專利名稱：水稻光敏感核不育基因pms3的分離克隆及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物基因工程技術領域。具體涉及一種水稻光敏感核不育基因pms3的分離克隆、功能驗證及在水稻改良中的應用。
背景技術：
水稻是世界人口的主要糧食來源之一。隨著世界人口的膨脹，土地面積的減少，水稻單產(chǎn)及總產(chǎn)量的提高一度成為育種工作者追求的目標?；诓挥怠⒈３窒岛突謴拖档摹叭怠狈s交水稻的成功培育與利用堪稱水稻育種史上“一次偉大的革命”，但是，隨著人口的繼續(xù)增長以及人們生活水平的日益提高，對糧食生產(chǎn)提出了更高的要求，三系雜交稻不育胞質(zhì)單一的弊端也逐漸顯露出來，成為了阻礙三系雜交稻進一步推廣和利用的重要因素。光溫敏核不育水稻是石明松1973年從粳稻品種農(nóng)墾58群體中首次發(fā)現(xiàn)的自然 突變體，命名為農(nóng)墾58S(石明松.對光照長度敏感的隱性雄性不育水稻的發(fā)現(xiàn)及初步研究.中國農(nóng)業(yè)科學，1985，2 :44-48)，它在長日照下雄性不育，短日照下雄性可育。利用這個重要特性，該水稻品種在長日高溫條件下可作為不育系用于雜交制種，而在短日低溫條件下又能自交繁殖下一年的不育系種子，因此，在雜交水稻種子生產(chǎn)過程中可以免去作為產(chǎn)生不育系種子的保持系，使常規(guī)使用的“三系”減少為“兩系”。另外，農(nóng)墾58S與其他的水稻品種雜交F1代均為正?？捎?，配組自由度增大，其育性恢復不受胞質(zhì)基因限制，因而比CMS的恢復源更廣泛。通過分離克隆光、溫敏雄性不育基因，研究其作用的機理，闡明其作用的本質(zhì)，并以此為指導，轉(zhuǎn)化到理想的遺傳背景中，將有助于快速創(chuàng)造優(yōu)良的目標品系以應用于生產(chǎn)，從而提高水稻產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從水稻中分離克隆光敏感核不育基因pms3，對該基因進行功能驗證及在水稻育種中的應用。該基因是一個不編碼蛋白的長鏈RNA(見實施例5)。利用該基因的信息將極大的提高了優(yōu)良不育系選育的速度，加快兩系法育種進程，進一步提高水稻的生物學產(chǎn)量。本發(fā)明涉及分離和應用一個包含pms3基因的DNA片段，并對該片段的作用機理進行闡述。這一段DNA具有如SEQ ID NO : I所示的核苷酸序列。本發(fā)明涉及分離和應用編碼長鏈RNA的光敏感核不育基因pms3，這個基因具有如SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列，包括與SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列有90%以上同源性的基因序列，也包括因插入、替代或缺失一個或多個堿基而產(chǎn)生的突變體等位基因或衍生物。這個基因的等位基因具有如SEQID NO :3所示的核苷酸序列。本發(fā)明克隆的水稻光敏感核不育基因pms3突變植株，其花粉的育性受到光照長度的影響在長日照條件下，花粉完全敗育；而短日照條件下，花粉則表現(xiàn)部分或全部可育。將突變植株中的包含pms3基因的DNA片段通過遺傳轉(zhuǎn)化的方法導入到正常水稻品種中，可以使正常水稻的花粉敗育(見實施例I)，可用于新的不育系的培育。本發(fā)明涉及根據(jù)pms3的DNA片段序列信息發(fā)展的用于培育水稻光敏感核不育系的分子標記，通過對水稻正常植株與光敏感突變植株的pms3基因區(qū)段的DNA序列比較分析發(fā)現(xiàn)，光敏感突變植株的pms3基因中有一個特有的單堿基的替換突變，根據(jù)這個單堿基的突變，我們發(fā)展了可以用于輔助育種的分子標記(見實施例2)。本發(fā)明中，pms3基因表達量的上升可以使光敏感雄性不育植株的花粉恢復正常，將該基因構(gòu)建到植物表達載體中時，可在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上任何一種強啟動子或誘導型啟動子，使pms3基因在不育植株中過量表達或者誘導表達，可以人工改變水稻的花粉育性，用于水稻育種(見實施例4)。


