專利名稱：一種快速檢測水稻溫敏不育系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物品種的檢測方法，具體涉及快速檢測水稻溫敏不育系株IS及其他溫敏不育系的方法。
背景技術(shù)：
隨著世界人口的不斷增長以及工業(yè)的發(fā)展，人們對糧食的需求量日益增加，水稻作為主要的糧食作物之一，普遍受到人們的歡迎。據(jù)報道，世界上近一半人口，包括幾乎整個東亞和東南亞的人口，都以稻米為食。同樣，水稻作為我國主要糧食作物之一，是我國人民最受歡迎的日常食物。隨著人口的增長和耕地面積的減少，提高水稻產(chǎn)量成為解決我國糧食問題的重要途徑。現(xiàn)代生物技術(shù)是培育高產(chǎn)水稻的重要手段之一，中國的雜交水稻為糧食增產(chǎn)作出了重要貢獻(xiàn)。目前，中國雜交水稻年種植面積占水稻種植總面積的5 I %，產(chǎn)量約占水稻總產(chǎn)的6 O %,中國亞種間雜交稻一般比品種間雜交稻具有2 O %以上的增產(chǎn)潛力。利用水稻亞種間雜交優(yōu)勢是現(xiàn)階段戰(zhàn)略重點，二系法雜交水稻是突破亞種間水稻雜交困難的重要方法。水稻光、溫敏兩系不育資源的發(fā)現(xiàn)和在雜交水稻上的廣泛應(yīng)用，為利用兩系法選育超級雜交水稻打開了新的局面。由于光溫敏兩系不育系受隱性核基因控制，與三系不育系相比，兩系不育系具有自我繁殖，配組范圍廣，基因資源豐富等特點。因此，利用兩系不育系選育超級雜交稻成為我國雜交水稻育種的主攻方向和發(fā)展趨勢。 根據(jù)光周期和溫度對育性的影響，兩系不育系分為光敏型、溫敏型和光溫敏互作型等三個主要類型。農(nóng)墾58S及其衍生的粳稻不育系屬于典型的光敏型核不育系，在長日照條件下表現(xiàn)為不育，短日照條件下又可以恢復(fù)育性。而安農(nóng)S-1、Y58S、株IS等則屬于典型的溫敏性不育系，即在高溫不育，低溫可育。另外，還有一些不育系既受光照影響同時也受到溫度的調(diào)控，這類不育系稱為光溫互作型，如培矮64S等。株IS和陸18S是在生產(chǎn)實踐中廣泛應(yīng)用的兩系不育系，屬于典型的溫敏型不育系。株IS和陸18S是從遺傳距離較遠(yuǎn)的不同生態(tài)型水稻雜交組合F2群體中發(fā)現(xiàn)的不育株，經(jīng)“自然環(huán)境和人工環(huán)境雙重壓力選擇法”選育的新低不育起點溫度核不育系。由于淘汰了低世代變異群體中不育起點溫度高和短期低溫引起的育性波動不育類型，株IS和陸18S不育起點溫度低，不育性穩(wěn)定。其中，株IS的育性轉(zhuǎn)育溫度在22. 6°C左右，陸18S在23°C左右；并且對連續(xù)6天日平均23°C的低溫不敏感，是國內(nèi)不育起點溫度低，不育性穩(wěn)定的優(yōu)良兩系不育系。在實際生產(chǎn)中，株IS和陸18S生殖生長期耐低溫能力強(qiáng)，大面積制種安全可靠，繁殖產(chǎn)量高，解決了低不育起點溫敏不育系的繁殖難題。株IS和陸18S綜合農(nóng)藝性狀好，抗性強(qiáng)，米質(zhì)較優(yōu)，分別于1999、2000年通過湖南省品種鑒定。目前，株IS已成為培育兩系不育系的重要不育基因資源，利用株IS已轉(zhuǎn)育成湘陵628S、潭農(nóng)S等6個新不育系。株IS和陸18S配合力強(qiáng)，親和譜廣，已育成48個組合通過審定，其中國審早稻組合10個，省審早稻組合34個，分別占同期長江流域國審和省審兩系早稻組合的62. 5%和44. 2%。株IS和陸18S所配組合亞種間優(yōu)勢明顯，其中株兩優(yōu)819比對照增產(chǎn)10%，被農(nóng)業(yè)部認(rèn)定為首個早熟超級雜交早稻，并作為南方稻區(qū)區(qū)試對照和農(nóng)業(yè)主導(dǎo)品種。陸兩優(yōu)819比對照增產(chǎn)8. 08%，也被農(nóng)業(yè)部認(rèn)定為超級雜交早稻。截止到2010年，株IS及陸18S所配品種在我國的累計種植面積超過9100萬畝。株IS是培育兩系超級水稻的重要不育資源，但是由于株IS株系缺少分子檢測標(biāo)記，在利用株IS培育其他不育系時，只能通過不育基因純合后代的表型來鑒定，需要到F2代才能通過表型觀察判定。