專利名稱：家蠶中部絲腺細胞合成分泌狂犬病病毒核蛋白的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及利用轉基因技術構建一種家蠶中部絲腺細胞合成分泌狂犬病病毒核蛋白的方法。
背景技術：
狂犬病是當今世界公共衛(wèi)生中有嚴重威脅的傳染病之一。狂犬病是由狂犬病病毒感染恒溫動物或人引起，導致動物或者人急性致死性腦脊髓炎，臨床特征主要表現(xiàn)為狂燥不安、行為反常、攻擊性、進行性麻痹和最終死亡，是一種人獸共患傳染病。其特點是潛伏期長，致死率高，幾乎100%死亡?？袢〔《緦儆趶棤畈《究茝棤畈《緦?，是單鏈不分節(jié)負鏈RNA病毒，病毒外形呈彈狀，一端純圓，一端平凹，有囊膜，內含衣殼呈螺旋對稱，表面具有包膜，內含有單鏈 RNA?？袢〔《镜幕蚪M全長約121Λ，基因組的3’端至5’端排列著N、P、M、G、L 5個結構基因，各基因序列的長度分別為1似4、991、805、1675和647^p，它們分別編碼核蛋白 (N)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)、糖蛋白(G)和大蛋白(L或RNA依賴的RNA轉錄酶蛋白)?？袢〔《居袃煞N主要抗原一種是病毒外膜上的糖蛋白抗原，它能與乙酰膽堿受體結合，表現(xiàn)出神經(jīng)毒性，能使體內產(chǎn)生中和抗體及血凝抑制抗體；另一種為內層的核蛋白抗原，它使體內產(chǎn)生補體結合抗體和沉淀素。N蛋白基因全長14M個核苷酸.編碼450個氨基酸，相對分子質量為50. 5Da。在成熟的病毒粒子中，N蛋白是構成核衣殼螺旋對稱結構的主要成分之一，是病毒中最穩(wěn)定的蛋白，可用作檢測抗原，也是狂犬病病毒基因分型的主要依據(jù)。N蛋白與狂犬病病毒基因組中的RNA結合，形成RNP結合物，能保護病毒RNA免遭核酸酶破壞。N蛋白是一個磷酸化蛋白，C端第389位Ser為磷酸化位點，能調節(jié)病毒的轉錄和復制水平。N蛋白能夠誘導細胞免疫。轉基因家蠶中部絲腺生物反應器是在家蠶中部絲腺中表達外源基因的轉基因動物表達系統(tǒng)。家蠶生長周期短，50天左右可完成一個世代，每個雌蛾可產(chǎn)卵約400粒；家蠶經(jīng)過長達四千多年的人工馴養(yǎng)、選育，性情溫順，已完成喪失飛翔逃逸能力，而在絲蛋白合成、分泌方面具有非常強的能力；合成的蛋白可以隨蠶絲蛋白一起分泌到體外，蠶絲蛋白主要由3種絲素蛋白和3種絲膠蛋白構成，成分簡單。所以，轉基因家蠶絲腺生物反應器構建容易，運行安全，表達外源蛋白效率高，外源蛋白多具有生物活性，蛋白純化方便，只需要通過飼養(yǎng)轉基因家蠶，就可以非常方便地維持表達系統(tǒng)的延續(xù)，是一種非常有價值的表達系統(tǒng)，具有廣闊的實用前景。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種家蠶中部絲腺細胞合成分泌狂犬病病毒核蛋白的方法，是利用轉基因家蠶技術將狂犬病病毒核蛋白基因導入家蠶基因組內，并在家蠶中部絲腺細胞中特異表達，開發(fā)出合成分泌狂犬病病毒核蛋白的家蠶，為利用狂犬病病毒核蛋白研制更加安全、高效、經(jīng)濟和使用方便的人用狂犬病新型疫苗奠定基礎。為了達到上述目的，本發(fā)明采用的技術方案的步驟如下
