專利名稱：蘭花無菌播種和試管成苗繁殖方法及所采用的廣譜培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蘭花無菌播種和試管成苗的繁殖方法。
背景技術(shù)：
蘭花是高雅、美麗又帶有神秘色彩的植物，廣泛分布于除兩極和極端干旱沙漠地區(qū)以外的各種陸地生態(tài)系統(tǒng)中，其中熱帶亞熱帶地區(qū)種類最為豐富。全世界蘭花約有800 屬，3-3. 5萬種，是被子植物中最大的科之一。我國地域遼闊，氣候資源優(yōu)越，具有豐富的蘭花資源，已知有173個(gè)屬1300多種，主要分布于長江流域和以南各省區(qū)。蘭花由于獨(dú)特的觀賞價(jià)值，花期長，是世界上栽培最廣、銷售量最大的花卉之一，目前全世界蘭花的年消費(fèi)額已超過30億美元。但長期無節(jié)制的亂采濫挖，大多數(shù)蘭花種類已瀕危，所有野生蘭花種類均屬于“野生動(dòng)植物瀕危物種國際貿(mào)易公約”(CITES)的保護(hù)對(duì)象而被限制或禁止貿(mào)易。 蘭花通?？刹捎梅种昊蚯げ宸敝?，但繁殖速度慢；盡管蘭花果實(shí)中的種子數(shù)量繁多，但由于種子無胚乳，在野外需與真菌共生才能萌發(fā)，發(fā)芽率極低。通過無菌播種和試管成苗能獲得大量種苗用于蘭花種質(zhì)資源的保護(hù)和商品花卉生產(chǎn)。本專利提供廣譜的蘭花無菌播種和試管成苗的專用培養(yǎng)基，適合于所試驗(yàn)的大部分蘭科植物種類的無菌萌發(fā)和試管成苗，獲得成功的蘭科植物有50多個(gè)屬100多種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種繁殖速度快，可在短期內(nèi)獲得大量試管苗，不會(huì)對(duì)母株產(chǎn)生損傷，能保持母株優(yōu)良性狀的蘭花的種苗繁殖方法。本發(fā)明以蘭花基本成熟而未開裂的種子外植體，利用獨(dú)特的培養(yǎng)基進(jìn)行無菌播種、然后進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的蘭種花苗，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。本發(fā)明所提出的蘭花無菌播種和試管成苗的繁殖方法，其特征包括以下的步驟(1)選取生長健壯的蘭花母株，于開花時(shí)進(jìn)行人工授粉，將授粉后發(fā)育至基本成熟而未開裂時(shí)的果實(shí)做為外植體用于播種，或從野外采取基本成熟而未開裂的蘭花果實(shí)為外植體用于播種；(2)將外植體依次用酒精浸泡，升汞溶液消毒，無菌水漂洗后，切開取出種子均勻接種到接種培養(yǎng)到種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，10 30天時(shí)能形成原球莖，原球莖長出葉片后，將其轉(zhuǎn)移到相同的培養(yǎng)基中進(jìn)行生長培養(yǎng)。所述的種子萌發(fā)培養(yǎng)基每升含花寶1號(hào)1 2g， 蛋白胨0.5 2g，椰子汁50 IOOmL,活性炭0. 5 lg，肌醇80 120mg，甘氨酸1. 5 2. 5mg，鹽酸硫胺素(VBl) 0. 05 0. 2mg,鹽酸吡哆醇(VB6) 0. 4 0. 8mg,煙酸0. 4 0. 8mg， 萘乙酸(NAA)O. 2 2mg，蔗糖 15 30g，瓊脂 6 7g，pH 5. 4-5. 6 ；(3)將在上述無菌播種培養(yǎng)所得的高1 1. 5厘米高的小植株轉(zhuǎn)移到壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)，所述的壯苗培養(yǎng)基每升含花寶1號(hào)1 2g，花寶2號(hào)1 2g，蛋白胨0. 5 3g，萘乙酸(NAA) 0. 5-3mg、香蕉勻漿50_100g、活性炭0. 5 2g，肌醇80 120mg，甘氨酸1. 5 2. 