通常而言，在某一品種與株IS雜交獲得具有溫敏特點的新不育系時，需要將純合的雜交后代不育系與目標(biāo)品種回交>5代，以得到具有該品種特性的新不育系，在常規(guī)育種條件下，由于每一次回交都需要在F2代才能確定不育系的表型，大大增加了育種的時間和工作量。本發(fā)明提供一種利用分子標(biāo)記檢測株IS或溫敏不育系中控制溫敏不育基因的方法，該方法在雜交F1代即可檢測到攜帶溫敏不育基因的株系，利用該株系與目標(biāo)品種繼續(xù)回交，直到回交目標(biāo)代數(shù)，自交即獲得具有溫敏不育基因的新不育系，大大減少了育種的時間和工作量，對于加快我國雜交水稻的新品種的選育、提高水稻產(chǎn)量、解決我國糧食問題具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速檢測水稻溫敏不育系的方法。本發(fā)明所述的溫敏不育性是指株IS或不育基因來源于株IS的不育系，包括但不限于株1S、以及由株IS培育的不育系。本發(fā)明所述的快速檢測水稻溫敏不育系的方法，包括以下步驟
1)對要檢測的不育系和野生型材料提取基因組DNA；
2)利用引物進(jìn)行PCR反應(yīng)；
3)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳；
4)電泳結(jié)果中比野生型材料PCR產(chǎn)物電泳條帶，電泳速度快的為攜帶不育基因的不育
系O步驟2)所述的引物，其特征在于，引物序列由A或B所示的序列之一組成
A、RMZ-1IF:CCTCTGTATCCACGAAGGAT和RMZ-1IR: CACTCGGAGGTCTACAATCT ；
B、RMZ-13F:GTAATGTCGTAAGGAAATGCCC 和RMZ-13R: GCGATGACTTGCCGCTGT ；
本發(fā)明還提供準(zhǔn)確檢測水稻溫敏不育系的方法，包括以下步驟
1)對要檢測的不育系和野生型材料提取基因組DNA；
2)PCR進(jìn)行測序反應(yīng)；
3)比較不育系與野生型材料測序序列的差異，區(qū)分是否為溫敏不育系；
步驟3)所述的溫敏型不育系測序序列與野生型的差異為攜帶不育基因的不育系，其特征在于，所述不同包含以下特征之一(以L0C_0s02gl2290基因的起始密碼子“ATG”的“A”為O位置，“A”前面的序列為ATG以后的序列為“ + ”，并其與“A”的堿基數(shù)代表其位置。)
A、與野生型相比，待測株系第+70的核苷酸由C變成A;
B、與野生型相比，待測株系第-1640位的核苷酸從C到T;C、與野生型相比，待測株系第-1132位的核苷酸從T到A;
D、與野生型相比，待測株系第-1125位缺失AGA；
E、與野生型相比，第-791位的核苷酸A到C；
F、待測株系第-468位的核苷酸T到C;
G、野生型相比，待測株系第-122位的核苷酸從A到C;
H、與野生型相比，待測株系第+69位的核苷酸從G到T;
I、與野生型相比，待測株系或第+70位的核苷酸A到C；
J、與野生型相比，待測株系第-121位的核苷酸缺失T ；
K、待測株系第+1128位的核苷酸從G到A ;
L、與野生型相比，待測株系或第+1199位的核苷酸從A到T。


圖1為RMZ-11F和RMZ-11R為引物PCR電泳圖，1 :雜合株系，2 :93_11，3 :株1S，
4 :陸 18S ；。圖2為RMZ-13F和RMZ-13R為引物PCR電泳圖，1 :雜合株系，2 :株1S，3 :93_11， 4 :陸 18S。圖3為以CX7958測序的峰圖。
具體實施例方式實施例1、株1S溫敏不育基因的圖位克隆
首先，我們將株1S與93-11進(jìn)行雜交，獲得匕種子。F1種植以后自交，得到F2群體。 在 7500株&群體中，我們一共鑒定出1872株不育單株。通過SSR引物進(jìn)行連鎖分析， 我們將控制株1S育性的基因初步定位在標(biāo)記RM7575與RM5897之間。進(jìn)一步加密標(biāo)記，最 終將控制株1S育性的基因定位在標(biāo)記RMZ-17與RMZ-11之間。對表及之間的基因片段進(jìn) 行測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)L0C_0s02gl2290的編碼區(qū)出現(xiàn)了一個單堿基突變，該突變造成了一個終 止密碼子，使翻譯提前終止。這證明L0C_0s02gl2290為造成株1S溫敏不育系的主要候選 基因。