(1)采用分子生物學技術構建家蠶合成分泌狂犬病病毒核蛋白的載體 pBSerlRVNP-A3EGFP 質粒；
(2)采用顯微注射轉基因家蠶方法將pBkrlRVNP-A3EGFP質粒及能夠提供轉座酶 trans的輔助質粒導入家蠶已解除滯育的受精卵內，蠶卵孵化后飼養(yǎng)至成蟲，自交續(xù)代為 Gl代，在Gl代轉基因家蠶的小蠶期，通過熒光體視顯微鏡觀察選擇表達EGFP標志基因的轉基因家蠶，飼養(yǎng)至成蟲自交續(xù)代為G2代，G2代以后均采用蛾區(qū)育，成蟲自交續(xù)代，再經(jīng)1-3 代選種，每代采用轉基因昆蟲熒光基因表達相對量無損傷測定方法，以表達EGFP標志基因及絲膠蠶性狀為留種篩選標志，育成中部絲腺細胞能夠合成分泌狂犬病病毒核蛋白、基因純合的轉基因家蠶新品種。所述的pBkrlRVNP-A3EGFP質粒是以piggyBac轉座質粒為基礎，質粒帶有Amp抗性基因以用于質粒的擴增和篩選，包含piggyBac轉座子的2個轉座臂PBL 和PBR，包含2個功能表達框，一個是A3啟動子啟動的綠色熒光蛋白基因表達框A3 Promoter+EGFP+SV40,以用作轉基因陽性家蠶的篩選標志，另一個是家蠶絲膠蛋白1啟動子、帶有便于提純外源蛋白的His接頭以及狂犬病病毒核蛋白基因的表達框％1~1 Promoter +His+hLYZ+SV40,以表達狂犬病病毒核蛋白，輔助質粒包含Amp抗性基因、piggyBac轉座子的1個轉座臂PBR、A3啟動子啟動的轉座酶trans基因表達框A3 Promoter+ trans,以提供轉座酶。采用顯微注射轉基因家蠶方法將pBkrlRVNP-A3EGFP質粒及能夠提供轉座酶 trans的輔助質粒導入家蠶已解除滯育的受精卵，其家蠶品種是突變品種絲膠蠶，所述的以絲膠蠶性狀為每代的留種篩選標志，其篩選的時期是蠶繭時期。本發(fā)明具有的有益效果是
本發(fā)明借助熒光標志基因篩選轉基因家蠶，這種轉基因家蠶能夠在家蠶中部絲腺細胞特異地合成分泌狂犬病病毒核蛋白，為提高狂犬病病毒核蛋白的生產(chǎn)效率、降低生產(chǎn)成本、 并研制更加安全、高效、經(jīng)濟和使用方便的人用狂犬病新型疫苗奠定基礎。


圖1是家蠶中部絲腺細胞合成分泌狂犬病病毒核蛋白的pBkrlRVNP-A3EGFP載體結構圖。圖2是能夠提供轉座酶的輔助質粒結構圖。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例1
將pBkrlRVNP-A3EGFP質粒(圖1)及能夠提供轉座酶的輔助質粒(圖2)按2:1比率混合，2種質粒的總濃度為0. 4μβ/μ1，質粒溶解在0. 5mM、pH7. 0含有5mM氯化鉀的磷酸緩沖液中，然后采用顯微注射方法導入絲膠蠶產(chǎn)卵后8小時以內的、已解除滯育的受精卵內，導入總體積為20nl。將顯微注射的蠶卵在25°C、85%濕度、1 光照條件下飼養(yǎng)至成蟲，自交續(xù)代(Gl代)。在轉基因實驗的Gl代小蠶期，通過熒光顯微鏡(Olympus，SZX12，日本)觀察獲取表達EGFP標志基因的轉基因家蠶1蛾，熒光顯微鏡的激發(fā)波長為460nm 490nm，發(fā)射波長為510 nm 550 nm。