重組載體pUC18-AanlO-mot的K12 (Amot) (pUC18-AanlO_mot)耐堿性的測(cè)定結(jié)果，其中，將導(dǎo)入重組載體pUC18-AanlO_mot的K12 (Amot) (pUC18-AanlO_mot)和鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白缺失的大腸桿菌K12 ( Δ mot)分別接種到 pH 為 8.0、8.5、9.0 和 9.5 (含有 50mM 的 CAPS、HEPES 和 TRICINE,5N NaOH調(diào)節(jié))的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12小時(shí)后測(cè)定0D_，以大腸桿菌K12為對(duì)照(每組三個(gè)平行)。
具體實(shí)施例方式以下本發(fā)明的具體實(shí)施方式
進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實(shí)施方式
僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明提供了一種鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白，其中，該鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白具有SEQ ID No:2所示的氨基酸序列，或者該鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白具有將SEQ ID No:2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白活性的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白具有SEQ ID No:2所不的氣基酸序列。

相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了一種鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白基因，其中，該基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，或者該基因具有編碼SEQ ID No:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。優(yōu)選地，所述基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。本發(fā)明提供的鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白基因是從嗜堿單胞菌(Alkalimonas amylolyticaN10, CGMCC N0.0463)中克隆得到的。此外，本發(fā)明還提供了一種重組載體，其中，該重組載體含有本發(fā)明提供的鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白基因。在本發(fā)明中，所述“載體”可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的各種質(zhì)粒，粘粒,曬菌體及反轉(zhuǎn)錄病毒等。本發(fā)明優(yōu)選大腸桿菌pUC18質(zhì)粒。本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中，該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞含有本發(fā)明提供的鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白基因。所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，優(yōu)選可以是大腸桿菌、枯草桿菌或煙草BY2細(xì)胞，最優(yōu)選大腸桿菌。此外，本發(fā)明還提供了本發(fā)明提供的鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白及其編碼基因、及含有鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白基因的重組載體和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在培育具有耐堿性轉(zhuǎn)基因生物中的應(yīng)用。所述生物為植物或微生物。實(shí)施例1編碼鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白的核苷酸序列的克隆(I)嗜喊單胞菌(Alkalimonas amylolytica N10,CGMCC N0.0463)總 DNA 的提取和純化
取嗜喊單胞菌(Alkalimonasamylolytica N10,CGMCC N0.0463)的新鮮濕菌體20克，懸于10毫升50毫摩爾/升Tris緩沖液中(pH 8.0)，加入少量溶菌酶和8毫升0.25毫摩爾/升乙二胺四乙酸(EDTA) (pH 8.0)，混勻后于37°C放置20分鐘，然后加入2毫升10%十二烷基硫酸鈉(SDS)，55°C放置5分鐘，分別用等體積酚、氯仿各抽提一次，取最后一次抽提的上清溶液，加入2倍體積乙醇，沉淀DNA。將沉淀回收的DNA先后用70體積％乙醇溶液和無水乙醇洗滌后，將所得DNA溶于0.5毫升TE緩沖液(pH 8.0,10毫摩爾/升Tris，I毫摩爾/升EDTA)，加入10毫克/毫升RNA酶(RNase) 3微升，37°C保溫I小時(shí)，分別用等體積酚、氯仿各抽提一次，取上清液加入2倍體積乙醇，沉淀回收DNA，先后用70體積％乙醇溶液和無水乙醇洗滌后，真空干燥DNA沉淀，用去離子水溶解，得總DNA溶液。DNA溶液的紫外分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)果為 A26(i/A28(i = 1.818，A260/A230 = 2.052。(2)鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白基因的克隆分析嗜喊單胞菌(Alkalimonasamylolytica N10,CGMCC N0.0463)的基因組信息后，設(shè)計(jì)鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白基因的上下游引物，其中上游引物為5 ’ -TATGACCATGATTACGTGGATTTAGCAAC-3’，下游引物為 5’ ·-CAGGTCGACTCTAGACTAGITTTCCAGACTG-3’。通過高保真的核酸聚合酶Pyrobest (Takara),以上述提取的嗜喊單胞菌(Alkalimonas amylolytica N10, CGMCCN0.0463)基因組為模板擴(kuò)增出鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白基因的全長(zhǎng)。通過I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的基因的大小，并將PCR產(chǎn)物送至諾賽基因公司測(cè)序，最后得到855bp的如SED ID NO:1所示的核苷酸序列。實(shí)施例2編碼鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白的基因功能驗(yàn)證(I)重組克隆載體pUCl8_AanlO-mot的構(gòu)建利用Cycle-pure Kit純化上述得到的PCR產(chǎn)物。利用Fast clone Kit將純化的PCR產(chǎn)物和pUC18連接，將構(gòu)建好的重組載體pUC18-AanlO-mot通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到大腸桿菌K12BW25113中。通過含有100 μ g/ml氨芐青霉素的LB平板的篩選以及PCR驗(yàn)證得到含有重組載體pUC18-AanlO_mot插入的陽(yáng)性克隆大腸桿菌K12 (pUC18-AanlO_mot),經(jīng)測(cè)序證實(shí)pUC18-AanlO-mot插入的擴(kuò)增序列與鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白的核苷酸序列完全一致。(2)大腸桿菌K12BW25113鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白缺失體的構(gòu)建通過設(shè)計(jì)含有待敲除基因的上下游同源臂的DNA片段的引物擴(kuò)增打靶基因，利用大腸桿菌入噬菌體具有和宿主不同的λ Red重組系統(tǒng)將目的基因快速準(zhǔn)確的敲除。