專利名稱：一種擴(kuò)大普陀鵝耳櫪種群數(shù)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物學(xué)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種擴(kuò)大普陀鵝耳櫪種群數(shù)量的方法。
背景技術(shù)：
普陀鵝耳櫪(Carpinus putoensis Cheng)是我國(guó)著名佛教勝地普陀山的一棵“圣樹”，于上世紀(jì)三十年代被國(guó)內(nèi)學(xué)者鐘觀光先生發(fā)現(xiàn)、鄭萬(wàn)鈞先生鑒定并發(fā)表。這種樹在全球僅存I棵野生植株，俗稱“地球獨(dú)生子”，加之它地處浙江舟山普陀風(fēng)景區(qū)，且富有濃厚的神話色彩和豐富的文化底蘊(yùn)，每天來(lái)普陀山朝圣拜樹者絡(luò)繹不絕，對(duì)普陀風(fēng)景區(qū)旅游經(jīng)濟(jì)的振興可謂功不可沒(méi)。然而，該樹樹齡已經(jīng)超過(guò)200年，日趨老化，長(zhǎng)勢(shì)堪憂，一旦死亡，不但導(dǎo)致普陀鵝耳櫪這一重要物種的滅絕，而且對(duì)普陀風(fēng)景區(qū)的旅游經(jīng)濟(jì)也會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的影 響。鑒于普陀鵝耳櫪“天下唯一”的瀕危狀況，早在1987年國(guó)際物種保護(hù)委員會(huì)(SSC)就將其列為全球最瀕危的12種植物之一，1999年經(jīng)國(guó)務(wù)院正式批準(zhǔn)為我國(guó)一級(jí)保護(hù)樹種，2004年普陀鵝耳櫪被《中國(guó)物種紅色名錄》列為極危(CRD)物種(汪松，解炎，2004，北京高等教育出版社，312)。在植物分類學(xué)上，普陀鵝耳櫪也具有重要的研究和保護(hù)價(jià)值。長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)該瀕危物種的保護(hù)措施卻不盡人意，僅限于采用傳統(tǒng)方法(如播種、嫁接等)繁殖獲得極少量幼樹。1990年，盧小根等就普陀鵝耳櫪播種繁殖發(fā)芽率特低的問(wèn)題對(duì)普陀鵝耳櫪的開花授粉習(xí)性及結(jié)實(shí)飽滿程度進(jìn)行了調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)該物種雌雄蕊花期相遇時(shí)間短且雄蕊活力低是其瀕臨滅絕的主要原因(盧小根，鄒達(dá)明，1990。普陀鵝耳櫪瀕危原因的調(diào)查研究，浙江林業(yè)科技，第10卷，第5期61-64)。1991年，馮玉寶等以廬山野生雷公鵝耳櫪為砧木對(duì)普陀鵝耳櫪進(jìn)行嫁接繁殖，獲得了 50余株苗木(馮玉寶，文林，1996。廬山普陀鵝耳櫪移地保存試驗(yàn)，林業(yè)科技通訊，第5期23-25)，且未見(jiàn)植株成活的后續(xù)報(bào)道。目前，舟山林科所也采用傳統(tǒng)繁殖方法獲得少量幼樹，但數(shù)量仍十分有限，不能滿足物種自然更替對(duì)種群數(shù)量的基本要求，更談不上用于城市景觀綠化和回歸大自然發(fā)揮其應(yīng)有的生態(tài)效應(yīng)。普陀鵝耳櫪是被子植物門雙子葉植物綱山毛櫸目樺木科鵝耳櫪屬的高大落葉喬木，因其在地球上的“唯一性”，在植物分類學(xué)、系統(tǒng)進(jìn)化等方面具有不可或缺的保護(hù)價(jià)值和研究地位。因此，快速有效離體培養(yǎng)普陀鵝耳櫪試管苗，擴(kuò)大普陀鵝耳櫪的種群數(shù)量，從而緩解或解決其瀕危狀況迫在眉睫，具有重要的物種保護(hù)價(jià)值和商業(yè)開發(fā)前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種擴(kuò)大普陀鵝耳櫪種群數(shù)量的方法。在本發(fā)明的第一方面,提供一種栽培普陀鵝耳櫪(Carpinus putoensis Cheng)的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含