將蠶飼養(yǎng)至成蟲自交產(chǎn)卵續(xù)代(G2)。自第G2代以后的轉基因家蠶均采用單蛾育，在小蠶期采用轉基因昆蟲熒光基因表達相對量無損傷測定方法，挑選表達 EGFP標志基因的轉基因家蠶，飼養(yǎng)至成蟲，選擇蠶繭特性為絲膠的個體自交續(xù)代，經(jīng)自交3 代選擇留種，在每代的小蠶期，采用轉基因昆蟲熒光基因表達相對量無損傷測定方法，觀察選留表達EGFP標志基因的轉基因家蠶，在蠶繭時期選留蠶繭特性為絲膠的個體。經(jīng)此育成中部絲腺細胞能夠合成分泌狂犬病病毒核蛋白、且狂犬病病毒核蛋白含量占絲蛋白含量較高比例的基因純合的轉基因家蠶新品種，定名為SN2。 取SN2品種基因組DNA為模板，采用Inverse PCR擴增RVNP基因在家蠶基因組中的插入片段，對擴增片段進行克隆、測序和染色體定位分析，結果顯示如下
狂犬病病毒核蛋白基因在家蠶基因組中的插入位點鑒定
品系染色體序列片段基因或間隔區(qū)左側基因組序列載體右側基因組序列SN2Chr. 17Bm_scaf33 (2923746)A3geneTAAGTTTTAATTTTAApiggy^cTTAAAATTTCGAAAGA
提取蠶絲蛋白為材料，采用Western blot分析轉基因家蠶核蛋白的表達情況。經(jīng)鼠抗狂犬病病毒核蛋白MAb作一抗的分析，結果得到與預期分子量大小相符的特異性蛋白條
市ο研究結果證明RVNP基因已插入到家蠶基因組第17染色體的A3肌動蛋白基因中， 并獲得了穩(wěn)定的遺傳和表達，已育成中部絲腺細胞能夠合成分泌狂犬病病毒核蛋白的轉基因家蠶新品種。實施例2:
將pBkrlRVNP-A3EGFP質粒(圖1)及能夠提供轉座酶的輔助質粒(圖2)按2:1比率混合，2種質粒的總濃度為0. 4μβ/μ1，質粒溶解在0. 5mM、pH7. 0含有5mM氯化鉀的磷酸緩沖液中，然后采用顯微注射方法導入絲膠蠶產(chǎn)卵后8小時以內、已解除滯育的受精卵內，導入總體積為20nl。將顯微注射的蠶卵在25°C、85%濕度、1 光照條件下飼養(yǎng)至成蟲，自交續(xù)代 (Gl代)。在轉基因實驗的Gl代小蠶期，通過熒光顯微鏡(Olympus，SZX12，日本)觀察獲取表達EGFP標志基因的轉基因家蠶2蛾，熒光顯微鏡的激發(fā)波長為460nm 490nm，發(fā)射波長為510 nm 550 nm。將蠶飼養(yǎng)至成蟲自交產(chǎn)卵續(xù)代(G2)。自第G2代以后的轉基因家蠶均采用單蛾育，在小蠶期采用轉基因昆蟲熒光基因表達相對量無損傷測定方法，挑選表達 EGFP標志基因的轉基因家蠶，飼養(yǎng)至成蟲，選擇蠶繭特性為絲膠的個體自交續(xù)代，經(jīng)自交1 代選擇留種，在每代的小蠶期，采用轉基因昆蟲熒光基因表達相對量無損傷測定方法，觀察選留表達EGFP標志基因的轉基因家蠶，在蠶繭時期選留蠶繭特性為絲膠的個體。經(jīng)此育成中部絲腺細胞能夠合成分泌狂犬病病毒核蛋白、且狂犬病病毒核蛋白含量占絲蛋白含量較高比例的基因純合的轉基因家蠶新品種，定名為SN3、SN4。取SN3、SN4基因組DNA為模板，采用Inverse PCR擴增RVNP基因在家蠶基因組中的插入片段，對擴增片段進行克隆、測序和染色體定位分析，結果顯示如下