實施例2、L0C_0s02gl2290基因組片段回復(fù)株1S的育性
我們利用酶切的方法從BAC上克隆了包含L0C_0s02gl2290的基因組DNA片段，并將其 構(gòu)建進(jìn)PCAMBIA2300的雙元表達(dá)載體。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，我們將L0C_0s02gl2290的 基因組片段導(dǎo)入株1S的基因組中。在高溫條件下，株1S完全不育，沒有花粉產(chǎn)生；而轉(zhuǎn)基 因互補(bǔ)植株能夠恢復(fù)株1S的育性，并且能夠很好地結(jié)實。這證明L0C_0s02gl2290是控制 株1S溫敏不育的育性基因。
實施例3、利用PCR反應(yīng)檢測不育系
我們對L0C_0s02gl2290附近的DNA進(jìn)行了基因組測序，并鑒定出新的標(biāo)記RMZ-11和 RMZ-13。標(biāo)記 RMZ-11 距離 L0C_0s02gl2290 約 3. 34kb，是一個 75bp 的缺失。在 93—11 基因組中含有這一片段，株1S，陸18S中均不含有該片段。我們根據(jù)RMZ-1l和RMZ-13位置設(shè)計引物進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測不育系。首先按照以下方法對待檢測的株系和野生型水稻提取DNA
1，將適量植物材料在研缽中研磨，加入Iml CTAB溶液，轉(zhuǎn)入1.5ml EP管中，65°C溫育30-60分鐘，并不時顛倒地混勻。2，12000rpm離心5-10分鐘，取上清，加入等體積氯仿異戊醇(24:1)混合液，顛倒混勻，IOOOOrpm離心5分鐘，取上清移至新EP管中。3，上清中加入700 uL異丙醇，-20°C沉淀I小時，12000rpm離心5分鐘，沉淀用75%乙醇洗滌，干燥后，溶于100 uL水中，待用。試劑配置2X CTAB 溶液2%CTAB，O. 1%PVP40，20mM EDTA (pH 8. 0), IOOmMTris-HCl (pH 8. 0)，1. 4M NaCl。RMZ-1IF: CCTCTGTATCCACGAAGGAT 和 RMZ-11R: CACTCGGAGGTCTACAATCT 為引物，以提取的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系如下
10XPCR buffer2. O uL
2. 5mM each dNTP1. O uL
RMZ-1lF (10 uM)O. 5 uL
RMZ-1lR (10 uM)O. 5 uL
DNA 模板1. OuL
rTaqO. 2 uL
用H20補(bǔ)充到20 uL
PCR反應(yīng)條件95°C for 2min; (95°C for 20s, 58°C for 30s, 72°C for 20s) X 32個循環(huán)；
72°C for IOmin; keep at 4。。。PCR產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖進(jìn)行電泳，150V電泳20分鐘，不育性的產(chǎn)物比野生型的產(chǎn)物電泳速度快，如附圖1所示。標(biāo)記RMZ-13距離L0C_0s02gl2290編碼區(qū)起始密碼子僅6bp，較野生型多出6bp。以 RMZ-13F: GTAATGTCGTAAGGAAATGCCC 和
RMZ-13R: GCGATGACTTGCCGCTGT 為引物，PCR 反應(yīng)體系如下
10XPCR buffer2. O uL
2.5mM each dNTP1. O uL
RMZ-13F (10 uM)0. 5 uL
RMZ-13R (10 uM)0. 5 uL
DNA 模板1. OuL
rTaq0. 2 uL
用H20補(bǔ)充到20 uL
PCR反應(yīng)條件95°C for 2min; (95°C for 20s, 60°C for 20s, 72°C for 20s) X 32個循環(huán)；
72°C for IOmin; keep at 4....