5mg，鹽酸硫胺素(VBl) 0. 05 0. 2mg,鹽酸吡哆醇(VB6) 0. 4 0. 8mg,煙酸0. 4 0. 8mg，蔗糖 20 30g,瓊脂 6 7g，pH 5. 4-5. 6 ；(4)將培養(yǎng)瓶中的試管苗轉(zhuǎn)移到自然光下煉苗，然后將其從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，移入蘭石樹皮泥炭為2 0.5 2 0.5 2的混合基質(zhì)中，得到種苗。上述步驟(2) (3)中，培養(yǎng)溫度M ^°C，光照的照度為1500 20001x，光照時(shí)間為12 16小時(shí)/天。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蘭花種苗繁殖方法，步驟( 所述的酒精濃度是體積分?jǐn)?shù)70% 80%，浸泡時(shí)間是30 60秒，所述的升汞溶液的濃度是質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 0. 2%，消毒時(shí)間是10 20分鐘，所述的無菌水的漂洗次數(shù)是4 6次。步驟O) C3)培養(yǎng)基中使用的花寶1號(hào)和花寶2號(hào)均可從市場上購得。步驟⑷所述的試管苗高3 km，煉苗時(shí)間為7 14天，光照強(qiáng)度為5000 60001x。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種蘭花種苗繁殖方法，其特征在于步驟(1)所述的外植體為蝴蝶蘭屬(Phalaenopsis)、文心蘭屬(Oncidium)、卡特蘭(Cattleya)、萬代蘭(Vanda)、5 蘭屬(Paphiopedilum)、石斛屬(Dendrobium)、蘭屬(Cypripedium)、火焰蘭屬(Renanthera)、開唇蘭屬(Anoectochilus)、接瓣蘭屬(Zygopetalum)、濕唇蘭屬 (Hygrochilus)、象鼻蘭屬(Nethodoritis)、樹蘭屬(Epidendrum)、蝦脊蘭屬(Calanthe)、 指甲蘭屬(Aerides)、竹葉蘭屬(Arundina)、鳥舌蘭屬(Ascocentrum)、白芨屬(Bletia)、石豆屬(Bulbophyllum)、地寶花屬(Geodorum)等50多個(gè)屬100多種等基本成熟而未開裂的種子。利用本專利能成功地進(jìn)行蘭花優(yōu)質(zhì)種苗的快速繁殖，此發(fā)明生產(chǎn)蘭花種苗具有出苗快，種苗品質(zhì)好、生長良好等特點(diǎn)。具有投入少，產(chǎn)出高等優(yōu)勢。目前，國內(nèi)外雖有大量蘭花無菌播種和試管成苗的報(bào)道。但沒有一種培養(yǎng)基能適合于如此多的蘭花種類的無菌播種和試管成苗，在適應(yīng)性具有較大的優(yōu)勢。具體實(shí)施方法以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，不是對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例中使用的花寶1號(hào)(HYPONeX 1)和花寶2號(hào)(HYPONeX 2)均為美國生產(chǎn)臺(tái)灣臺(tái)和園藝企業(yè)股份有限股份有限公司分裝產(chǎn)品。實(shí)施例1 (1)開花時(shí)選取生長健壯的白花蝴蝶蘭(Phalaenopsis amabilis)的基本成熟而未開裂的種子，將外植體用70%的酒精浸泡60秒后，再用0. 升汞溶液消毒20分鐘，無菌水漂洗4次后切開果實(shí)，將粉末狀種子接種到種子萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，15天時(shí)種子萌發(fā)形成原球莖。40天時(shí)原球莖分化出葉片。所述的種子萌發(fā)培養(yǎng)基每升含花寶1號(hào)lg，蛋白胨0. 