狂犬病病毒核蛋白基因在家蠶基因組中的插入位點鑒定品系染色體序列片段基因或間隔區(qū)左側基因組序列載體右側基因組序列SN3Chr. 17Bm_scaf33 (2923720)間隔區(qū)CTTGTCACTTATTTAApiggy^acTTAAAGTTTAGGTCGASN4Chr. 8Bm_scafl9 (7860408)間隔區(qū)ATGGTGCTGTTTTTAApiggy^cTTAAAATCTTTCCACT
提取SN3、SN4蠶絲蛋白為材料，采用Western blot分析轉基因家蠶核蛋白的表達情況。經(jīng)鼠抗狂犬病病毒核蛋白MAb作一抗的分析，結果得到與預期分子量大小相符的特異性蛋白條帶。研究結果證明RVNP基因已插入到SN3家蠶基因組第17染色體和SN4家蠶基因組第8染色體的基因間隔區(qū)中，并獲得了穩(wěn)定的遺傳和表達，已育成中部絲腺細胞能夠合成分泌狂犬病病毒核蛋白的轉基因家蠶新品種。實施例3
將pBkrlRVNP-A3EGFP質粒(圖1)及能夠提供轉座酶的輔助質粒(圖2)按2:1比率混合，2種質粒的總濃度為0. 4μβ/μ1，質粒溶解在0. 5mM、pH7. 0含有5mM氯化鉀的磷酸緩沖液中，然后采用顯微注射方法導入絲膠蠶產(chǎn)卵后8小時以內、已解除滯育的受精卵內，導入總體積為20nl。將顯微注射的蠶卵在25°C、85%濕度、1 光照條件下飼養(yǎng)至成蟲，自交續(xù)代 (Gl代)。在轉基因實驗的Gl代小蠶期，通過熒光顯微鏡(Olympus，SZX12，日本)觀察獲取表達EGFP標志基因的轉基因家蠶2蛾，熒光顯微鏡的激發(fā)波長為460nm 490nm，發(fā)射波長為510 nm 550 nm。將蠶飼養(yǎng)至成蟲自交產(chǎn)卵續(xù)代(G2)。自第G2代以后的轉基因家蠶均采用單蛾育，在小蠶期采用轉基因昆蟲熒光基因表達相對量無損傷測定方法，挑選表達 EGFP標志基因的轉基因家蠶，飼養(yǎng)至成蟲，選擇蠶繭特性為絲膠的個體自交續(xù)代，經(jīng)自交2 代選擇留種，在每代的小蠶期，采用轉基因昆蟲熒光基因表達相對量無損傷測定方法，觀察選留表達EGFP標志基因的轉基因家蠶，在蠶繭時期選留蠶繭特性為絲膠的個體。經(jīng)此育成中部絲腺細胞能夠合成分泌狂犬病病毒核蛋白、且狂犬病病毒核蛋白含量占絲蛋白含量較高比例的基因純合的轉基因家蠶新品種，定名為SN6、SN8。取SN6、SN8基因組DNA為模板，采用Inverse PCR擴增RVNP基因在家蠶基因組中的插入片段，對擴增片段進行克隆、測序和染色體定位分析，結果顯示如下
狂犬病病毒核蛋白基因在家蠶基因組中的插入位點鑒定提取SN3、SN4蠶絲蛋白為材料，米用Western blot分析轉基因家蠶核蛋白的表達情況。經(jīng)鼠抗狂犬病病毒核蛋白MAb作一抗的分析，結果得到與預期分子量大小相符的特異性蛋白條帶。 研究結果證明RVNP基因已插入到SN6家蠶基因組第2染色體和SN8家蠶基因組第11染色體的基因間隔區(qū)中，并獲得了穩(wěn)定的遺傳和表達，已育成中部絲腺細胞能夠合成
權利要求
