專利名稱：用于凍存單個核細胞的凍存液的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，尤其涉及用于凍存單個核細胞的凍存液及其制備方法。
背景技術：
正常情況下，液體凍結時會產(chǎn)生規(guī)則或不規(guī)則的晶體，易造成細胞膜破裂進而對活細胞造成直接損傷。因此，為減少凍存過程中細胞的損傷，往往需要使用含低溫保護劑的凍存液。常用的低溫保護劑有二甲基亞砜(DMS0)、甘油和葡聚糖等，其中以DMSO最為常用。 使用純動物血清結合DMSO是常用的凍存液，但動物血清可能含有動物性的病原微生物，有可能與凍存的細胞發(fā)生交叉感染，一旦發(fā)生感染，后續(xù)復蘇和洗滌很難清除。培養(yǎng)基和羥乙基淀粉溶液也常作為細胞凍存液的主要成分，用于細胞凍存。單個核細胞(MNC)是由新鮮臍帶血或骨髓經(jīng)過密度梯度離心后獲得的包括淋巴細胞、單核細胞等在內的細胞混合群體，其中含有一些干細胞和祖細胞。MNC成分復雜，各種類型的細胞在凍存過程的耐受能力有差異，各種類型的細胞適用的凍存液往往不同。因此，現(xiàn)有的凍存液用于MNC的凍存效果往往不夠理想。

發(fā)明內容
為解決現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明提供一種用于凍存單個核細胞的凍存液， 可適用于單個核細胞中各種類型細胞的凍存，提高了單個核細胞的凍存效果。一個方面，本發(fā)明提供一種用于凍存單個核細胞的凍存液，包含血漿和二甲基亞砜。本發(fā)明提供的用于凍存單個核細胞的凍存液，包含血漿和二甲基亞砜，但不僅限于血漿和二甲基亞砜，也可以包含動物血清和培養(yǎng)基等成分。臍帶血血漿中富含各種礦物質離子和蛋白因子，提供細胞代謝所需物質并維持細胞所需的滲透壓，是天然的營養(yǎng)體系和緩沖體系。將自體臍帶血血漿用于臍帶血來源MNC 的凍存，避免了動物源病原微生物的交叉感染風險，可使MNC的凍存更加安全有效，便于凍存細胞后續(xù)的臨床應用。作為本發(fā)明的進一步改進，所述血漿的體積百分比為909Γ95% ；所述二甲基亞砜的體積百分比為59TlO%。二甲基亞砜(DMSO)是最常用的低溫保護劑，但DMSO具有較強的毒副作用。因此， 在保證凍存效果的同時，盡量減少DMSO的使用量，可減少細胞的損傷，使MNC的凍存更加安全。另一方面，本發(fā)明提供一種制備用于凍存單個核細胞的凍存液的方法，包括以下步驟
Α)取新鮮臍帶血于無菌離心管中，在觀00 rpm離心16 min后，收集上清液，即為血漿； B)將所述血漿和所述二甲基亞砜混合均勻，血漿的體積百分比為909Γ95%，二甲基亞砜的體積百分比為59TlO%。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是將臍帶血MNC分離中富余的血漿用于MNC 的凍存，實現(xiàn)了富余血漿的“廢物利用”，不用專門購買動物血清、培養(yǎng)基等昂貴試劑，節(jié)約了資源和成本；可適用于MNC中各種類型細胞的凍存，提高了 MNC凍存的細胞復蘇活率，凍存效果好；避免了動物源病原微生物的交叉感染風險，可使MNC的凍存更加安全有效，便于凍存細胞后續(xù)的臨床應用。


圖1為本發(fā)明實施例四中造血干細胞⑶34表達流式檢測結果；圖1-a 凍存前； 圖1-b :DMEM凍存后；圖1-c =HES凍存后；圖l_d 血漿凍存后。圖2為本發(fā)明實施例五中細胞集落形態(tài)特征圖；圖1-a:紅細胞集落，放大倍數(shù)為100倍；圖1-b 爆式紅細胞集落，放大倍數(shù)為100倍；圖I-C 巨噬細胞集落，放大倍數(shù)為 100倍；圖Ι-d 粒-巨噬細胞集落，放大倍數(shù)為100倍；圖Ι-e 混合大集落，放大倍數(shù)為100 倍；圖l_f 粒細胞集落，放大倍數(shù)為40倍。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。實施例一凍存液的配制。