(I) KNO31500mg/L ；(2) NH4NO3730mg/L ；(3) MgSO4 7H20150mg/L ；(4) KH2PO4170mg/L ；(5) CaCl 2H20220mg/L ；(6) NH4Cl530mg/L ；(7) Ca (NO3) 2 2H20660mg/L ；
(8) KCl65mg/L ；(9) H3BO36. 2mg/L ；(10) ZnSO4 7H208. 6mg/L ；(11) MnSO4 H2O22. 3mg/L ；(12) Na2MoO4 2H200. 25mg/L ；(13) KI0. 83mg/L ；(14) CuSO4 5H200. 25mg/L ；(15) CoCl20. 025mg/L ；(16) FeSO4 7H2027. 8mg/L ；(17) Na2 EDTA H2O37. 3mg/L ；(18) Myo-Insitol150mg/L ；(19)甘氨酸(Glycine)2. Omg/L ；(20)鹽酸硫胺(Thiamine HCl)0. 5mg/L ；(21)煙酸(Nicotinic acid)0. 2mg/L ；(22)鹽酸批P多醇(Pyridoxine HCl) 0. 2mg/L ；(23)香蕉提取物10ml/L;其中，組分⑴ ⑶在培養(yǎng)基中的含量可±10%，組分(9) (23)在培養(yǎng)基中的含量可±5%。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于普陀鵝耳櫪生根的培養(yǎng)基，其中包含1/2-3/4倍含量的所述的組分⑴ ⑶，以及1/2-1倍含量的所述的組分(9) (23)。在另ー優(yōu)選例中，其中還含有生長(zhǎng)因子，所述的生長(zhǎng)因子選自6_芐氨基腺嘌呤(BA)，萘こ酸(NAA)，噻ニ唑苯基脲(TDZ)，赤霉素(GA3)，吲哚丁酸(IBA)。在另ー優(yōu)選例中，所述的生長(zhǎng)因子是0. 5 3mg/L(較佳地1-2. 5mg/L)6-節(jié)氨基腺嘌呤,0. I 0. 5mg/L(較佳地是0. 2-0.4mg/L)萘こ酸和0 0. 01mg/L(較佳地是0. 002-0. 008mg/L)噻ニ唑苯基脲；或者0. 5 3mg/L 6_節(jié)氨基腺嘌呤(較佳地1-2. 5mg/L) ,0. I 0. 5mg/L (較佳地是0. 2-0.4mg/L)萘こ酸和0-0. 6mg/L赤霉素(較佳地是0. 1-0. 5mg/L);或者0. I 0. 5mg/L 吲哚丁酸(較佳地是 0. 2-0. 4mg/L)。在另ー優(yōu)選例中，所述的香蕉提取物如下制備新鮮香蕉去皮搗碎，按照Ig加入4 8mL(較佳地5-8mL)水的比例加水煮沸，冷卻后過(guò)濾，收集濾液。在另ー優(yōu)選例中，所述的培養(yǎng)基的PH值是5. 5 6. 5。在本發(fā)明的另一方面，提供ー種栽培普陀鵝耳櫪的方法，包括
(I)取普陀鵝耳櫪枝條切段，獲得外植體；(2)將外植體接種于包含6-芐氨基腺嘌呤、萘こ酸的所述的培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)，獲得包含芽(包括定芽和不定芽)的愈傷組織；(3)將包含芽的愈傷組織轉(zhuǎn)接于包含6-芐氨基腺嘌呤和萘こ酸、及選擇性包含噻ニ唑苯基脲或赤霉素的所述的培養(yǎng)基上進(jìn)行伸長(zhǎng)培養(yǎng)，獲得伸長(zhǎng)的芽；(4)將伸長(zhǎng)的芽苗(較佳地，芽苗基部帶有少量愈傷組織)在包含6-芐氨基腺嘌呤、萘こ酸、噻ニ唑苯基脲的所述的培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2-9天(較佳地3-7天)，獲得暗培養(yǎng)之后的芽苗； (5)將暗培養(yǎng)之后的芽苗分離成單株，轉(zhuǎn)接于包含吲哚丁酸、蔗糖和Gelrite的1/2-3/4培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，獲得生根苗；(6)將生根苗進(jìn)行耐受培養(yǎng)和煉苗；(7)煉苗后轉(zhuǎn)入大棚中培養(yǎng)，獲得普陀鵝耳櫪再生植株。