1.一種家蠶中部絲腺細胞合成分泌狂犬病病毒核蛋白的方法，其特征在于該方法的步驟如下(1)采用分子生物學技術構建家蠶合成分泌狂犬病病毒核蛋白的載體 pBSerlRVNP-A3EGFP 質粒；(2)采用顯微注射轉基因家蠶方法將pBkrlRVNP-A3EGFP質粒及能夠提供轉座酶 trans的輔助質粒導入家蠶已解除滯育的受精卵內，蠶卵孵化后飼養(yǎng)至成蟲，自交續(xù)代為 Gl代，在Gl代轉基因家蠶的小蠶期，通過熒光體視顯微鏡觀察選擇表達EGFP標志基因的轉基因家蠶，飼養(yǎng)至成蟲自交續(xù)代為G2代，G2代以后均采用蛾區(qū)育，成蟲自交續(xù)代，再經(jīng)1-3 代選種，每代采用轉基因昆蟲熒光基因表達相對量無損傷測定方法，以表達EGFP標志基因及絲膠蠶性狀為留種篩選標志，育成中部絲腺細胞能夠合成分泌狂犬病病毒核蛋白、基因純合的轉基因家蠶新品種。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種家蠶中部絲腺細胞合成分泌狂犬病病毒核蛋白的方法，其特征在于所述的pBkr 1RVNP-A3EGFP質粒是以ρ i ggyBac轉座質粒為基礎，質粒帶有Amp抗性基因以用于質粒的擴增和篩選，包含piggyBac轉座子的2個轉座臂 PBL和PBR，包含2個功能表達框，一個是A3啟動子啟動的綠色熒光蛋白基因表達框A3 Promoter+EGFP+SV40,以用作轉基因陽性家蠶的篩選標志，另一個是家蠶絲膠蛋白1啟動子、帶有便于提純外源蛋白的His接頭以及狂犬病病毒核蛋白基因的表達框％1~1 Promoter +His+hLYZ+SV40,以表達狂犬病病毒核蛋白，輔助質粒包含Amp抗性基因、piggyBac轉座子的1個轉座臂PBR、A3啟動子啟動的轉座酶trans基因表達框A3 Promoter+ trans,以提供轉座酶。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種家蠶中部絲腺細胞合成分泌狂犬病病毒核蛋白的方法， 其特征在于采用顯微注射轉基因家蠶方法將pBkrlRVNP-A3EGFP質粒及能夠提供轉座酶 trans的輔助質粒導入家蠶已解除滯育的受精卵，其家蠶品種是突變品種絲膠蠶，所述的以絲膠蠶性狀為每代的留種篩選標志，其篩選的時期是蠶繭時期。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種家蠶中部絲腺細胞合成分泌狂犬病病毒核蛋白的方法。先構建家蠶合成分泌狂犬病病毒核蛋白RVNP的載體pBSer1RVNP-A3EGFP質粒，再利用顯微注射轉基因家蠶技術將這種質粒與能夠提供轉座酶的輔助質粒一起導入到家蠶突變品種絲膠蠶已解除滯育的受精卵內，依靠piggyBac轉座子的轉座特性，使綠色熒光蛋白基因和狂犬病病毒核蛋白基因導入到絲膠蠶的基因組內，并得到穩(wěn)定遺傳和表達，從而創(chuàng)制成一種能夠在家蠶中部絲腺細胞特異性合成分泌狂犬病病毒核蛋白的轉基因家蠶。
文檔編號A01K67/04GK102242147SQ20111012358
公開日2011年11月16日 申請日期2011年5月13日 優(yōu)先權日2011年5月13日
發(fā)明者危浩, 周繼勇, 莊蘭芳, 鄭育良, 鐘伯雄, 阮系真, 顏焰 申請人:浙江同點生物科技有限公司, 浙江大學