專利名稱：：基于AlcR/alcA和Cre/loxP系統(tǒng)的標記基因誘導(dǎo)刪除體系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種基于AlcR/alcA和Cre/loxP系統(tǒng)的標記基因誘導(dǎo)刪除體系。
背景技術(shù)：
：自1983年首次獲得轉(zhuǎn)基因煙草以來，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了飛速的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因作物的種類、產(chǎn)量都迅速增加。然而，隨著商業(yè)化轉(zhuǎn)基因植物新品種的不斷出現(xiàn)，人們對轉(zhuǎn)基因植物的食用安全性和環(huán)境安全性也提出了質(zhì)疑(NatarajanS，TurnaJ.Excisionofselectablemarkergenesfromtransgeniccropsasaconcernforenvironmentalbiosafety[J].JournaloftheScienceofFoodandAgriculture,2007,87(14):2M7-25M.)。究其原因是由于目前幾乎所有的植物遺傳轉(zhuǎn)化都要使用選擇標記基因，一般是抗除草劑或抗生素抗性基因，以提高篩選效率。但轉(zhuǎn)基因植株一旦獲得，選擇標記基因便不再有用，甚至有可能有不良影響。爭論最多的是選擇標記基因的存在是否會干擾鄰近基因的表達(李曉兵，陳彩艷，翟文學(xué).培育具有安全性選擇標記基因或無選擇標記基因的轉(zhuǎn)基因植物.遺傳，2003，25(3):345-349.),是否會影響人畜的健康(KuiperHA,KleterGA,NotebornHPetal.Assessmentoffoodsafetyissuesrelatedtogeneticallymodifiedfoods.PlantJ，2001，27:503-528.)，轉(zhuǎn)基因植物中的外源優(yōu)勢基因可能會帶來基因逃逸，引發(fā)超級雜草(MewartCNJr,RichardsHA4th，HalfhillMD.Transgenicplantsandbiosafety:sciencemisconceptionsandpublicperc印tions[J]·Biotechnicques，2000，29(4):832.)，使害蟲產(chǎn)生抗性等安全性問題(KaiGuo-yin,ZhangLei，ZhangHong-yu,etal，Marker-free:anoveltendencyoftransgenicplants.ActaBotanicaSinica，2002，44(8):883-888.)。為了避免上述問題，國內(nèi)外研究者發(fā)展了多種有效的策略培育安全的轉(zhuǎn)基因植物。主要包括利用生物安全標記基因和無選擇標記基因的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，及獲得轉(zhuǎn)基因植株后去除選擇標記基因的三種方法。其中獲得轉(zhuǎn)基因植株后去除選擇標記基因方法主要包括共轉(zhuǎn)化法(SUNL,ZHANGQX，ZHOUL,LUΜ,CAIΜ.Generatingmarker-freetransgenicchrysanthemumbyagrobacteriummediatedtransformationwithtwinT-DNAbinaryvectors[J].ActaHorticulturaeSinica,2008,35(5):727-734.；ZHUL,FUYP,LIUffΖ,HUGC,SIHΜ,TANGKXANDSUNZX.Rapidgenerationofselectablemarker-freetransgenicricewiththreetargetgenesbyco-transformationandantherculture[J].RiceScience,2007,14(4):239-246.),利用Cre/loxP,FLP/frt,R/RS等位點特異性重組酶系統(tǒng)(宋洪元，任雪松，司軍，李成瓊，宋明，雷建軍.利用Cre/lox重組系統(tǒng)獲得無選擇標記的SKTI抗蟲轉(zhuǎn)基因煙草.西北植物學(xué)報，2010，30(1):21-29.；HonggeJia，YongqiPang,XiaoyingChen,RongxiangFang.RemovaloftheselectablemarkergenefromtransgenictobaccoplantsbyexpressionofCrerecombinasefromaTobaccoMosaicVirusvectorthroughagroinfection.Transgenic!ResearchQ006)15:375-384.)，轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)(CHARNGYC，LIKΤ,TAIHKiLINNSTUJ.Aninducibletransposonsystemtoterminatethefunctionofaselectablemarkerintransgenicplants[J].MolecularBreeding,2008,21(3):359_368.)，同源重%統(tǒng)(ZUBKO,Ε,SCUTTC,MEYERP.IntrachromosomalrecombinationbetweenattPregionsasatooltoremoveselectablemarkergenesfromtobaccotransgenes[J].NatureBiotechnology,2000，18(4)，442-445.)等。來源于噬菌體Pl的Cre/loxP位點特異性重組系統(tǒng)，是培育無選擇標記基因植物研究中最為詳細、應(yīng)用最廣的技術(shù)之一(宋洪元，任雪松，司軍，李成瓊，宋明，雷建軍.利用Cre/lox重組系統(tǒng)獲得無選擇標記的SKTI抗蟲轉(zhuǎn)基因煙草.西北植物學(xué)報，2010，30(1):21-29.；HonggeJia,YongqiPang，XiaoyingChen，RongxiangFang.RemovaloftheselectablemarkergenefromtransgenictobaccoplantsbyexpressionofCrerecombinasefromaTobaccoMosaicVirusvectorthroughagroinfection.TransgenicResearch(2006)15:375-384.；YongWang，BojunChen，YuanleiHu,JingfuLi.ZhongpingLin.InducibleexcisionofselectablemarkergenefromtransgenicplantsbytheCre/loxsite-specificrecombinationsystem.TransgenicResearch，2005，14605-614.；YUANYuan，LIUYun-Jun,WANGTao·ANewCre/loxSystemforDeletionofSelectableMarkerGene.ActaBotanicaSinica2004，46(7):862-866.)。Cre/loxP系統(tǒng)中的Cre重組酶專一性地識別由34個堿基對組成的特異序列(IoxP位點)。若2個IoxP位點方向相同，IoxP位點之間的DNA片段(如選擇標記基因)重組后被剔除。Cre重組酶不借助任何輔助因子，可作用于多種結(jié)構(gòu)的DNA底物，如線形、環(huán)狀甚至超螺旋DNACTrinhKR,MorrisonSL.Site-specificanddirectionalgenereplacementmediatedbyCrerecombinase.JournalofImmunologicalMethods,2000,244:185-193.；YangX,HuangPT,HuangCF.Progressofgenetargetinginmouse.ChineseScienceBulletin,2001,46:265-271.)。人們最初利用Cre/loxP系統(tǒng)是和其他去除選擇標記基因方法一樣，需要通過二次轉(zhuǎn)化或有性雜交引入重組酶，然后通過自交進一步去除重組酶基因及其所帶入的另一個選擇標記基因，使得選育過程復(fù)雜，周期過長，且不適于無性繁殖作物。因此，研究者在此基礎(chǔ)上發(fā)展了化學(xué)誘導(dǎo)表達的位點特異性重組系統(tǒng)，利用受化學(xué)誘導(dǎo)的啟動子控制重組酶表達。這樣就可以一次性將目的基因、選擇標記基因和重組酶基因轉(zhuǎn)入受體植株中，然后在適當(dāng)?shù)臅r候誘導(dǎo)重組酶表達，去除選擇標記基因和重組酶基因本身。Zuo等(ZuoJR，NiuQW,MollerSG,ChuanNH.Chemical-regulated,site-specificDNAexcisionintransgenicplants.NatureBiotechnology,2001.19:157-161.)開發(fā)了一套化學(xué)誘導(dǎo)啟動子控制位點特異重組酶表達的系統(tǒng)，以受β-雌二醇誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子XVE控制Cre基因的表達，從而剔除IoxP序列之間的選擇標記基因，獲得了高頻率的無選擇標記的轉(zhuǎn)基因擬南芥。