在另ー優(yōu)選例中，步驟⑴之取枝條前，還包括將普陀鵝耳櫪的枝條用0. ImmXO. Imm的尼龍網(wǎng)袋套住1-3個(gè)月。在另ー優(yōu)選例中，在每年的4-7月取枝條。在另ー優(yōu)選例中，步驟(I)中，枝條切段后還進(jìn)行清洗除菌；或外植體的長(zhǎng)度是0. 5-6cm(較佳地是l_3cm)。在另ー優(yōu)選例中，采用水、こ醇和/或升汞清洗除菌。在另ー優(yōu)選例中，步驟(2)中，6-芐氨基腺嘌呤的濃度是0. 5 3mg/L (較佳地是1-2. 5mg/L);或萘こ酸的濃度是0. I 0. 5mg/L(較佳地是0. 2-0. 4mg/L)。在另ー優(yōu)選例中，步驟(2)中，包括至少一次(較佳地2-6次；更佳地3-5次)的轉(zhuǎn)接步驟，2-4周繼代(轉(zhuǎn)接)一次。在另ー優(yōu)選例中，步驟(3)中，6-芐氨基腺嘌呤的濃度是0. 5 3mg/L (較佳地是1-2. 5mg/L);萘こ酸的濃度是0. I 0. 5mg/L (較佳地是0. 2-0. 4mg/L);噻ニ唑苯基脲的濃度是0-0. 01mg/L (較佳地是0. 002-0. 008mg/L);或赤霉素的濃度是0-0. 6mg/L (較佳地是0. 1-0. 5mg/L)。在另ー優(yōu)選例中，步驟(3)中，包括(a)將包含芽的愈傷組織轉(zhuǎn)接于包含6-芐氨基腺嘌呤、萘こ酸、噻ニ唑苯基脲的所述的培養(yǎng)基上進(jìn)行伸長(zhǎng)培養(yǎng)，獲得形態(tài)清晰的芽；(b)將(a)獲得的芽轉(zhuǎn)接于包含6-芐氨基腺嘌呤、萘こ酸、赤霉素的所述的培養(yǎng)基上進(jìn)行伸長(zhǎng)培養(yǎng)，獲得伸長(zhǎng)的芽。在另ー優(yōu)選例中，步驟(4)中，6-芐氨基腺嘌呤的濃度是0. 5 3mg/L (較佳地是1-2. 5mg/L);萘こ酸的濃度是0. I 0. 5mg/L (較佳地是0. 2-0. 4mg/L);或赤霉素的濃度是0-0. 6mg/L (較佳地是 0. 1-0. 5mg/L)。在另ー優(yōu)選例中，步驟(5)中，吲哚丁酸的濃度是0. I 0. 5mg/L(較佳地是0. 2-0. 4mg/L);蔗糖的濃度是0.5-5% (w/v)(較佳地是1-4 % ;更佳地是2-3 % );或Gelrite 的濃度是 0. 1-0. 5 (w/v)(較佳地是 0. 15-0. 4% ;更佳地是 0. 2-0. 3% )。在另ー優(yōu)選例中，步驟(5)中，分離單株后，還包括將芽苗用40_60mg/L的吲哚丁酸處理5-48小時(shí)(較佳地10-36小時(shí))，切除形態(tài)學(xué)下端0. 5-3mm(較佳地0. 8-1. 5mm)莖段，之后再轉(zhuǎn)接。在另一優(yōu)選例中，步驟⑵-⑶的光照條件是60±10μπιο1·πΓ2· s'16±2h/d ；步驟(5)-(6)的光照條件是80±10 μ mol. πΓ2· s'16±2h/d ;或步驟(7)的光照條件是自然光照。在另一優(yōu)選例中，步驟(2-(4)的培養(yǎng)溫度為23±2°C (較佳地22_23°C )；步驟(5)的培養(yǎng)溫度為24±2°C (較佳地24±1°C );或步驟(6) - (7)的培養(yǎng)溫度為28 ± 3°C (較佳地28 ± 2°C )。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn) 的。


圖I、普陀鵝耳櫪離體再生體系。A :初始外植體切段，比例尺為3cm ；B :原始不定芽和定芽，比例尺為4mm ；C :芽，比例尺為5mm ;D :伸長(zhǎng)的叢芽，比例尺為6_ ；E :生根小苗，比例尺為Icm ；F :再生植株，比例尺為5cm。