5g，椰子汁50mL,活性炭0. 5g，肌醇80mg,甘氨酸1. 5mg,鹽酸硫胺素(VBl) 0. 05mg,鹽酸吡哆醇(VB6)0. 4mg，煙酸 0. 4mg，萘乙酸(NAA)O. 2mg，蔗糖 15g，瓊脂 7g，pH 5. 4 ；(2)將由種子萌發(fā)原球莖分化出的小苗轉(zhuǎn)移到同樣的培養(yǎng)基培養(yǎng)，40天能形成l-2cm高小苗。所使用的培養(yǎng)基為每升含花寶1號(hào)lg，花寶2號(hào)lg，蛋白胨0. 5g， 萘乙酸(NAA)O. 5mg、香蕉勻漿50g、活性炭0. 5g，肌醇80mg，甘氨酸1. 5mg,鹽酸硫胺素 (VBl) 0. 05mg,鹽酸吡哆醇(VB6) 0. 4mg,煙酸 0. 4mg,蔗糖 20g,瓊脂 7g，pH 5. 4 ；(3)將1-2厘米高小苗接種到壯苗培養(yǎng)培養(yǎng)，40天能形成3 4cm高的試管苗，所述的壯苗培養(yǎng)基為每升含花寶1號(hào)lg，花寶2號(hào)lg，蛋白胨0. 5g，萘乙酸(NAA)O. 5mg、香蕉勻漿50g、活性炭0. 5g，肌醇80mg，甘氨酸1. 5mg，鹽酸硫胺素(VBl)O. 05mg，鹽酸吡哆醇 (VB6) 0. 4mg，煙酸 0. 4mg，蔗糖 20g,瓊脂 7g，pH 5. 4 ；(4)將3 4cm高的試管苗在溫室的自然光下煉苗，光照強(qiáng)度為5000 60001x， 然后洗凈根部的培養(yǎng)基，在用蘭石、樹皮和泥炭的混合基質(zhì)(體積比4 1 1)中栽培，得到種苗，成活率為95%。上述步驟(1) (3)中培養(yǎng)溫度28°C，光照的照度為18001x，光照時(shí)間為12小時(shí)
/天。 實(shí)施例2 (1)開花時(shí)選取生長健壯的多花指甲蘭(Aerides rosea)的基本成熟而未開裂的種子，將外植體用75%的酒精浸泡45秒后，再用0. 15%升汞溶液消毒15分鐘，無菌水漂洗 5次后切開果實(shí)，將粉末狀種子接種到種子萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，10天時(shí)種子萌發(fā)形成原球莖。30天時(shí)原球莖分化出葉片。所述的種子萌發(fā)培養(yǎng)基每升含花寶1號(hào)1.5g，蛋白胨lg， 椰子汁75mL，活性炭0. 75g，肌醇lOOmg，甘氨酸2mg，鹽酸硫胺素(VBl) 0. Img,鹽酸吡哆醇 (VB6) 0. 5mg，煙酸 0. 5mg，萘乙酸(NAA) 0. 5mg，蔗糖 20g，瓊脂 6. 5g，pH 5.5;(2)將由種子萌發(fā)原球莖分化出的小苗轉(zhuǎn)移到同樣的培養(yǎng)基培養(yǎng)，30天能形成 l-2cm高小苗。所使用的培養(yǎng)基為每升含含花寶1號(hào)1.5g，蛋白胨lg，椰子汁75mL，活性炭0. 75g，肌醇IOOmg,甘氨酸2mg,鹽酸硫胺素(VBl) 0. Img,鹽酸吡哆醇(VB6) 0. 5mg,煙酸 0. 5mg，萘乙酸(NAA) 0. 5mg，蔗糖 20g，瓊脂 6. 5g，pH 5. 5 ；(3)將1-2厘米高小苗接種到壯苗培養(yǎng)培養(yǎng)，30天能形成3 4cm高的試管苗， 所述的壯苗培養(yǎng)基為每升含花寶1號(hào)1. 5g，花寶2號(hào)1. 5g，蛋白胨2g，萘乙酸(NAA) Img, 香蕉勻漿75g、活性炭lg，肌醇lOOmg，甘氨酸2mg，鹽酸硫胺素(VBl)O. lmg，鹽酸吡哆醇 (VB6) 0. 5mg，煙酸 0. 5mg，蔗糖 25g，瓊脂 6. 5g，pH 5. 5 ；(4)將3 4cm高的試管苗在溫室的自然光下煉苗，光照強(qiáng)度為5000 60001x， 然后洗凈根部的培養(yǎng)基，在用蘭石、樹皮和泥炭的混合基質(zhì)(體積比4 2 1)中栽培，得到種苗，成活率為90%。上述步驟(1) (3)中培養(yǎng)溫度26°C，光照的照度為16001x，光照時(shí)間為14小時(shí)/天。