通過敲除大腸桿菌K12BW2511的鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白基因，得到大腸桿菌K12BW25113鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白基因(Amot)完全缺失的突變體E.coli K12(Amot)，鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白基因被卡那霉素基因取代。(3)重組載體pUC18-AanlO_mot導(dǎo)入的大腸桿菌K12 (pUC18-AanlO_mot)的耐堿性的測(cè)定將重組載體pUC18-AanlO_mot導(dǎo)入的大腸桿菌K12 (pUC18-AanlO_mot)分別接種到 pH 為 8.0、8.5、9.0 和 9.5 (含有 50mM 的 CAPS、HEPES 和 TRICINE, 5N NaOH 調(diào)節(jié))的 LB液體培養(yǎng)基中(100 μ g/ml氨芐青霉素)，培養(yǎng)12小時(shí)后測(cè)定0D_，以導(dǎo)入pUC18空載體的大腸桿菌K12為對(duì)照(每組三個(gè)平行)，結(jié)果如圖1所示。(4)鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白缺失的大腸桿菌K12(Amot)以及導(dǎo)入重組載體pUC18-Aan 10-mot 的 K12 (Amot) (pUC18-Aan 10-mot)耐喊性的測(cè)定將導(dǎo)入重組載體pUCl8_AanlO-mot 的 Kl2 ( Δ mot) (pUC18-Aan 10-mot)和鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白缺失的大腸桿菌Kl2 ( Δ mot)分別接種到pH為8.0、8.5、9.0和9.5 (含有50mM的CAPS、HEPES和TRICINE，5N NaOH調(diào)節(jié))的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12小時(shí)后測(cè)定0D_，以大腸桿菌K12為對(duì)照(每組三個(gè)平行)，結(jié)果如圖2所示。從圖1中可以看出，導(dǎo)入重組載體？此184&111011(^的大腸桿菌1(12在？!1為8.0、
8.5,9.0和9.5的LB液體培養(yǎng)基中(100 μ g/ml氨芐青霉素)，12小時(shí)后測(cè)定OD6tltl明顯高于導(dǎo)入pUC18空載體的大腸桿菌K12,這也證明了鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白基因(AanlO-mot)的導(dǎo)入能夠提高大腸桿菌K12的耐堿性。從圖2中可以看出，導(dǎo)入重組載體pUC18-AanlO_mot的大腸桿菌K12(Amot)在pH
8.0，8.5，9.0 和 9.5 (含有 50mM CAPS, HEPES 和 TRICINE, 5N NaOH 調(diào)節(jié))的 LB 液體培養(yǎng)基中，12小時(shí)后測(cè)定0D_明顯高于導(dǎo)入大腸桿菌鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白的缺失體K12 ( Δ mot)，這也證明了鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白基因(AanlO-mot)的導(dǎo)入能夠提高大腸桿菌K12 ( Δ mot)的耐堿性。綜上所述，本申請(qǐng)?zhí)峁┑谋廾\(yùn)動(dòng)蛋白基因在耐鹽堿生物的培育等方面具有重要的應(yīng)用潛力。通過克隆得到鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白基因，并通過轉(zhuǎn)基因的操作將微生物來源的鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白導(dǎo)入到植物細(xì)胞中 ，獲得耐鹽堿性提高的轉(zhuǎn)基因植株成為可能。
權(quán)利要求
1.一種鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白，其特征在于，該鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白具有SEQ ID No:2所示的氨基酸序列，或者該鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白具有將SEQ ID No:2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白活性的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白，其中，該蛋白具有SEQID No:2所示的氨基酸序列。
3.一種鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白基因，其特征在于，該基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，或者該基因具有編碼SEQ ID No:2所不的氣基酸序列的核昔酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其中，該基因具有SEQID No:1所示的核苷酸序列。
5.一種重組載體，其特征在于，該重組載體含有權(quán)利要求3所述的基因。
6.一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其特征在于，該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞含有權(quán)利要求3所述的基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中，所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1所述的鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白、權(quán)利要求3所述的基因、權(quán)利要求5所述的重組載體、權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在培育具有耐堿性轉(zhuǎn)基因生物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其 中，所述生物為植物或微生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白，其中，該鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白具有SEQ ID No2所示的氨基酸序列，或者該鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白具有將SEQ ID No2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白活性的氨基酸序列。此外，還涉及鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白的編碼基因，其中，該基因具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列，或者該基因具有編碼SEQ ID No2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。還涉及含有鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白基因的重組載體和細(xì)胞，以及鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白及其編碼基因含有該基因的重組載體及細(xì)胞在培育具有耐堿性轉(zhuǎn)基因生物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A01H5/00GK103087158SQ201110338050
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2011年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月31日
發(fā)明者馬延和, 翟磊, 薛燕芬 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所