具體實(shí)施例方式為盡快緩解普陀鵝耳櫪(Carpinus putoensis Cheng)的漸危狀況與合理利用其生態(tài)功能，本發(fā)明人對(duì)普陀鵝耳櫪的離體快速繁殖進(jìn)行了深入的研究和改進(jìn)，克服了現(xiàn)有技術(shù)中難以獲得再生植株的缺陷，成功獲得了相當(dāng)數(shù)量的再生植株。培養(yǎng)基鑒于本領(lǐng)域目前難以培育普陀鵝耳櫪的技術(shù)難題，本發(fā)明人致力于研究其離體再生技術(shù)，發(fā)現(xiàn)普陀鵝耳櫪離體再生成功的一個(gè)關(guān)鍵在于找到適宜的培養(yǎng)基。通常地，植物培養(yǎng)基的成分主要可以分水、無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)物、天然復(fù)合物、培養(yǎng)體的支持材料等五大類。本發(fā)明人對(duì)這些主要成分均進(jìn)行了反復(fù)地優(yōu)化，并添加了一些個(gè)性化的材料如香蕉提取物，從而給予了普陀鵝耳櫪適宜分化、伸長(zhǎng)、生根的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境。如本文所用，所述培養(yǎng)基中各成分的計(jì)量是以培養(yǎng)基總體積計(jì)。本發(fā)明的培養(yǎng)基成分中，包含“大量成分”和“小量成分”。所述的“大量成分”是指在培養(yǎng)基中濃度相對(duì)高的成分；而“小量成分”則是指在培養(yǎng)基中濃度相對(duì)低的成分。本發(fā)明的基本培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱PT培養(yǎng)基)中，大量成分包括表I中所列的編號(hào)為1-8的成分，它們?cè)谂囵B(yǎng)基中的含量還可上下浮動(dòng)10% ;較佳地浮動(dòng)5%。本發(fā)明的基本培養(yǎng)基中，小量成分包括表I中所列的編號(hào)為9-23的成分，它們?cè)谒鼈冊(cè)谂囵B(yǎng)基中的含量還可上下浮動(dòng)5% ;較佳地浮動(dòng)3%。根據(jù)本發(fā)明提供的基本培養(yǎng)基，在植株培育的不同階段上，還可添加不同的生長(zhǎng)因子以促進(jìn)植株在該階段的生長(zhǎng)。植物生長(zhǎng)因子是植物細(xì)胞、組織、器官離體培養(yǎng)中重要的物質(zhì)，是啟動(dòng)細(xì)胞脫分化、分裂和再分化的關(guān)鍵性激素。因此，本發(fā)明的培養(yǎng)基中，還可添加選自以下的一種或多種生長(zhǎng)因子細(xì)胞分裂素6-芐氨基腺嘌呤(BA)及噻二唑苯基脲(TDZ)，生長(zhǎng)素萘乙酸(NAA)，赤霉素(GA3)和/或吲哚丁酸(IBA)。所述的赤霉素后可使芽得到有效伸長(zhǎng)；而所述的吲哚丁酸可促進(jìn)芽苗的生根。更佳地，本發(fā)明的培養(yǎng)基中，添加的生長(zhǎng)因子選自0. 5 3mg/L(較佳地1-2. 5mg/L)6-芐氨基腺嘌呤，O. I O. 5mg/L (較佳地是O. 2-0. 4mg/L)萘乙酸和O O. 01mg/L (較佳地是O. 002-0. 008mg/L)噻二唑苯基脲；或者O. 5 3mg/L 6-芐氨基腺嘌呤(較佳地1-2. 5mg/L), O. I O. 5mg/L (較佳地是O. 2-0. 4mg/L)萘乙酸和0-0. 6mg/L赤霉素(較佳地是 O. 1-0. 5mg/L);或者 O. I O. 5mg/L 吲哚丁酸(較佳地是 O. 2-0. 4mg/L)。所述的培養(yǎng)基中還可包括支持物，例如瓊脂、Gelrite等。適當(dāng)還可加入抗生物質(zhì)實(shí)現(xiàn)抑菌的目的；或者還可加入抗氧化物。這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī)確定的。本發(fā)明也包含基于所述的基本培養(yǎng)基的稀釋形式的培養(yǎng)基，或部分成分稀釋后獲得的培養(yǎng)基。例如，在進(jìn)行生根培養(yǎng)時(shí)，需要將培養(yǎng)基中的大量成分進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專赃m于生根階段的生長(zhǎng)。 