專利名稱：一種海馬抗菌肽hkplp的化學合成方法及其在養(yǎng)殖業(yè)中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及ー種天然抗生素海馬抗菌肽hkplp的化學合成方法，特別涉及固相合成海馬抗菌肽；本發(fā)明還涉及合成的海馬抗菌肽在養(yǎng)殖業(yè)中的應用。背景技木近年來隨著抗生素的濫用，抗藥菌越來越多，耐藥性日益嚴重，不僅表現(xiàn)在臨床上，同時還牽涉到養(yǎng)殖業(yè)。據(jù)資料顯示，在美國臨床上分離到的金葡菌有95%對青霉素耐藥，50 以上對甲氧西林耐藥(Frindkin SK, Gaynes RP. Antimicrobialresistance in intensive care units. Clin Chest Med. 1999,20 (2) :303-316) ；20 世紀80年代以來，萬古霉素耐藥菌株也有增長趨勢，包括耐萬古霉素金黃色葡萄球菌和腸球國(The centers for Disease Control and Prevention. Staphylococus aureus withreduced sueceptibility to vancomycin-United States 1997.JAMA,1997,278(II)891-892)。隨著人們對環(huán)保意識的增強及食品安全級別意識的提高，傳統(tǒng)抗生素的濫用導致“超級細菌”的出現(xiàn)，迫切需要綠色環(huán)保、安全抗耐藥的新一代抗生素取代。
抗菌肽為動物體內(nèi)免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，是ー類小分子肽，被稱為無污染的天然抗生素，具有廣譜抗菌、無耐藥性、熱穩(wěn)定、水溶性好、無毒無殘留等優(yōu)點，符合現(xiàn)代環(huán)保的觀念。據(jù)統(tǒng)計，目前我國尚有多達20種人畜共用或畜禽專用的抗生素作飼料添加齊U，隨著我國加入WT0，抗生素作飼料添加劑必將嚴重影響我們的家畜產(chǎn)品在國際市場的競爭力。將抗菌肽產(chǎn)品開發(fā)成新的代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗生素添加劑的綠色飼料添加剤，將給我國的飼料添加劑行業(yè)注入ー針強心劑，將整體提升飼料行業(yè)的層次，使我國的飼料產(chǎn)品在世界市場更具競爭力，推動我國飼料行業(yè)不斷向前發(fā)展。我們前期的實驗結果表明從海馬中克隆得到的兩個抗菌肽基因hkplp和hkabf都具有很好的抗菌活性。以HKABF為例，重組HKABF對G+菌比較敏感，尤其是對金黃色葡萄球菌，在0. g/ml的蛋白濃度即可抑制稀釋為約5X106CFU/ml濃度的金黃色葡萄球菌。測試的微生物菌中，其次敏感的為白色葡萄球菌，MIC為2. 5 ii g/ml，再次為華納葡萄球菌(MIC為5 ii g/ml)和廣州疾控中心分離出的金黃色葡萄球菌III (MIC為5 yg/ml)，中山大學附屬二院分離鑒定出的金黃色葡萄球菌II (MIC為15iig/ml)，對于摩根氏菌(MIC為30 u g/ml)和創(chuàng)傷弧菌(MIC為120 u g/ml)這兩種G_菌在較低肽濃度下也能抑制其生長。對于其它G+和G—菌甚至真菌(白色念珠菌、酵母、熱帶念珠菌)在比較高的蛋白濃度下有的也能顯示出不同的抑菌效果。將兩個抗菌肽基因hkplp和hkabf同時經(jīng)畢赤酵母KM71重組表達，檢測其抗菌活性表明hkplp的抗菌活性要明顯優(yōu)于HKABF，因此我們選擇了抗菌肽基因hkplp人工合成作為抗菌肽飼料添加劑的開發(fā)對象。海馬抗菌肽hkplp 序列FLGLIFHGLVHAGKLIHGLIHRNR-NH2 分子式C128H2tl5N41O25,分子量MWm :2718. 32，MW[mon] :2716. 6 ;不含有稀有氨基酸和外源化學成分，在動物消化道中具有良好的穩(wěn)定性，同時具有免疫原性小、水溶性好、廣譜殺菌甚至能夠殺真菌、原蟲且不產(chǎn)生耐藥性菌株等優(yōu)點，能耐受胃腸道中蛋白酶及肽酶的降解。特別是在酸性條件下，加熱甚至是高溫高壓處理對其抗菌活性沒有影響，因此不僅能夠耐受飼料加工過程中高溫高壓的劇烈條件，并且可以在飼料保存過程中持續(xù)發(fā)揮其功能，保持飼料品質(zhì)，延長貯存期限。