序列表SEQ ID NO 1顯示的是本發(fā)明分離克隆的包含有pms3基因的DNA片段序列(全長6440bp ;在第171 Ibp處堿基G突變?yōu)镃)。序列表SEQ ID NO 2顯示的是本發(fā)明分離克隆的pms3基因的核苷酸序列(全長1236bp,不含intron,不編碼蛋白，該DNA序轉(zhuǎn)錄成RNA后就能發(fā)揮功能)。序列表SEQ ID NO 3顯不的是本發(fā)明分尚克隆的pms3基因等位基因的核昔酸序列(全長1236bp,不含intron,不編碼蛋白，該DNA序轉(zhuǎn)錄成RNA后就能發(fā)揮功能,相對于SEQ ID NO 2所示的序列的第790位的“C”，該序列在第790bp處存在一個等位基因突變， 即由C突變?yōu)镚)。圖I :互補載體pCAMBIA1301示意圖。圖2. pms3基因功能互補實驗。圖中A S6K互補轉(zhuǎn)化成熟時期陰性植株(左)與陽性植株(右)株型比較；B :成熟時期陰性植株(左)與陽性植株(右)小穗育性比較；C 開花時期陰性植株(左)與陽性植株(右)的小花形態(tài)比較；D :開花時期陰性植株(左)與陽性植株(右)的花藥形態(tài)觀察；E :陰性植株花粉碘染，bar = 50 μ m ；F :陽性植株花粉碘染，bar = 50 μ m ；G :1\代陰性植株(_)與陽性植株(+)花粉育性與小穗育性統(tǒng)計(3個家系)，數(shù)值代表平均值+/_標準誤。圖3 :基于農(nóng)墾58S突變序列發(fā)展的分子標記。圖中A :本發(fā)明中CAPS標記形成的原理；B =CAPS標記農(nóng)墾58，農(nóng)墾58S及DH80中的基因型表現(xiàn)；C :利用該CAPS標記對6種常規(guī)水稻品種及42種野生稻品種的基因型鑒定，C中所涉及的水稻資源如下所述(具體來源見《遺傳資源來源披露登記表》，該遺傳資源不是作為本發(fā)明的遺傳用途，僅僅是作為測試材料的對照)I-珍汕97 ；2-明恢63 ;3_日本晴；4_中花11 ;5_牡丹江8 ;6-農(nóng)墾58S ;7-農(nóng)墾 58 ;8-DH80 ;9-mPA64s ; 10-IRGC 1012 ;11_IRGC 1034 ;12_IRGC 14619 ;13_IRGC 17376 ；14-IRGC 26977 ;15-IRGC 27635 ; 16-IRGC 30346 ; 17-IRGC 53453 ; 18-IRGC 53454 ；19-IRGC 66515 ；20-IRGC 66528 ;21_IRGC 66560 ;22_IRGC 66627 ;23_IRGC 66809 ；24-IRGC 66813 ;25-IRGC 66831 ;26_IRGC 77144 ;27_IRGC 73118 ;28_IRGC 74730 ；28-IRGC 76290 ；30-IRGC 76404 ;31_IRGC 77143 ;32_IRGC 77144 ;33_IRGC 77529 ；34-IRGC 77636 ;35_IRGC 77645 ;36_IRGC 77665 ;37_IRGC 78269 ;38_IRGC 80180 ；39-IRGC 81586 ;40-IRGC 82097 ；41-IRGC 84154 ；42-IRGC 104921 ；43-IRGC 113509 ；44-IRGC 80622 ;45_IRGC 81831 ;46_IRGC 81845 ;47_IRGC 81883 ;48_IRGC 81915 ；49-IRGC 81928 ;50_IRGC 82037 ;51_IRGC 83795。
上述以IRGC編號開頭的為國際水稻研究所統(tǒng)一編號的野生稻品種。圖4 :超量表達載體pCAMBIA1301A構(gòu)建示意圖。圖5 :pms3基因超量表達轉(zhuǎn)基因植株的表型。圖中A :pms3基因超量表達轉(zhuǎn)基因植株!\代單株pms3基因的表達量檢測(上)及GUS標記檢測(下)；B =T1代陰性植株㈠與陽性植株(+)花粉育性與小穗育性統(tǒng)計(3個家系)，數(shù)值代表平均值+/-標準誤。C:pms3基因超量表達轉(zhuǎn)基因陽性植株與陰性植株成熟期整株表現(xiàn)；D pms3基因超量表達轉(zhuǎn)基因陽性植株與陰性植株剛開花后花藥形態(tài)比較，左邊為陰性植株的花藥，右邊為陽性植株的花藥；Bars = O. 5mm。E pms3基因超量表達轉(zhuǎn)基因陽性植株與陰性植株小穗形態(tài)比較，左邊為陰性植株的小穗，右邊為陽性植株的小穗；F pms3基因超量表達轉(zhuǎn)基因陽性植株與陰性植株花粉育性比較，上邊為陰性植株的花粉，右邊為陽性植株的花粉，Bars = 50μπιο圖6 :pms3基因在水稻全生育期不同組織中的表達分析。