因此，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，還包括基于所述的基本培養(yǎng)基，其中大量成分稀釋1/2-3/4倍，小量成分稀釋1/2-1倍。培養(yǎng)基的稀釋及其應(yīng)用是本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)，在植物培養(yǎng)領(lǐng)域的技術(shù)人員均了解如何配制和使用1/2培養(yǎng)基或3/4培養(yǎng)基。栽培方法本發(fā)明的普陀鵝耳櫪離體再生成功的另一個(gè)關(guān)鍵是確定較佳的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件。本發(fā)明人反復(fù)研究后，提出了一個(gè)較佳的普陀鵝耳櫪的培養(yǎng)方法，包括(1)取普陀鵝耳櫪枝條切段，獲得外植體；(2)將外植體接種于包含6-芐氨基腺嘌呤、萘乙酸的PT培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)，獲得包含芽的愈傷組織；(3)將包含芽的愈傷組織轉(zhuǎn)接于包含6-芐氨基腺嘌呤和萘乙酸、及選擇性包含噻二唑苯基脲或赤霉素的PT培養(yǎng)基上進(jìn)行伸長(zhǎng)培養(yǎng)，獲得伸長(zhǎng)的芽；(4)將伸長(zhǎng)的芽苗在包含6-芐氨基腺嘌呤、萘乙酸、噻二唑苯基脲的PT培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2-9天，獲得暗培養(yǎng)之后的芽苗；(5)將暗培養(yǎng)之后的芽苗分離成單株，轉(zhuǎn)接于包含吲哚丁酸、蔗糖和Gelrite的PT培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，獲得生根苗；(6)將生根苗進(jìn)行耐受培養(yǎng)和煉苗；(7)煉苗后轉(zhuǎn)入大棚中培養(yǎng)，獲得普陀鵝耳櫪再生植株。本發(fā)明的方法中，首先是獲取合適的普陀鵝耳櫪的枝條，較佳地取其健壯枝條，較佳地在每年的4-7月獲取枝條。所述的枝條被切段以制備成外植體，較佳地對(duì)外植體進(jìn)行清洗消毒，例如使用70-75%體積的乙醇溶液，O. 1-0. 2%體積的升汞溶液，無(wú)菌水進(jìn)行清洗消毒，整個(gè)操作可在無(wú)菌超凈臺(tái)中進(jìn)行。切段清洗后的外植體被置于包含6-芐氨基腺嘌呤、萘乙酸的PT培養(yǎng)基上，進(jìn)行分化培養(yǎng)，首先出現(xiàn)綠色的芽點(diǎn)，之后轉(zhuǎn)變?yōu)榍逦亩ㄑ炕虿欢ㄑ俊＋@得清晰的不定芽或定芽之后，將芽轉(zhuǎn)接于包含6-節(jié)氨基腺嘌呤和萘乙酸、及選擇性包含噻二唑苯基脲或赤霉素的PT培養(yǎng)基上進(jìn)行伸長(zhǎng)培養(yǎng)，獲得伸長(zhǎng)的不定芽或定芽。噻二唑苯基脲或赤霉素是有利于芽伸長(zhǎng)的成分，但它們的添加量不能太高，否則會(huì)使得芽過(guò)于伸長(zhǎng)而導(dǎo)致生根困難。芽伸長(zhǎng)之后，將伸長(zhǎng)的芽苗進(jìn)行適當(dāng)時(shí)間的暗培養(yǎng)，這樣將有利于植株排出有毒的物質(zhì)，有利于愈傷組織的閉合。