超凈工作臺中，取新鮮臍帶血于無菌離心管中，在觀00 rpm離心16 min后，收集上清液，即為血漿。將血漿(Blood plasma)和二甲基亞砜(DMSO)按19:1的體積比混合均勻，得本發(fā)明提供的血漿凍存液。為便于凍存效果的比較，配制現(xiàn)有技術的DMEM凍存液DMEM基礎培養(yǎng)基與DMSO 以19:1的體積比混合均勻；HES凍存液醫(yī)用6%羥乙基淀粉溶液(HES)與DMSO以19:1的體積比混合均勻。本文中，DMEM指的是DMEM基礎培養(yǎng)基，HES指的是醫(yī)用6%羥乙基淀粉溶液。實施例二 MNC的凍存。配制如上所述的血漿凍存液、DMEM凍存液和HES凍存液，放4°C冰箱預冷。收集培養(yǎng)的MNC，在200 g離心10 min后，棄上清液，用生理鹽水懸浮細胞，取樣計數(shù)。依據(jù)細胞計數(shù)情況將細胞均分成三組，分別命名為血漿凍存組、DMEM凍存組和HES凍存組，在200g離心10 min,棄上清液，加入相應的凍存液，輕輕混勻。將混勻后的細胞分裝入凍存管，做好標記，將凍存管置于程序降溫盒中，再移入-80°C冰箱，隔天轉入液氮罐中凍存。MNC細胞經(jīng)過液氮凍存2天以上，視試驗需要即可進行復蘇操作。實施例三MNC凍存的細胞復蘇活率分析。將恒溫水浴箱的溫度調節(jié)至40°C，分別從液氮罐中取出血漿凍存組、DMEM凍存組和HES凍存組的凍存管，每組取三個平行樣，立即投入水浴鍋中，快速搖動，細胞凍存液完全融解時，噴75%乙醇；超凈工作臺中進行操作，酒精燈焰快速灼燒凍存管蓋子，打開各凍存管蓋子，從各凍存管中將細胞懸液全部轉移至標記好的無菌離心管中，往無菌離心管中緩慢加入凍存液5倍體積以上的冷生理鹽水，輕輕混勻，在200g離心10 min,棄上清液，用培養(yǎng)液或者PBS重懸細胞，輕輕混勻，取樣計算細胞凍存前活率。MNC凍存的細胞復蘇活率采用臺盼蘭染色結合顯微鏡計數(shù)法進行分析。臺盼蘭染液與細胞懸液均勻混合后1 min內即在顯微鏡下計數(shù)，計四個中方格，每個中方格有4(Γ80 個細胞為宜，四個中方格細胞計數(shù)總量不少于100。染成藍色的細胞計為死細胞。細胞活率的計算公式為I-Nd (死細胞數(shù))/Nt (細胞總數(shù))。 MNC凍存的細胞復蘇活率分析結果如表1所示。從表1可以看出，血漿凍存組的細胞復蘇活率明顯高于DMEM凍存組和HES凍存組，說明本發(fā)明提供的凍存液用于凍存MNC， 提高了 MNC凍存的細胞復蘇活率。采用SPSS11. 5統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行完全隨機設計資料單因素方差分析，*表示血漿凍存組的細胞復蘇活率明顯高于DMEM凍存組和HES凍存組 (Ρ<0. 05)。
表1不同凍存液凍存MXC的細胞復蘇活率
權利要求
1.一種用于凍存單個核細胞的凍存液，其特征在于包含血漿和二甲基亞砜。
2.根據(jù)權利要求1所述的用于凍存單個核細胞的凍存液，其特征在于所述血漿的體積百分比為90°/Γ95% ；所述二甲基亞砜的體積百分比為59TlO%。
3.一種制備權利要求1所述的用于凍存單個核細胞的凍存液的方法，其特征在于，包括以下步驟Α)取新鮮臍帶血于無菌離心管中，在2800 rpm離心16 min后，收集上清液，即為血漿； B)將所述血漿和所述二甲基亞砜混合均勻，血漿的體積百分比為909Γ95%，二甲基亞砜的體積百分比為59TlO%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于凍存單個核細胞的凍存液及其制備方法，屬于生物技術領域。用于凍存單個核細胞的凍存液，包含血漿和二甲基亞砜。本發(fā)明主要應用于單個核細胞的凍存，具有凍存效果好和節(jié)約成本的優(yōu)點。
文檔編號A01N1/02GK102301992SQ201110185230
公開日2012年1月4日 申請日期2011年7月4日 優(yōu)先權日2011年7月4日
發(fā)明者劉陳雄, 吳莉芳, 姜舒, 李陶, 胡祥 申請人:深圳市北科生物科技有限公司