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種基于AlcR/alcA和Cre/loxP系統(tǒng)的標記基因誘導(dǎo)刪除體系。本發(fā)明提供了一種在植物生長的特定時期，通過誘導(dǎo)將轉(zhuǎn)基因植物的標記基因刪除，獲得無篩選基因的轉(zhuǎn)基因植物(可誘導(dǎo)刪除篩選基因的轉(zhuǎn)基因植物)的方法，包括如下步驟(1)用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化出發(fā)植物，通過所述篩選基因(篩選標記基因)篩選得到同時含有所述篩選基因和所述外源目的基因的轉(zhuǎn)基因植物；所述重組質(zhì)粒包括特異DNA片段甲和特異DNA片段乙；所述特異DNA片段甲和所述特異DNA片段乙在所述重組質(zhì)粒上沒有重疊區(qū)域；所述DNA片段甲的兩端各具有一個同向的LoxP位點，兩個LoxP位點間包括表達盒甲、表達盒乙和表達盒丙；所述表達盒甲為篩選基因的表達盒，所述篩選基因為組成型表達；所述表達盒乙為AlcR轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因的表達盒，所述AlcR轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因為組成型表達；所述表達盒丙為Cre重組酶的編碼基因的表達盒，所述Cre重組酶的編碼基因由alCA-mini35S嵌合啟動子啟動表達；所述表達盒丙位于所述表達盒甲和所述表達盒乙的下游；所述AlcR轉(zhuǎn)錄因子為序列表的序列2所示的蛋白質(zhì)；所述Cre重組酶為序列表的序列3所示的蛋白質(zhì)；所述alCA-mini35S嵌合啟動子如序列表的序列1自5’末端第4268-4568位核苷酸所示；所述特異DNA片段乙含有表達盒丁；所述表達盒丁為外源目的基因的表達盒；(2)將步驟⑴得到的轉(zhuǎn)基因植物在施加乙醇的條件下培養(yǎng)，得到含有所述外源目的基因且不含有所述篩選基因的目的轉(zhuǎn)基因植物。所述LoxP位點可如序列表的序列1自5’末端第91-1位核苷酸所示。所述AlcR轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因可如序列表的序列1自5’末端第1575-4040位核苷酸所示。所述Cre重組酶的編碼基因可如序列表的序列1自5’末端第4569-5770位核苷酸所示(第5003-5172位核苷酸為內(nèi)含子)。所述表達盒乙中，所述AlcR轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因可由Gichxi啟動子啟動表達，由35S終止子終止表達。所述Gltl,啟動子可如序列表的序列1自5’末端第14四-1574位核苷酸所示。所述35S終止子可如序列表的序列1自5’末端第4041-4249位核苷酸所示。所述表達盒丙中，所述Cre重組酶編碼基因可由Nos終止子丙終止表達。所述Nos終止子丙可如序列表的序列1自5’末端第5771-6201位核苷酸所示。所述表達盒甲中，所述篩選基因可由35S啟動子甲啟動表達，由Nos終止子甲終止表達。所述35S啟動子甲可如序列表的序列1自5’末端第125-576位核苷酸所示。所述Nos終止子甲可如序列表的序列1自5’末端第1129-1422位核苷酸所示。所述篩選基因優(yōu)選為序列表的序列1自5’末端第577-11位核苷酸所示的Bar基因。所述特異DNA片段甲具體可如序列表的序列1自5’末端第91-6235位核苷酸所7J\ο所述重組質(zhì)粒具體可為在質(zhì)粒pBBRlMCS-2的骨架上插入所述DNA片段甲和所述DNA片段乙得到的重組質(zhì)粒。所述DNA片段乙具體可如序列表的序列4所示。所述重組質(zhì)粒具體可為將序列表的序列4所示DNA插入中間質(zhì)粒的kal和SpeI酶切位點之間得到的重組質(zhì)粒；所述中間質(zhì)粒為將序列表的序列1所示DNA插入質(zhì)粒pBBRlMCS-2的kpl酶切位點之間得到的重組質(zhì)粒。所述出發(fā)植物可為單子葉植物或雙子葉植物，如擬南芥等。本發(fā)明還保護一種雙鏈DNA片段，包括兩個同向的LoxP位點以及位于兩個所述LoxP位點間的表達盒甲、表達盒乙和表達盒丙；所述表達盒甲為篩選基因的表達盒，所述篩選基因為組成型表達；所述表達盒乙為AlcR轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因的表達盒，所述AlcR轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因為組成型表達；所述表達盒丙為Cre重組酶的編碼基因的表達盒，所述Cre重組酶的編碼基因由alCA-mini35S嵌合啟動子啟動表達；所述表達盒丙位于所述表達盒甲和所述表達盒乙的下游；所述AlcR轉(zhuǎn)錄因子為序列表的序列2所示的蛋白質(zhì)；所述Cre重組酶為序列表的序列3所示的蛋白質(zhì)；所述alCA-mini35S嵌合啟動子如序列表的序列1自5，末端第4268-4568位核苷酸所示。