Hkplp可以作為新一代的綠色飼料添加劑，是很好的傳統(tǒng)抗生素替代品，能有效得解決人和動物藥殘和病原菌耐藥性的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種海馬抗菌肽hkplp的化學合成方法，通過固相合成法人工合成hkplp，解決發(fā)酵方法不穩(wěn)定難大生產(chǎn)的技術問題；本發(fā)明的另一個目的是提供合成的海馬抗菌肽在飼料添加劑中的應用。本發(fā)明的方法包括如下步驟(I)以氨基樹脂為起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有保護基團的氨基酸。其中Fmoc-AA、縮合劑比例按摩爾比I : I投放，F(xiàn)moc-AA按縮合量的2-5倍量加入，獲得保護24肽樹脂,期間依次脫除Fmoc保護基團，每一步氨基酸縮合均采用Kaise Test檢測反應是否縮合完全，如顯色反應呈陽性重復縮合該氨基酸，序列縮合最后直接脫除Fmoc保護基團。氨基酸縮合反應一次2-4小時,脫Fmoc反應分2次進行,分別為5min, 15min。(2)用TFA Tis Phenol按體積比95 2. 5 2. 5的混合溶液處理肽樹脂3-4 小時，把肽從樹脂上切下來及切除側鏈保護基，濃縮或吹至干后用冰乙醚析出固體，離心干燥得粗品。(3)用I %的醋酸溶液處理hkplp粗品，過GlO柱后濃縮干燥得成品。(4)合成抗菌肽hkplp抗菌譜的測定。(5)用倍比稀釋培養(yǎng)法測OD63tl值確定人工合成hkplp最小抑菌濃度(MIC)。(6)人工合成hkplp抗菌活性單位的確定(7)將hkplp成品添加到飼料中在養(yǎng)殖業(yè)中的應用。上述步驟(I)中氨基樹脂包括所有Fmoc-Rink氨基類樹脂,這里優(yōu)選為Fmoc-RinkAmide Resin ;縮合劑體系為 DIC+A 或 A+B+C，其中 A 為 HOBt 或 HOAt，B 為 HBTU、HATU、PyBOP或TBTU，C為DIPEA或TMP，可以采用排列組合的方式相互組合，優(yōu)選為DIC+HOBt ；Fmoc-AA分別為Fmoc-Phe_0H, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-His(Trt)-0H,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH ;溶劑優(yōu)選為DMF。其中氨基樹脂替代度選為0. 2mmol_l. Ommol/g,本發(fā)明所述選用Fmoc-Rink Amide樹脂。偶聯(lián)劑體系為DIC+A或A+B+C，其中A為HOBt或HOAt，B為HBTU、HATU, PyBOP或TBTU, C為DIPEA或TMP，本方案技術人員可根據(jù)排列組合的方式相互組合包括DIC/HOBt、DIC/H0At、HBTU/HOBt、HATU/HOAt、PyBOP/HOBt、PyBOP/HOAt、TBTU/HOBt TBTU/HOAt 等方式，采用的有機堿C為DIPEA或TMP。本發(fā)明中一些常用的縮寫具有以下含義Fmoc-Rink Amide Resin :荷甲氧擬基-氨基樹脂F(xiàn)moc :荷甲氧羰基Fmoc-AA N-芴甲氧羰基氨基酸Fmoc-Phe-OH :N_荷甲氧羰基-苯丙氨酸Fmoc-Leu-OH :N_荷甲氧羰基_亮氨酸Fmoc-Gly-OH :N_芴甲氧羰基-甘氨酸Fmoc-Ile-OH :N_芴甲氧羰基-異亮氨酸Fmoc-His(Trt)-OH :N_荷甲氧羰基_組氨酸(三苯基)
Fmoc-Val-OH :N_芴甲氧羰基-纈氨酸Fmoc-Ala-OH :N_芴甲氧羰基-丙氨酸Fmoc-Lys (Boc) -OH N-荷甲氧羰基-賴氨酸(叔丁氧羰基)Fmoc-Arg (Pbf) -OH N-荷甲氧羰基_精氨酸(磺?；?Fmoc-Asn (Trt) -OH N-荷甲氧羰基_天冬酰胺(三苯基)TFA:三氟乙酸Tis :二異丙基娃燒Phenol :苯酌■
DIC :二異丙基碳二亞胺HOBt I-羥基苯并三唑HOAt I-羥基-7-偶氮苯并三唑HBTU :0-苯并三唑-N，N，N，，N，-四甲基脲鎗六氟磷酸鹽TBTU :0-(苯并三唑_1_氧)-N，N，N，，N，-四甲基脲鎗六氟硼酸鹽HATU :0-(7-偶氣苯并二氣卩坐-I-氧)-N, N, N’，N’ _四甲基服鐵TK氣憐酸鹽PyBOP (苯并三唑-I-氧)三吡咯烷基磷鎗六氟磷酸鹽DIPEA :二異丙基乙胺TMP :2，4，6_ 三甲基吡啶DMF N, N- 二甲基甲酰胺DCM: 二氯甲烷MeOH:甲醇合成路線如下