暗培養(yǎng)之后，將芽苗分離成單株，轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基。生根培養(yǎng)基較佳地選用3/4PT培養(yǎng)基，其中還加入吲哚こ酸以促進(jìn)根的生長(zhǎng)。較佳地，還在生根培養(yǎng)基中加入蔗糖以有利于根的生長(zhǎng)。生根的苗需要進(jìn)行耐受培養(yǎng)以及煉苗，以使其能夠適應(yīng)大棚或普通環(huán)境的生長(zhǎng)。之后，將小苗已在到自然光照的大棚中，栽培、成長(zhǎng)。在大棚中的培養(yǎng)基質(zhì)較佳地選自泥炭、菜園土或珍珠巖。較佳地，培養(yǎng)基質(zhì)是泥土、菜園土、珍珠巖的混合物；更佳地，它們的比例是(2-4) (5-7) I。較為適宜的溫度是有利于植物的生長(zhǎng)分化的，不同植物培養(yǎng)的適溫不同。對(duì)于主要生長(zhǎng)在我國(guó)我國(guó)著名佛教勝地普陀山的普陀鵝耳櫪，其較適合的溫度是在20-30°C之間。因此，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，分化和伸長(zhǎng)的培養(yǎng)溫度為23±2で，較佳地22-23で；生根的培養(yǎng)溫度為24±2°C，較佳地24±1°C ;在耐受培養(yǎng)和煉苗的階段，培養(yǎng)溫度為28±3°C，較佳地28±2°C，這樣有利于其適應(yīng)自然的生長(zhǎng)環(huán)境。 較為適宜的光照是有利于植物的生長(zhǎng)分化的，不同植物培養(yǎng)的適溫不同。一般來(lái)說(shuō)，光照強(qiáng)度較強(qiáng)，幼苗生長(zhǎng)的粗壯，而光照強(qiáng)度較弱幼苗容易徒長(zhǎng)。本申請(qǐng)中誘導(dǎo)和生長(zhǎng)階段的光照強(qiáng)度為40-80 u mol. m_2. s'優(yōu)選為60 u mol. m_2. s_、在生根階段，可適當(dāng)增加光照強(qiáng)度，優(yōu)選為SOymol. m's—1。之后在大棚培養(yǎng)后，可采用自然光照。在不同的組織培養(yǎng)階段，光照時(shí)間視情況有所不同。對(duì)于普陀鵝耳櫪來(lái)說(shuō)，其光照時(shí)間一般為12-20個(gè)小吋，優(yōu)選16個(gè)小時(shí)。本發(fā)明獲得的普陀鵝耳櫪再生植株，可以進(jìn)一歩培育成為園林緑化的行道樹和作為其它實(shí)驗(yàn)的起始材料，或用于作為雜交生成植物新品種的材料。本發(fā)明人以野外套袋處理的普陀鵝耳櫪枝條為起始材料，經(jīng)培養(yǎng)產(chǎn)生一定量不定芽或定芽，由此已經(jīng)獲得了近200株普陀鵝耳櫪再生植株，表型一致性高。由此再生系統(tǒng)可以再生百年老樹，由定芽來(lái)的再生植株能保持親本的遺傳表型，保證了原始親本“地球獨(dú)生子”種質(zhì)的穩(wěn)定性。采用本發(fā)明的方法能夠在短時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)大量的普陀鵝耳櫪優(yōu)質(zhì)種苗，而且這種種苗的發(fā)生已不受季節(jié)限制，可以常年生產(chǎn)。這種種苗生產(chǎn)方法公開后，有利于迅速擴(kuò)大該物種的種群數(shù)量，從而起到保護(hù)該物種的作用。200年歷史的普陀鵝耳櫪老樹可靠再生，迄今未見(jiàn)成功的報(bào)道。而本發(fā)明首次使普陀鵝耳櫪老樹枝條培養(yǎng)成功再生成植株。按本發(fā)明的方法重復(fù)三次試驗(yàn)，平均每個(gè)枝條切段能產(chǎn)生再生植株I. 34株，且與親本表型一致性高。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)ー步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例I、基本培養(yǎng)基的制備基本培養(yǎng)基(Putoensis basal medium,簡(jiǎn)稱PT培養(yǎng)基)的制備如下按照表I配制基本培養(yǎng)基，pH5. 8，121°C滅菌15-25分鐘。其中，香蕉提取物的制備方法是稱取去皮新鮮香蕉IOOg搗碎、加蒸餾水500ml煮沸，冷卻后用紗布過(guò)濾，收集濾液，濾液用蒸餾水定容至1000ml，4°C保存?zhèn)溆?。芽的誘導(dǎo)和伸長(zhǎng)均使用該培養(yǎng)基。表I、PT培養(yǎng)基的組成成分
權(quán)利要求