編號1_15分別代表水稻不同發(fā)育時期的不同組織1，苗期根；2，苗期葉；3，分蘗期葉；4，二次枝梗分化期葉鞘；5，·雌雄蕊形成期莖；6，二次枝梗分化期葉片；7，雌雄蕊形成期葉片；8，花粉母細胞形成期葉片；9，花粉母細胞有絲分裂期劍葉；10，二次枝梗分化期幼穗；11，雌雄蕊形成期幼穗；12，花粉母細胞時期幼穗；13，花粉母細胞減數(shù)分裂期幼穗；14，有絲分裂期時期的穗；15，抽穗期的小穗。圖7 :原位雜交確定pms3基因在水稻中的表達部位。圖中A :該基因在農(nóng)墾58葉鞘中有微量表達:該基因在農(nóng)墾58葉片中有微量表達；C :該基因在農(nóng)墾58花粉母細胞中表達；D :該基因在農(nóng)墾58減數(shù)分裂的花藥中表達；E :該基因在農(nóng)墾58減數(shù)分裂后液泡化小孢子中表達；F :陰性對照。標尺長度為15 μ m。圖8 :農(nóng)墾58和農(nóng)墾58S花藥石蠟切片的比較。圖中A、B、C、D、E和F分別表示農(nóng)墾58花藥在孢母細胞細胞時期、減數(shù)分裂二分體時期、減數(shù)分裂四分體時期、小孢子時期、液泡化花粉時期和成熟花粉期的花藥橫切片；G、H、I、J、K和L分別表示農(nóng)墾58S花藥在孢母細胞細胞時期、減數(shù)分裂二分體時期、減數(shù)分裂四分體時期、小孢子時期、液泡化花粉時期和成熟花粉期的花藥橫切片。英文字母分別表示花藥的結(jié)構(gòu)。E，表皮細胞；En，藥室內(nèi)壁；ML，中層；T，絨氈層；Ms,造孢細胞；Msp,小孢子Mp,成熟花粉Bars = 15 μ m。
具體實施例方式以下實施例進一步定義本發(fā)明，并描述了本發(fā)明在上述前期工作基礎上分離克隆pms3基因以及驗證pms3基因功能的方法。根據(jù)以下的描述和這些實施例，本領域技術人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，對本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。實施例I :分離克隆包含有pms3基因區(qū)段的DNA片段I.利用圖位克隆技術鑒定水稻光敏感核不育基因pms3本發(fā)明中基因的定位群體所用到的親本包括農(nóng)墾58S和DH80，其中DH80由農(nóng)墾SSS/BHFi代花藥培養(yǎng)加倍而來(水稻材料農(nóng)墾58S來源文獻Li X.，Lu Q.，Wang F.，Xu C.，Zhang Q. 2001，Separation of thetwo-locus inheritance ofphotoperiod-sensitive genic male sterility in rice and precisely mapping thepms3 locus. Euphytica 119:343-348)。本發(fā)明的基因定位工作中總共構(gòu)建了農(nóng)墾58S/DHSOF2隨機群體約7000株的定位群體，在武漢華中農(nóng)業(yè)大學試驗田分單株種植，通過兩年田間育性觀察，得到極端不育單株892株(水道材料來源農(nóng)墾58S/DH80F2 Lu Q.，Li X.，Guo D. ,Xu C·,Zhang Q. 2005,Localization of pms3,a gene forphotoperiod-sensitivegenic male sterility, to a 28.4~kb DNA fragment. Mol Genet Genomics 273 507-511)。將這些極端不育單株的葉片按照常規(guī)報道的CTAB法全部抽提總DNA，酶切轉(zhuǎn)膜，對pms3區(qū)段的分子標記進行重組交換分析?？侱NA的抽提按Murray和Thompson (MurrayM. G. , Thompson ff. F. 1980, Rapidisolation of high molecular weight plant DNA. NuclAcids Res. 8 =4321-4325)的CTAB法進行。分子標記的RFLP分析，包括DNA酶切、電泳、轉(zhuǎn)膜和雜交，按 Liu 等人的實驗程序進行(Liu K et al. 1997, A genome-wideanalysis of widecompatibility in rice and the precise location of the S51ocus in the molecularmap. Theor ApplGenet. 