實(shí)施例3:1. (1)開花時(shí)選取生長健壯的根莖兜蘭(Paphiopedilum rhizomatosum)的基本成熟而未開裂的種子，將外植體用80%的酒精浸泡30秒后，再用0. 2%升汞溶液消毒10分鐘，無菌水漂洗6次后切開果實(shí)，將粉末狀種子接種到種子萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，30天時(shí)種子萌發(fā)形成原球莖。60天時(shí)原球莖分化出葉片。所述的種子萌發(fā)培養(yǎng)基每升含花寶1號(hào)2g， 蛋白胨2g，椰子汁IOOmL,活性炭lg，肌醇120mg，甘氨酸2. 5mg，鹽酸硫胺素(VBl)O. 2mg，鹽酸吡哆醇(VB6)0. 8mg，煙酸0. 8mg，萘乙酸(NAA) 2mg，蔗糖30g，瓊脂6g，pH 5.6;(2)將由種子萌發(fā)原球莖分化出的小苗轉(zhuǎn)移到同樣的培養(yǎng)基培養(yǎng)，50天能形成 l-2cm高小苗。所使用的培養(yǎng)基為每升含花寶1號(hào)2g，蛋白胨2g，椰子汁IOOmL,活性炭lg， 肌醇120mg，甘氨酸2. 5mg，鹽酸硫胺素(VBl)O. 2mg，鹽酸吡哆醇(VB6)0. 8mg，煙酸0. 8mg，萘乙酸(NAA) 2mg,蔗糖 30g,瓊脂 6g，pH 5. 6 ；
(3)將1-2厘米高小苗接種到壯苗培養(yǎng)培養(yǎng)，50天能形成3 km高的試管苗， 所述的壯苗培養(yǎng)基為每升含花寶1號(hào)2g，花寶2號(hào)2g，蛋白胨3g，萘乙酸(NAA) ;3mg、香蕉勻漿100g、活性炭2g，肌醇120mg,甘氨酸2. 5mg,鹽酸硫胺素(VBl)O. 2mg,鹽酸吡哆醇 (VB6) 0. 8mg,煙酸 0. 8mg,蔗糖 30g,瓊脂 6g，pH 5. 6 ；(4)將3 km高的試管苗在溫室的自然光下煉苗，光照強(qiáng)度為5000 60001x， 然后洗凈根部的培養(yǎng)基，在用蘭石、樹皮和泥炭的混合基質(zhì)(體積比2 1 1)中栽培，得到種苗，成活率為98%。上述步驟(1) (3)中培養(yǎng)溫度M°C，光照的照度為15001x，光照時(shí)間為16小時(shí)/天。
權(quán)利要求
1.蘭花無菌播種和試管成苗的繁殖方法及所采用的廣譜培養(yǎng)基，其特征在于包括以下步驟(1)材料選取生長健壯的蘭花母株，于開花時(shí)進(jìn)行人工授粉，將授粉后發(fā)育至基本成熟而未開裂時(shí)的果實(shí)做為外植體用于播種，或從野外采取基本成熟而未開裂的蘭花果實(shí)為外植體用于播種；(2)無菌播種將外植體依次用酒精浸泡，升汞溶液消毒，無菌水漂洗后切開，將粉末狀胚接種到種子萌發(fā)培養(yǎng)基，種子萌發(fā)形成原球莖，隨后轉(zhuǎn)移到同樣的培養(yǎng)基中進(jìn)一步形成小苗，所述的種子萌發(fā)培養(yǎng)基每升含花寶1號(hào)1 2g，蛋白胨0. 5 2g，椰子汁50 IOOmL,活性炭0. 5 Ig,肌醇80 120mg,甘氨酸1. 5 2. 5mg,鹽酸硫胺素(VBl) 0. 05 0.2mg,鹽酸吡哆醇(VB6) 0. 4 0. 8mg,煙酸0. 4 0. 8mg，萘乙酸(NAA) 0. 2 2mg,蔗糖 15 30g,瓊脂 6 7g，pH 5. 4-5. 6 ；(3)壯苗培養(yǎng)將在上述無菌播種培養(yǎng)所得的高1 1.5厘米高的小植株轉(zhuǎn)移到壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)，所述的壯苗培養(yǎng)基每升含花寶1號(hào)1 2g，花寶2號(hào)1 2g，蛋白胨0. 5 3g，萘乙酸(NAA) 0. 5-;3mg、香蕉勻漿50_100g、活性炭0. 5 2g，肌醇80 120mg，甘氨酸1.5 2. 5mg,鹽酸硫胺素(VBl) 0. 05 0. 2mg,鹽酸吡哆醇(VB6) 0. 4 0. 