所述LoxP位點可如序列表的序列1自5’末端第91-1位核苷酸所示。所述AlcR轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因可如序列表的序列1自5’末端第1575-4040位核苷酸所示。所述Cre重組酶的編碼基因可如序列表的序列1自5’末端第4569-5770位核苷酸所示(第5003-5172位核苷酸為內(nèi)含子)。所述表達盒乙中，所述AlcR轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因可由Gichxi啟動子啟動表達，由35S終止子終止表達。所述Gltl,啟動子可如序列表的序列1自5’末端第14四-1574位核苷酸所示。所述35S終止子可如序列表的序列1自5’末端第4041-4249位核苷酸所示。所述表達盒丙中，所述Cre重組酶編碼基因可由Nos終止子丙終止表達。所述Nos終止子丙可如序列表的序列1自5’末端第5771-6201位核苷酸所示。所述表達盒甲中，所述篩選基因可由35S啟動子甲啟動表達，由Nos終止子甲終止表達。所述35S啟動子甲可如序列表的序列1自5’末端第125-576位核苷酸所示。所述Nos終止子甲可如序列表的序列1自5’末端第1129-1422位核苷酸所示。所述篩選基因優(yōu)選為序列表的序列1自5’末端第577-11位核苷酸所示的Bar基因。所述雙鏈DNA片段具體可如序列表的序列1自5’末端第91-6235位核苷酸所示，優(yōu)選為序列表的序列1所示DNA。含有所述雙鏈DNA片段的重組表達載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因細胞系也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述重組表達載體可為在質(zhì)粒pBBRlMCS-2的kpl酶切位點之間插入序列表的序列1所示DNA得到的重組質(zhì)粒。所述雙鏈DNA片段或所述重組質(zhì)粒均可用于培育轉(zhuǎn)基因植物，特別是通過誘導(dǎo)刪除標記基因的無篩選標記基因的轉(zhuǎn)基因植物。基于AlcR蛋白調(diào)控的乙醇誘導(dǎo)系統(tǒng)相對于其他的化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)因其經(jīng)濟、易用和高效性的特點，在農(nóng)業(yè)上顯現(xiàn)出極高的應(yīng)用價值。本發(fā)明提供的基于AlcR/alcA和Cre/IoxP系統(tǒng)的標記基因誘導(dǎo)刪除體系(重組表達載體)由兩個轉(zhuǎn)錄單位組成，第一個轉(zhuǎn)錄單位是由一個強組成型啟動子(如CaMV35Q轉(zhuǎn)錄對乙醇敏感的AlcR轉(zhuǎn)錄因子，第二個轉(zhuǎn)錄單位含有alcA-min35S嵌合啟動子，調(diào)控下游Cre基因的表達。誘導(dǎo)前Cre基因不表達，不發(fā)生刪除作用。當(dāng)在乙醇存在時，轉(zhuǎn)錄因子AlcR構(gòu)象改變，結(jié)合到alcA-min35S上，激活下游Cre基因的表達。Cre重組酶識別2個同向IoxP位點，剔除位點之間的DNA片段，包括選擇標記基因、AlcR/alcA系統(tǒng)和Cre/loxP系統(tǒng)，而IoxP位點之外的目的基因在誘導(dǎo)前后始終表達。應(yīng)用本發(fā)明提供的重組表達載體制備轉(zhuǎn)基因植物，能夠在植物生長發(fā)育的特定時期將篩選基因(甚至整個外源插入片段)通過誘導(dǎo)刪除，解決轉(zhuǎn)基因植物給環(huán)境帶來的安^^^急^^ο圖1為各個重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為誘導(dǎo)前后植物中保留的功能元件。圖3為植株Cre表達框的PCR檢測；1-3陽性植株；4野生型；5陽性對照；6空白對照；7IOObpmarker。圖4為FRB區(qū)段的鑒定結(jié)果；1空白對照；2、以野生株cDNA為模板；3、以陽性單株cDNA為模板；4以陽性單株基因組DNA為模板；5IOObpmarker。圖5為alcR基因的鑒定結(jié)果；1IOObpmarker；2空白對照；3野生株；4陽性對照；5陽性單株。圖6為葉片⑶S組織化學(xué)染色結(jié)果；A、B陽性單株，C野生株。