95 :809_814)。pms3 基因被限定在分子標記 237295/HhaI (自己命名)和148125L/177182R/BsrBI (自己命名)之間，它們之間的物理距離是12kb。結(jié)果如表 I所示。2.遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建我們采用互補轉(zhuǎn)化與超量表達轉(zhuǎn)化的方式來進一步確定基因的功能。本發(fā)明中，花粉育性受到一對等位基因的控制，武漢夏季長日照條件下，農(nóng)墾58正?？捎?，農(nóng)墾58S完全敗育，而農(nóng)墾58與農(nóng)墾58S的雜種育性為50%，甚至更低。我們不能直接區(qū)分它們的顯隱性關系，因此，我們采用雙向互補轉(zhuǎn)化的策略驗證基因的功能?；パa載體構(gòu)建方法如下以pCAMBIA1301載體為骨架載體，用SacI與SalI雙酶切農(nóng)墾58的BAC，BAC的編號為117H5，得到6440bp大小的基因組片段，該片段位于上述定位區(qū)間12kb內(nèi)，將該片段連接到PCAMBIA1301中，即N6K互補轉(zhuǎn)化載體。在N6K載體基礎上用KpnI單酶切后回收載體，同時以58S DNA為模本，用引物SNP-Fl與pms3_F4配對擴增，獲得1852bp外源，將PCR產(chǎn)物TA clone測序驗證，然后用KpnI單酶切獲得1477bp長的片段，與回收的載體連接，得到的陽性克隆為S6K。N6K與S6K除了一個SNP差異外，其余全部相同，全長6440bp (該片段的DNA序列如序列表SEQ ID NO 1所示，在第171 Ibp處，N6K為C堿基，S6K為G堿基)。表I定位區(qū)間分子標記分析重組單株結(jié)果(部分數(shù)據(jù))
權利要求
1.一種分離的編碼長鏈RNA的光敏感核不育基因pms3在控制水稻花粉育性中的應用，其特征在于，該基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2.如權利要求I所述的基因pms3的等位基因pms3在控制水稻花粉育性中的應用，其特征在于，所述的等位基因pms3的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :3所示，在該序列的第790bp處存在一個堿基突變。
3.—種檢測水稻光敏感核不育基因的分子標記，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N01所示，在該序列的171 Ibp處存在一個堿基突變。
4.權利要求3所述的分子標記在水稻光敏感核不育系標記輔助選育中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術領域，具體涉及水稻基因工程技術領域。本發(fā)明通過圖位克隆的方法分離得到一個編碼長鏈RNA的光敏感核不育基因pms3，該基因能調(diào)控水稻花粉的育性。pms3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。其等位基因的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示，在該序列的790bp處存在一個由C到G的等位基因突變。本發(fā)明還得到一種選育水稻光敏感核不育基因的分子標記，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，在該序列的1711bp處存在一個堿基突變。本發(fā)明獲得的控制水稻花粉育性的基因pms3，其等位基因以及選育水稻光敏感核不育系的分子標記可廣泛應用到水稻的育種與遺傳改良，尤其是在新的水稻不育系的產(chǎn)生，光敏感水稻不育系的選育中的應用。
文檔編號A01H5/00GK102952795SQ20111024036
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月18日 優(yōu)先權日2011年8月18日
發(fā)明者張啟發(fā), 丁寄花, 陸青 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學