專利名稱：一種能驅(qū)動基因在花組織中表達的啟動子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能驅(qū)動基因在花組織中表達的啟動子。
背景技術(shù)：
擬南芥(Arabidopsis thaliana)是一種十字花科植物，廣泛用于植物遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和分子生物學(xué)的研究，由于其具有植株小、世代時間短、基因組小等特點使其已成為一種典型的模式植物。MTO因子是含有保守MYB DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一類蛋白家族。典型的MB因子與 c-Myb有關(guān)，在動植物及一些高等真核生物的細胞周期中起調(diào)控作用。在擬南芥中至少含有100個R2R3-MYB基因，這些基因在調(diào)控植物的次級代謝，維持細胞的形狀，抵御病害，響應(yīng)激素等方面都起著重要的作用。先前有報道擬南芥MYB21和MYBM與花的發(fā)育有關(guān)，擬南芥缺失MYB21、MYB324基因后，表現(xiàn)為雄蕊發(fā)育受阻，花絲不能正常伸長，從而導(dǎo)致雄性不育。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能驅(qū)動基因在花組織中表達的啟動子。本發(fā)明提供的啟動子，為如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有啟動子功能的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為在6 X SSC, 0. 5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2 X SSC, 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。序列表中的序列1所示的DNA由745個脫氧核糖核苷酸組成。序列1所示的DNA 可以作為啟動子驅(qū)動基因在植物的花組織中表達。含有所述啟動子的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述重組表達載體具體可為將序列1所示的DNA片段插入pBI121載體的多克隆位點得到的重組質(zhì)粒。本發(fā)明還保護一種在植物的花組織中表達外源基因的方法，是將DNA片段甲導(dǎo)入植物中，從而在植物的花組織中表達所述外源基因；所述DNA片段甲自上游至下游依次含有所述啟動子和所述外源基因?？梢韵葘⑺鰡幼优c所述外源基因連接，形成融和DNA，然后用融合DNA構(gòu)建重組表達載體，導(dǎo)入植物。也可以將所述啟動子和所述外源基因分別插入出發(fā)載體上適合的多克隆位點，得到用所述啟動子驅(qū)動所述外源基因表達的重組表達載體，然后將重組表達載體導(dǎo)入植物。
為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所述重組表達載體進行加工，如具有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。重組表達載體可通過使用 Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物。所述方法具體可通過將如下重組表達載體導(dǎo)入植物中實現(xiàn)分別將所述的啟動子和所述外源基因插入PBI121載體的多克隆位點得到重組表達載體；所述啟動子位于所述外源基因的上游。所述植物具體可為十字花科植物，如擬南芥(如Columbia-O生態(tài)型)等。本發(fā)明提供了一個啟動子，該啟動子可以驅(qū)動基因在植物的花組織中表達。本發(fā)明有助于促進人們對擬南芥發(fā)育生長的研究，且為植物特別是十字花科的蔬菜花卉的遺傳改造提供了一條經(jīng)濟、快速、有效的途徑。本發(fā)明在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間和市場前景。


圖 1 為 pBI121-MYB21pro_GUS 載體圖譜圖2為轉(zhuǎn)基因擬南芥的花器官GUS染色情況；A-H 不同的轉(zhuǎn)基因植株。圖3為野生型擬南芥的花器官⑶S染色情況；A-H 不同的野生型植株。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。實施例中所用的擬南芥(Arabidopsis thaliana)為Columbia-O生態(tài)型 Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC),禾中子號CS6673。農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株 GV3101 簡稱農(nóng)桿菌菌株 GV3101 參考文獻:Gibberellin Acts through Jasmonate to Control the Expression of MYB21, MYB24 and MYB57 to Promote Stamen Filament Growth in Arabidopsis. Cheng Hui,Song Susheng, Xiao Langtao, Soo Hui Meng, Cheng Zhiwei, Xie Daoxin, Peng Jinrong. PLoS Genetics 5(3) :el000440. 2009 ；公眾可從清華大學(xué)獲得。實施例1、MYB21pro序列的獲得以擬南芥(Columbia-O)葉片DNA為模板，采用Fl和Rl組成的引物對，在高保真的PFU酶的作用下進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。Fl 5' -agaAAGCTTataattactccacctt-3‘Rl :5，-tttTCTAGAtttagagagagaggaatat-3，。將PCR擴增產(chǎn)物進行測序，如序列表的序列1所示。將序列表的序列1所示的DNA 命名為MYB21啟動子(MYB21pro)。實施例2、轉(zhuǎn)基因植株的獲得和鑒定一、重組表達載體(pBI121-MYB21pro-GUS)的構(gòu)建