圖7為FRB區(qū)段的鑒定結(jié)果；1空白對照；2以未誘導(dǎo)的野生株cDNA為模板；3以未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因植株cDNA為模板；4以乙醇誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因單株cDNA為模板；5以未誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因單株基因組DNA為模板；6IOObpmarker圖8為ere基因的鑒定結(jié)果；1空白對照；2未誘導(dǎo)的野生株cDNA；3未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因植株cDNA；4乙醇誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因植株cDNA；5未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA；6IOObpmarker。圖9為表型觀察；A-E分別為乙醇誘導(dǎo)的5個純合株系植株的幼苗，F(xiàn)為未誘導(dǎo)的1個純合株系植株幼苗。圖10為轉(zhuǎn)基因植株乙醇誘導(dǎo)后LB-loxP-35S-GUS片段的PCR檢測；1、2轉(zhuǎn)基因植株；3IOObpmarker；4野生株；5空白對照。具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。Columbia生態(tài)型擬南芥(Col-Ο，野生株)購自ABRC(ArabidopsisBiologicalResourceCenter,Columbus,OH,USA)。大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α,購自Tiangen公司。內(nèi)切酶、去磷酸化酶、連接酶等購自Takara公司。質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自Axygen公司。人工寡核苷酸引物合成及測序由北京三博遠志生物技術(shù)公司完成。載體pBluescriptIIKS+Stratagene公司(目錄編號212207)。載體pBI121:北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，(產(chǎn)品目錄編號為8023-01)；參考文獻=GenBankAF485783CompletesequenceofthebinaryvectorpBI121anditsapplicationincloningT-DNAinsertionfromtransgenicplants.U003)Mol.Breed.11，287-293。構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans):中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌株編號CICC2438。載體pUC18=Fermentas公司(產(chǎn)品目錄編號為SD0051)。載體pGEM-TEasy:Promega(產(chǎn)品目錄號為A1360)。根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101pMP90公眾可以從北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心獲得；參考文獻:Koncz,C.andSchell,J.(1986)ThepromoterofTL-DNAgene5controlsthetissue-specificexpressionofchimericgenescarriedbyanoveltypeofAgrobacteriumbinaryvector.Mol.Gen.Genet.204,383—396。質(zhì)粒pX7-GFP公眾可以從北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心獲得；參考文獻GuoHS，F(xiàn)eiJF,XieQ,ChuaNH.Achemical-regulatedinducibleRNAisysteminplants.ThePlantJournal,2003,34(3):383_392。質(zhì)粒pRT103:公眾可以從北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心獲得；參考文獻Asetofplantexpressionvectorsfortranscriptionalandtranslationalfusions,NucleicAcidsResearch,1987,(15):5890。