專利名稱：一種甜葉菊多倍體離體誘導(dǎo)技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種甜葉菊染色體加倍的技術(shù)，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域或植物細(xì)胞工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甜葉菊(stevia rebaudiana bertoni)是菊科多年生草本植物,原產(chǎn)南美巴拉圭，現(xiàn)世界各地引種栽培均獲得成功。甜葉菊葉片中含有的甜菊糖甙甜度是蔗糖的25(Γ300倍，但所含熱量僅是蔗糖的1/300，是目前已知最甜的天然甜味劑，已經(jīng)替代糖精在食品、醫(yī)藥等工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用，并對肥胖癥、低血糖、糖尿病、小兒齲齒、高血壓、心臟病等具有·一定的防治效果和輔助治療作用，是繼甘蔗糖、甜菜糖之外有開發(fā)價(jià)值和健康推崇的天然蔗糖替代品，被國際上譽(yù)為“世界第三健康糖源”。多倍體育種是對植物進(jìn)行高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)種質(zhì)改造的重要手段，植物染色體數(shù)目加倍后，往往表現(xiàn)出植物器官的巨大性，適應(yīng)性、抗逆性增強(qiáng)，營養(yǎng)生長階段延長，開花期推遲，次生代謝產(chǎn)物增加等特點(diǎn)。這些對于以葉片為收獲物并用以提取甜菊糖的甜葉菊來說，更是意義重大。利用秋水仙素進(jìn)行化學(xué)誘變獲得多倍體是園藝植株育種中的重要方法之一，將化學(xué)誘變技術(shù)與組織培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合進(jìn)行誘變育種具有其獨(dú)特優(yōu)勢。國內(nèi)外有關(guān)甜葉菊組培快繁已經(jīng)有較多的研究和應(yīng)用，但有關(guān)利用秋水仙素進(jìn)行甜葉菊多倍體離體誘變研究未見報(bào)道。本發(fā)明的目的是通過將兩項(xiàng)科技手段結(jié)合應(yīng)用于甜葉菊，建立起一種高效的甜葉菊多倍體誘導(dǎo)技術(shù)體系。

發(fā)明內(nèi)容
I.在超凈工作臺(tái)上將甜葉菊試管苗去頂除葉，將切下的莖段接種于再生苗培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基為 MS+BA1.0 mg/L+NAAO. 2 mg/L。2.向莖段滴加濃度為O. 1% -O. 4%秋水仙素溶液，確保秋水仙素溶液浸潤每個(gè)莖段。3.在組培室內(nèi)培養(yǎng)1-3天后，用無菌水漂洗3次。4.將莖段轉(zhuǎn)移至新的再生培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)30天，長成芽苗。5.將芽苗接種于生根培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)20天。培養(yǎng)基為1/2MS +ΙΒΑ0. 5 mg/L。6.試管苗根長至1-2 cm時(shí)，取根用常規(guī)細(xì)胞壓片技術(shù)進(jìn)行染色體檢測；撕取突變苗及對照苗葉片下表皮觀察組織細(xì)胞及氣孔結(jié)構(gòu)特征。7.染色體檢測的染色方法為0.002 mol/L 8_羥基喹啉預(yù)處理2 h、卡諾氏固定液固定24 h、l mol/L鹽酸及無水乙醇I : I解離液解離30 min、改良苯酚品紅染液染色10min。8.整個(gè)組織培養(yǎng)期間培養(yǎng)室溫度為25± 1°C，光照強(qiáng)度約30 μ mo I · m_2 · s—1 (光源為40 W日光燈)，光照時(shí)間12 h/d。本發(fā)明所述的甜葉菊多倍體誘導(dǎo)方法，與傳統(tǒng)秋水仙素處理莖尖生長點(diǎn)不同，傳統(tǒng)方法是用秋水仙素點(diǎn)滴涂抹莖尖生長點(diǎn)，但由于甜葉菊的頂端新葉叢生，誘變劑難以完全浸潤到生長點(diǎn)，影響誘變的效果。本發(fā)明采用試管苗莖段側(cè)芽作為外植體且在其再生植株過程中進(jìn)行誘導(dǎo)處理，由于試管苗側(cè)芽體較小，有利于秋水仙素的有效滲入側(cè)芽所有細(xì)胞產(chǎn)生誘變效應(yīng)，因而可能是獲得較高比例的多倍體植株的原因之一，也使得嵌合體很少。本發(fā)明的將二倍體甜葉菊轉(zhuǎn)變?yōu)樗谋扼w后，染色體數(shù)目由2n=2x=22轉(zhuǎn)變?yōu)?n=4x=44 (圖1)，多倍體甜葉菊的誘導(dǎo)率(誘導(dǎo)率=多倍體植株數(shù)/處理的甜葉菊株數(shù)X 100)最高達(dá)到43. 6%。四倍體甜葉菊的外形也發(fā)生了明顯的改變，表現(xiàn)在，氣孔增大(圖2)，葉片明顯變大，葉片變寬，葉形由長披針形變成橢圓形(圖3)。


參見附圖
圖I為甜葉菊染色體加倍前(A)后(B)染色體數(shù)目的變化。圖2為甜葉菊染色體加倍前(A)后(B)葉片氣孔大小的變化。
圖3為甜葉菊染色體加倍前(A)后(B)葉片形態(tài)及大小的變化。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :
I.在超凈工作臺(tái)上將甜葉菊試管苗去除葉片，切成帶一側(cè)芽，長約I. O cm的莖段。將切下的莖段接種于再生苗培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基為MS+BA1.0 mg/L+NAAO. 2 mg/L。每瓶接種4個(gè)莖段，每處理接種10瓶，置于培養(yǎng)室培養(yǎng)。2.向莖段滴加濃度為O. 1%秋水仙素溶液，確保秋水仙素溶液浸潤每個(gè)莖段。3.在組培室內(nèi)培養(yǎng)3天后，用無菌水漂洗3次。將莖段轉(zhuǎn)移至新的再生培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)30天，長成芽苗。將芽苗接種于生根培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)20天，培養(yǎng)基為MS +ΝΑΑ0. 5mg/L ο5.試管苗根長至1-2 cm時(shí)，取根用常規(guī)細(xì)胞壓片技術(shù)進(jìn)行染色體檢測，撕取突變苗及對照苗葉片下表皮觀察組織細(xì)胞及氣孔結(jié)構(gòu)特征。6.上述染色體檢測的染色方法為0.002 mol/L 8_羥基喹啉預(yù)處理2 h、卡諾氏固定液固定24 h、l mol/L鹽酸及無水乙醇I : I解離液解離30 min、改良苯酚品紅染液染色10 min。7.在個(gè)過程中的組培室的培養(yǎng)條件為溫度25± I °C，光照強(qiáng)度約30μ mo I · m_2 · s—1 (光源為40 W日光燈),光照時(shí)間12 h/d。效果經(jīng)檢測染色體加倍的甜葉菊植株，葉片變圓，變大，變厚，氣孔增大，染色體數(shù)目由2n=2x=22轉(zhuǎn)變?yōu)?n=4x=44，多倍體甜葉菊誘導(dǎo)率達(dá)到42. 3%。實(shí)施例2
具體方法如實(shí)施例1，其中滴加O. 4%秋水仙素濃度后培養(yǎng)3天，多倍體甜葉菊誘導(dǎo)率達(dá)到 43. 6%ο實(shí)施例3
具體方法如實(shí)施例1，其中滴加O. 2%秋水仙素濃度后培養(yǎng)3天，多倍體甜葉菊誘導(dǎo)率達(dá)到 41. 1%。
權(quán)利要求
1.在超凈工作臺(tái)上將甜葉菊試管苗去除葉片，切成帶一側(cè)芽，長約l.oCm的莖段。
2.將切下的莖段接種于再生苗培養(yǎng)基上。
3.向莖段滴加濃度為O.1%-0. 4%秋水仙素溶液,確保秋水仙素溶液浸潤每個(gè)莖段。
4.在組培室內(nèi)培養(yǎng)1-3天后，用無菌水漂洗3次。
5.將莖段轉(zhuǎn)移至新的再生培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)30天，長成芽苗。
6.將芽苗接種于生根培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)20天。
7.試管苗根長至1-2cm時(shí)，取根用常規(guī)細(xì)胞壓片技術(shù)進(jìn)行染色體檢測，并撕取突變苗葉片下表皮觀察組織細(xì)胞及氣孔結(jié)構(gòu)特征。
8.根據(jù)權(quán)利要求2和權(quán)利要求5所述的再生苗培養(yǎng)基，其特征在于，培養(yǎng)基為MS+BA1.Omg/L+NAAO. 2 mg/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生根培養(yǎng)基，其特征在于，培養(yǎng)基為1/2MS+ΙΒΑ0. 5 mg/L。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的染色體檢測方法，其特征在于，染色方法為0.002mo I/L8-羥基喹啉預(yù)處理2 h、卡諾氏固定液固定24 h、l mol/L鹽酸及無水乙醇I : I解離液解離30 min、改良苯酚品紅染液染色10 min。
11.根據(jù)權(quán)利要求4、權(quán)利要求5和權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)條件，其特征在于，培養(yǎng)室溫度25±1°C，光照強(qiáng)度約30 μ mo I · m_2 · s—1 (光源為40 W日光燈)，光照時(shí)間12 h/d。
全文摘要
采用離體培養(yǎng)與化學(xué)誘變技術(shù)相結(jié)合誘導(dǎo)甜葉菊多倍體。將甜葉菊試管苗切頂除葉，切成帶一側(cè)芽的莖段，插于再生苗培養(yǎng)基上，用秋水仙堿滴加浸潤莖段。培養(yǎng)1-3天后清洗，再培養(yǎng)30天長成芽苗，轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基上生根。經(jīng)細(xì)胞組織學(xué)鑒定，多倍體誘導(dǎo)成功，多倍體比率可達(dá)43.6%。
文檔編號A01H4/00GK102893860SQ201110317740
公開日2013年1月30日 申請日期2011年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月19日
發(fā)明者崔廣榮, 何克勤, 胡能兵, 張子學(xué), 林平, 王波 申請人:崔廣榮