PCR產(chǎn)物電泳速度慢的為不育系。用10%PAGE膠進(jìn)行電泳，400V電泳180分鐘，如附圖2所示。
實施例4、利用測序反應(yīng)檢測不育系
通過對L0C_0s02gl2290基因組片段進(jìn)行直接測序，我們鑒定出9個SNP，即SNP-Zl SNP-Z9。另外，還檢測到兩個InDel，SP InDel-Zl和InDel_Z2。以下通過測序獲得的覆蓋L0C_0s02gl2290的株IS基因組序列，共約3. 6 kb。在攜帶不育基因的株系中上述SNP和InDel的序列與野生型不同，所以可以用測序的方法檢測上述SNP和InDel，從待檢測材料中檢測出不育株系。利用實施例3所述的提取基因組的方法提取待檢測株系和野生型株系的基因組 DNA，利用實施例 3 所述的 PCR 體系以 cx8867: CCGAGTAGACATTGACTTGG 和 cx7958:GTCTTGAAGGCCTTCACCTT為引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖回收后，提交測序，測序引物是cx7958。經(jīng)測序后+70位置的核苷酸從C變成A，由于cx7958是反向測序引物，即為附圖3箭頭所示的從G變成T。由于該位點的突變直接導(dǎo)致了株IS的溫敏不育，所以直接對該位點直接測序是檢測株IS溫敏不育基因最直接、最準(zhǔn)確的方法。同時，我們對國內(nèi)主要的溫敏不育系進(jìn)行了 DNA直接測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)應(yīng)用主要溫敏不育系均是該位點發(fā)生了有C到A的突變。由此我們證明該方法不僅適用于株IS和由株IS不育基因培育的不育系，還包括其他生產(chǎn)上應(yīng)用的主要溫敏不育系，如C815S，Y58S，廣占63S以及有它們?yōu)椴挥蚬w培育不育系，如圖4所示。其他SNP和InDel的檢測方法如下
以 cx7953: CTCAGCAACAGACAGAGGAGT; cx7954: AAATTTCGGACCCTCACCGG 為引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖回收后，提交測序，測序引物是CX7953。與野生型相比，待測株系第-1640位的核苷酸從C到T，即為附圖4箭頭，或第-1132位的核苷酸從T到A，或第-1222位缺失AGA ；
以 cx7955: GGTTGCTCGATCTGAAGCAT; cx7956: TTGAGAAGGGCTTCTCCTCG 為引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖回收后，提交測序，測序引物是cx7955。與野生型相比，第-791位的核苷酸A到C，第-468位的核苷酸T到C。以 cx7957: TGCCGATGCAACCTCTTGC; cx7958: GTCTTGAAGGCCTTCACCTT 為引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖回收后，提交測序，測序引物是CX7957。與野生型相比，待測株系第-122位的核苷酸從A到C，或第+69位的核苷酸從G到T，或第+70位的核苷酸C到A，第-121位的核苷酸缺失T 。以 cx7961: CTTCAAGCACGGATATCAG; cx7962: CTCTACTTCTGAAAGAGGGT 為引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖回收后，提交測序，測序引物是CX7961。與野生型相比，待測株系第+1128位的核苷酸從G到A，或第+1199位的核苷酸從A到T。
SEQUENCE LISTING
<110>中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所湖南亞華種業(yè)科學(xué)研究院
<120>一種快速檢測水稻溫敏不育系的方法
<130>I
<160>12
< 170>PatentIn version 3.5
<210>I
<211>20
<212>DNA
<213>Oryzasativa
<220>
<221 >miscdifference
<222>(1)..(15)
<400>I
cctctgtatc cacgaaggat20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>Oryzasativa