8mg,煙酸0. 4 0. 8mg,蔗糖 20 30g,瓊脂 6 7g，pH 5. 4-5. 6 ；(4)試管苗移栽將培養(yǎng)瓶中的試管苗轉(zhuǎn)移到自然光下煉苗，然后將其從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，移入蘭石樹皮泥炭為2 0. 5 2 0. 5 2的混合基質(zhì)中；上述步驟O) (3)中培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度對(duì)_281，光照度1500 20001x，光照 12-16小時(shí)/天。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘭花無菌播種和試管成苗的繁殖方法，步驟( 所述的酒精濃度是體積分?jǐn)?shù)70% 80%，浸泡時(shí)間是30 60秒，所述的升汞溶液的濃度是質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0. 0. 2%，消毒時(shí)間是10 20分鐘，所述的無菌水的漂洗次數(shù)是4 6次，步驟(5) 所述的試管苗高3 如m，煉苗時(shí)間為7 14天，光照強(qiáng)度為5000 60001x。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種蝴蘭花種苗繁殖方法，其特征在于步驟(1)所述的外植體為蘭科植物有中的蝴蝶蘭屬(Phalaenopsis)、文心蘭屬(Oncidium)、卡特蘭(Cattleya)、萬代蘭(Vanda)、兜蘭屬(Paphiopedilum)、石斛屬(Dendrobium)、 蘭屬(Cypripedium)、火焰蘭屬(Renanthera)、開唇蘭屬(Anoectochilus)、接瓣蘭屬(Zygopetalum)、濕唇蘭屬(Hygrochilus)、象鼻蘭屬(Nethodoritis)、樹蘭屬 (Epidendrum)、蝦脊蘭屬(Calanthe)、指甲蘭屬(Aerides)、竹葉蘭屬(Arundina)、鳥舌蘭屬(Ascocentrum)、白發(fā)屬(Bletia)、石豆屬(Bulbophyllum)、地寶花屬(Geodorum)等 50 多個(gè)屬100多種等基本成熟而未開裂的種子。
全文摘要
本發(fā)明公開了蘭花無菌播種和試管成苗的繁殖方法及所采用的廣譜培養(yǎng)基。本方法選取生長健壯的蘭花母株，于開花時(shí)進(jìn)行人工授粉，將授粉后發(fā)育至基本成熟而未開裂時(shí)的果實(shí)做為外植體，或從野外采取基本成熟而未開裂的蘭花果實(shí)為外植體，經(jīng)過無菌播種、種子萌發(fā)、壯苗培養(yǎng)和試管苗移栽等繁殖步驟。分別采用專門的配制的培養(yǎng)基進(jìn)行無菌播種和種子萌發(fā)獲得小植株，再將小植株經(jīng)在專門配制的壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)，出瓶前在溫室中的自然光照下煉苗7～14天，取出試管苗，洗掉根部培養(yǎng)基，栽入樹皮、蘭石和泥炭的混合基質(zhì)中，進(jìn)一步栽培成種苗。本發(fā)明具有種子的萌發(fā)率高、成苗快、種苗品質(zhì)好、成本低廉等特點(diǎn)，能在短期內(nèi)獲得大量的試管苗，成苗的移栽成活率可保持在90％以上。能為蘭花的種苗生產(chǎn)提供一條有效的途徑。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102283114SQ20111017164
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月23日
發(fā)明者吳坤林, 張建霞, 曾宋君, 段俊, 陳之林 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院華南植物園