1.一種栽培普陀鵝耳櫪(Carpinus putoensis Cheng)的培養(yǎng)基,其特征在于,所述培養(yǎng)基包含 (1)KNO31500mg/L ； (2)NH4NO3730mg/L ； (3)MgSO4 · 7H20150mg/L ； (4)KH2PO4170mg/L ； (5)CaCl · 2H20220mg/L ； (6)NH4Cl530mg/L ；(7)Ca (NO3) 2 · 2H20660mg/L ； (8)KCl65mg/L ； (9)H3BO36. 2mg/L ； (10)ZnSO4 · 7H208. 6mg/L ； (11)MnSO4 · H2O22. 3mg/L ； (12)Na2MoO4 · 2H200. 25mg/L ； (13)KI0. 83mg/L ； (14)CuSO4 · 5H200. 25mg/L ； (15)CoCl20. 025mg/L ； (16)FeSO4 · 7H2027. 8mg/L ； (17)Na2 · EDTA · H2O37. 3mg/L ； (18)Myo-Insitol150mg/L ； (19)甘氨酸2.0mg/L; (20)鹽酸硫胺0.5mg/L; (21)煙酸0.2mg/L; (22)鹽酸吡哆醇0. 2mg/L; (23)香蕉提取物10ml/L; 其中，組分(I) (8)在培養(yǎng)基中的含量可±10%，組分(9) (23)在培養(yǎng)基中的含量可±5%。
2.一種用于普陀鵝耳櫪生根的培養(yǎng)基，其特征在于，其中包含1/2-3/4倍含量的權(quán)利要求I的組分⑴ ⑶，以及1/2-1倍含量的權(quán)利要求I的組分(9) (23)。
3.如權(quán)利要求I或2所述的培養(yǎng)基，其特征在于，其中還含有生長(zhǎng)因子，所述的生長(zhǎng)因子選自6_芐氨基腺嘌呤，萘乙酸，噻二唑苯基脲，赤霉素，吲哚丁酸。
4.如權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述的生長(zhǎng)因子是0.5 3mg/L 6-芐氨基腺嘌呤，O. I O. 5mg/L萘乙酸和O O. Olmg/L噻二唑苯基脲；或者O.5 3mg/L 6-芐氨基腺嘌呤，O. I O. 5mg/L萘乙酸和0-0. 6mg/L赤霉素；或者 O.I O. 5mg/L Π引哚丁酸。
5.如權(quán)利要求I或2所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述的香蕉提取物如下制備新鮮香蕉去皮搗碎,按照Ig加入4 8mL水的比例加水煮沸，冷卻后過(guò)濾，收集濾液。
6.一種栽培普陀鵝耳櫪的方法，其特征在于，包括(1)取普陀鵝耳櫪枝條切段，獲得外植體； (2)將外植體接種于包含6-芐氨基腺嘌呤、萘乙酸的權(quán)利要求I的培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)，獲得包含芽的愈傷組織； (3)將包含芽的愈傷組織轉(zhuǎn)接于包含6-芐氨基腺嘌呤和萘乙酸、及選擇性包含噻二唑苯基脲或赤霉素的權(quán)利要求I的培養(yǎng)基上進(jìn)行伸長(zhǎng)培養(yǎng)，獲得伸長(zhǎng)的芽； (4)將伸長(zhǎng)的芽苗在包含6-芐氨基腺嘌呤、萘乙酸、噻二唑苯基脲的權(quán)利要求I的培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2-9天，獲得暗培養(yǎng)之后的芽苗； (5)將暗培養(yǎng)之后的芽苗分離成單株，轉(zhuǎn)接于包含吲哚丁酸、蔗糖和Gelrite的權(quán)利要求2的培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，獲得生根苗； (6)將生根苗進(jìn)行耐受培養(yǎng)和煉苗； (7)煉苗后轉(zhuǎn)入大棚中培養(yǎng)，獲得普陀鵝耳櫪再生植株。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(I)中，枝條切段后還進(jìn)行清洗除菌；或 外植體的長(zhǎng)度是O. 5-6cm。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，6-芐氨基腺嘌呤的濃度是O.5 3mg/L ;或萘乙酸的濃度是O. I O. 5mg/L。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，包括至少一次的轉(zhuǎn)接步驟，2-4周繼代一次。