<220>
<221 >misc difference
<222>(1)..(20)
<400>2
cactcggagg tctacaatct20
<210>3
<211>22
<212>DNA<213>Oryzasativa
<220>
<221>miscdifference
<222>(1)..(22)
<400>3
gtaatgtcgt aaggaaatgc cc22
<210>4
<211>18
<212>DNA <213>Oryzasativa
<220>
<221>miscdifference
<222>(1)..(18)
<400>4
gcgatgactt gccgctgt18
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>Oryzasativa
<220>
<221>miscdifference
<222>(1)..(21)
<400>5
ctcagcaaca gacagaggag t21
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>Oryzasativa
權(quán)利要求
1.一種快速便捷檢測水稻溫敏不育系的方法，包括以下步驟 對要檢測的株系和野生型提取基因組DNA ； 利用引物進(jìn)行PCR反應(yīng)； 對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳； 電泳結(jié)果中比野生型產(chǎn)物電泳速度快的為攜帶不育基因的溫敏不育系； 步驟2)所述的引物，其特征在于，引物序列由A或B所示的序列之一組成A、RMZ-1lFCCTCTGTATCCACGAAGGAT 和 RMZ-11R: CACTCGGAGGTCTACAATCT ；B、RMZ-13F:GTAATGTCGTAAGGAAATGCCC 和 RMZ-13R: GCGATGACTTGCCGCTGT。
2.一種快速準(zhǔn)確檢測水稻溫敏不育系的方法，包括以下步驟 對要檢測的待檢測材料提取基因組DNA ； 進(jìn)行測序反應(yīng)； 測序序列與野生型以及株IS序列比較，與株IS相同的為攜帶不育基因的不育系；步驟3)所述的測序序列與野生型不同的為攜帶不育基因的不育系，其特征在于，所述不同包含以下特征之一 A、與野生型相比，待測株系第+70的核苷酸由G變成A; B、與野生型相比，待測株系第-1640位的核苷酸從C到T; C、與野生型相比，待測株系第-1132位的核苷酸從T到A; D、與野生型相比，待測株系第-1222位缺失AGA； E、與野生型相比，第-791位的核苷酸A到C； F、與野生型相比，待測株系第-468位的核苷酸T到C; G、與野生型相比，待測株系第-122位的核苷酸從A到C； H、與野生型相比，待測株系第+69位的核苷酸從G到T;1、與野生型相比，待測株系或第+70位的核苷酸C到A; J、與野生型相比，待測株系第-121位的核苷酸缺失T ； K、與野生型相比，待測株系第+1128位的核苷酸從G到A ; L、與野生型相比，待測株系或第+1199位的核苷酸從A到T。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種快速檢測水稻溫敏不育系的方法。首先對要檢測的株系和野生型提取基因組DNA；利用引物進(jìn)行PCR反應(yīng)；對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳；電泳結(jié)果中比野生型產(chǎn)物電泳速度快的為攜帶不育基因的溫敏不育系。此結(jié)果還可以進(jìn)一步利用測序反應(yīng)準(zhǔn)確檢測。該方法大大減少了育種的時間和工作量，對于加快我國雜交水稻的新品種的選育、提高水稻產(chǎn)量、解決我國糧食問題具有重要的意義。
文檔編號A01C1/00GK103026821SQ20111029292
公開日2013年4月10日 申請日期2011年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月30日
發(fā)明者曹曉風(fēng), 楊遠(yuǎn)柱, 周明, 胡小淳 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所, 湖南亞華種業(yè)科學(xué)研究院