權利要求
1.一種海馬抗菌肽hkplp的化學合成方法及其在養(yǎng)殖業(yè)中的應用，主要包括以下步驟 1)以氨基樹脂為載體，按照固相合成的方法依次連接具有保護基團的氨基酸，獲得hkplp-氨基樹脂,期間依次脫除Fmoc保護基團； 2)用三氟乙酸混合溶液把肽從樹脂上切下，處理干燥得粗品； 3)粗品過GlO柱純化，濃縮干燥獲得成品； 4)測定人工合成的抗菌肽hkplp的抗菌譜； 5)測定人工合成的抗菌肽hkplp的最小抑菌濃度(MIC)； 6)將人工合成的抗菌肽hkplp添加到飼料中在養(yǎng)殖業(yè)中的應用。
2.根據(jù)權利要求I所述方法，其特征是所述氨基樹脂為Fmoc-氨基樹脂。
3.根據(jù)權利要求I所述方法，其特征是固相合成連接氨基酸過程中，F(xiàn)moc保護基團脫除劑用20%哌啶/DMF，F(xiàn)moc-AA按縮合量的2_5倍量加入，其中Fmoc-AA、縮合劑比例按摩爾比I : I投放，縮合反應每次2-4小時。
4.根據(jù)權利要求I和3所述方法，其特征是在氨基酸連接過程中，每一步氨基酸縮合均采用Kaise Test檢測反應是否縮合完全，如顯色反應呈陽性重復縮合該氨基酸。
5.根據(jù)權利要求I和3所述方法，其特征是縮合劑體系采用DIC+A或A+B+C，其中A為HOBt或H0At，B為HBTU、HATU、PyBOP或TBTU，C為DIPEA或TMP，可以采用排列組合的方式相互組合。
6.根據(jù)權利要求I中2)所述方法，其特征是三氟乙酸混合溶液為TFA Tis Phenol按體積比95 2. 5 2. 5，反應時間為3-4小時。
7.根據(jù)權利要求I中2)所述方法，其特征是處理干燥是指切割液濃縮或吹至干后用冰乙醚析出固體，尚心干燥。
8.根據(jù)權利要求I中3)所述方法，其特征是用I%的醋酸溶液處理hkplp粗品，離心取上清過GlO柱。
9.根據(jù)權利要求I中3)所述方法，其特征是收集的hkplp過柱液經(jīng)濃縮后干燥。
10.根據(jù)權利要求I中4)所述內(nèi)容，其特征是用平板培養(yǎng)法表明人工合成的hkplp對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌K12D31、大腸桿菌DH5 a、沙門氏菌、動物致病大腸桿菌和醫(yī)院臨床病例分離的大腸埃希菌、尿腸球菌、溶血葡萄球菌均有良好的抗菌活性。
11.根據(jù)權利要求I中5)所述內(nèi)容，其特征是采用倍比稀釋的方法配制不同濃度的hkplp溶液，加入到培養(yǎng)菌液中培養(yǎng)16h后測OD63tl值，確定人工合成hkplp對不同菌株的最小抑菌濃度MIC。
12.根據(jù)權利要求I中6)所述內(nèi)容，其特征是養(yǎng)殖業(yè)中的應用是指對養(yǎng)殖動物的應用，包括獸牧、水產(chǎn)及家禽等。
13.根據(jù)權利要求I中6)所述內(nèi)容,其特征是人工合成抗菌肽hkplp以200ppm、500ppm、IOOOppm不同濃度加到飼料中在春秋兩個季節(jié)對對奸生長的影響。
14.根據(jù)權利要求I中6)所述內(nèi)容，其特征是人工合成抗菌肽hkplp添加到飼料中與傳統(tǒng)飼料做比較對雞的影響。
15.根據(jù)權利要求I中6)所述內(nèi)容，其特征是人工合成抗菌肽hkplp的應用是指作為飼料添加劑添加到飼料中。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種來源于大海馬的天然抗菌肽hkplp的化學合成方法，主要合成步驟為以氨基樹脂為載體，按固相合成的方法首先合成hkplp-氨基樹脂，經(jīng)TFA處理后獲得粗肽，粗肽經(jīng)G10處理干燥獲得hkplp成品。本發(fā)明涉及的另一問題是該抗菌肽成品在養(yǎng)殖業(yè)中的應用，主要解決了人工合成抗菌肽hkplp抗菌譜及最小抑菌濃度的測定和抗菌活性單位的確定；另外將該合成的抗菌肽成品加到飼料中優(yōu)選對蝦和雞為實驗對象，表明人工合成的hkplp能夠代替抗生素，預防消化道疾病、促進生長、增加體重，可以作為畜禽和水產(chǎn)飼料添加劑。
文檔編號A23K1/17GK102757490SQ201110110020
公開日2012年10月31日 申請日期2011年4月28日 優(yōu)先權日2011年4月28日
發(fā)明者吳松青, 孫丹丹, 徐安龍, 梁東, 胡軍清, 荊琛峰 申請人:廣東中大南海海洋生物技術工程中心有限公司