10.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，6-芐氨基腺嘌呤的濃度是O.5 3mg/L ;萘乙酸的濃度是O. I O. 5mg/L ;噻二唑苯基脲的濃度是0-0. 01mg/L ;或赤霉素的濃度是0-0. 6mg/Lo
11.如權(quán)利要求6或10所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，包括 (a)將包含芽的愈傷組織轉(zhuǎn)接于包含6-芐氨基腺嘌呤、萘乙酸、噻二唑苯基脲的權(quán)利要求I的培養(yǎng)基上進(jìn)行伸長(zhǎng)培養(yǎng)，獲得形態(tài)清晰的芽； (b)將(a)獲得的芽轉(zhuǎn)接于包含6-芐氨基腺嘌呤、萘乙酸、赤霉素的權(quán)利要求I的培養(yǎng)基上進(jìn)行伸長(zhǎng)培養(yǎng)，獲得伸長(zhǎng)的芽。
12.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(4)中，6-芐氨基腺嘌呤的濃度是O.5 3mg/L ;萘乙酸的濃度是O. I O. 5mg/L ;或赤霉素的濃度是0-0. 6mg/L。
13.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(5)中，吲哚丁酸的濃度是O.I O.5mg/L ;鹿糖的濃度是 O. 5-5% (w/v)或 Gelrite 的濃度是 O. 1-0. 5(w/v)。
14.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(5)中，分離單株后，還包括將芽苗用40-60mg/L的吲哚丁酸處理5-48小時(shí)，切除形態(tài)學(xué)下端O. 5_3mm莖段，之后再轉(zhuǎn)接。
15.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟⑵-⑶的光照條件是60± 10 μ mol. m 2· s \ 16±2h/d ； 步驟(5)-(6)的光照條件是80±10 μ mol. πΓ2. s'16±2h/d ;或 步驟(7)的光照條件是自然光照。
16.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(2-(4)的培養(yǎng)溫度為23±2°C； 步驟(5)的培養(yǎng)溫度為24±2°C ;或 步驟(6)-(7)的培養(yǎng)溫度為28±3°C。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種擴(kuò)大普陀鵝耳櫪(Carpinus putoensis Cheng)種群數(shù)量的方法。本發(fā)明人對(duì)普陀鵝耳櫪的離體快速繁殖進(jìn)行了深入的研究和改進(jìn)，克服了現(xiàn)有技術(shù)中難以獲得再生植株的缺陷，成功獲得了相當(dāng)數(shù)量的再生植株，緩解量普陀鵝耳櫪的瀕危狀況。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102845303SQ20111018074
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2011年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月29日
發(fā)明者朱木蘭, 田旗 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院