1、用限制性內(nèi)切酶HindIII和)(baI雙酶切實施例1得到的PCR擴增產(chǎn)物，得到酶切產(chǎn)物。2、用限制性內(nèi)切酶 HindIII 和 XbaI 雙酶切 pBI121 載體(GenBank :AF485783. 1)， 回收約141Λ的載體骨架。3、將步驟1的酶切產(chǎn)物和步驟2的載體骨架在T4 DNA連接酶的作用下進行連接， 得到重組質(zhì)粒pBI121-MYB21pro-GUS。重組質(zhì)粒pBI121-MYB21pro_GUS的結(jié)構(gòu)示意圖見圖 1。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pBI121-MYB21pro-GUS進行結(jié)構(gòu)描述如下在pBI121載體的 HindIII和^CbaI酶切位點之間插入序列表的序列1所示DNA得到的重組質(zhì)粒。二、轉(zhuǎn)基因植株的獲得1、將重組質(zhì)粒pBI121-MYB21pro-GUS電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101，得到重組農(nóng)桿 M (Agrobacterium tumefaciens GV3101/pBI121_MYB21pro_GUS)。2、過夜培養(yǎng)步驟1的重組農(nóng)桿菌并調(diào)整其濃度為0D600 = 0. 8的菌液。3、通過花浸泡法(花浸在步驟2的菌液中30秒)將重組質(zhì)粒 pBI121-MYB21pro-GUS分別導(dǎo)入60株擬南芥(Columbia-O)，收獲的種子即為TO代擬南芥的種子。4、將TO代擬南芥的種子播種于含卡那霉素O0mg/L)的MS培養(yǎng)基上進行篩選，得到30株具有卡那霉素抗性的Tl代擬南芥(編號依次為1-30)。5、待Tl代擬南芥長至4-6片葉子時將其移栽到蛭石上生長45天；16小時 /光照+8小時/黑暗)，分別提取30株Tl代擬南芥葉子的DNA，用F2(MYB21pro的正向引物)和R2(⑶S的反向引物)組成引物對進行PCR鑒定，如果顯示約777bp的PCR擴增產(chǎn)物， 則植株為轉(zhuǎn)基因植株。F2 :5， -agaaagcttataattactccacctt-3，；R2 :5， -cacgggttggggtttctacag-3，。結(jié)果表明，30株Tl代擬南芥均為轉(zhuǎn)基因擬南芥。三、野生型擬南芥的培養(yǎng)將長至4-6片葉子的擬南芥(Columbia-Ο)移栽到蛭石上生長45天；16小時/光照+8小時/黑暗)。四、⑶S染色分析將步驟二中在蛭石上生長45天的轉(zhuǎn)基因擬南芥(30株)和步驟三中在蛭石上生長45天的野生型擬南芥(20株)進行GUS染色分析。30株轉(zhuǎn)基因擬南芥花器官均顯示藍色，花器官染色的部分結(jié)果見圖2。20株野生型擬南芥花器官均未被染色，花器官染色的部分結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，序列1所示的啟動子確實可以驅(qū)動⑶S基因在花中表達。
權(quán)利要求
1.一種啟動子，為如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有啟動子功能的DNA分子。
2.含有權(quán)利要求1所述啟動子的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。
3.如權(quán)利要求2所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體是將序列1所示的DNA片段插入pBI121載體的多克隆位點得到的。
4.一種在植物的花組織中表達外源基因的方法，是將DNA片段甲導(dǎo)入植物中，從而在植物的花組織中表達所述外源基因；所述DNA片段甲自上游至下游依次含有權(quán)利要求1所述啟動子和所述外源基因。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述DNA片段甲通過重組表達載體導(dǎo)入所述植物；所述重組表達載體為將權(quán)利要求1所述的啟動子和所述外源基因插入PBI121載體的多克隆位點得到的重組質(zhì)粒；所述啟動子位于所述外源基因的上游。
6.如權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述植物為十字花科植物。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述十字花科植物為擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能驅(qū)動基因在花組織中表達的啟動子。本發(fā)明提供的啟動子，為如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有啟動子功能的DNA分子。本發(fā)明提供的啟動子可以驅(qū)動外源基因在植物的花組織中表達。本發(fā)明有助于促進人們對擬南芥發(fā)育生長的研究，且為植物(特別是十字花科的蔬菜花卉)的遺傳改造提供了一條經(jīng)濟、快速、有效的途徑。本發(fā)明在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間和市場前景。
文檔編號A01H5/00GK102250898SQ201110163500
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月17日
發(fā)明者吳德偉, 宋素勝, 彭文, 樊萌, 謝道昕, 黃煌, 齊天從 申請人:清華大學(xué)