質(zhì)粒pDHB321.1(pGSFR280派生質(zhì)粒)公眾可以從北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心獲得；參考文獻:BlockMD,BottermanJ,VandewieleΜ,DockxJ,ThoenC,GosseleV,MovvaNR,ThompsonC,MontaguMV,LeemansJ.Engineeringherbicideresistanceinplantsbyexpressionofadetoxifyingenzyme.EMBOJ.1987Sep；6(9):2513-8.。質(zhì)粒pBBRlMCS-2:公眾可以從北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心獲得；參考文獻KovachME,ElzerPH,HillDS,RobertsonGT,FarrisMA,RoopRM2nd,PetersonKM.Fournewderivativesofthebroad-host-rangecloningvectorpBBRlMCS,carryingdifferentantibiotic-resistancecassettes.Gene.1995Dec1；166(1)175-6.。實施例1、質(zhì)粒的構(gòu)建一、植物表達載體pBBBH的構(gòu)建1、用SacI酶切質(zhì)粒pDHB321.1，回收約2100bp的片段(含LB-bar表達框-RB)。2、用kpl酶切質(zhì)粒pBBRlMCS-2，回收約4440bp的片段(含卡那霉素抗性基因的骨架)。3、將步驟1回收的約2100bp的片段補平，與步驟2回收的約4440bp的片段連接，獲得植物表達載體PBBB(抗除草劑Basta)。4、以植物表達載體pBBB為模板，用上游引物(下劃線標注AgeI酶切位點)和下游引物(下劃線標注EcoRI酶切位點)進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶AgeI和EcoRI酶切PCR擴增產(chǎn)物，回收約500bp的酶切產(chǎn)物。上游引物5，-TAAACCGGTAAACCAGCAATAGACATA-3’；下游引物5，-CGAATTCGATATCAAGCTTATCGCGATACCGTCGGCGGccRRRRRatccactaRttc-3，。5、用限制性內(nèi)切酶AgeI和EcoRI酶切植物表達載體pBBB，回收約6080bp的載體骨架。6、將步驟4的酶切產(chǎn)物與步驟5的載體骨架連接，得到植物表達載體pBBBH。植物表達載體pBBBH的結(jié)構(gòu)見圖1A，含有35S啟動子甲、Bar基因和Nos終止子甲組成的表達盒甲。植物表達載體pBBBH抗除草劑Basta，將植物表達載體pBBB的SmaI酶切識別位點改造成了HindIII酶切識別位點。二、重組質(zhì)粒pUGRA的構(gòu)建1、重組質(zhì)粒pUG的構(gòu)建以質(zhì)粒pRT103為模板，用上游引物G1Q_9Q5’(下劃線標注EcoRI酶切位點)和下游引物G1(i_9(i3’(下劃線標注SbfI酶切位點)進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(Gich9ci啟動子)。G10_9(i5’5’-GGAATTCGCCACGTGCCGCCACGTGCCGCCACGTGCCGCCACGTGCCCATCTCCACTGACGTAAGGGATGAC-3’；G10_903，5，-GGGCCTGCAGGAGCGTGTCCTCTCCAAATGAAATGAAC-3，。用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SbfI酶切PCR擴增產(chǎn)物，得到酶切產(chǎn)物。用限制性內(nèi)切酶EcoRI和^DfI酶切載體pUC18，得到載體骨架(約^46bp)。將所述酶切產(chǎn)物與所述載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pUG。2、重組質(zhì)粒pUGA的構(gòu)建以質(zhì)粒pRT103為模板，用上游引物PolyA5，(下劃線標注SbfI酶切位點)和下游引物PolyA3’(下劃線標注^flI和MI酶切位點)進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(35S終止子)。PolyA5':5，-GGGCCTGCAG^caaatcaccagtctctctctacaaatc-3'；PolyA3':5，-CCCAAGCTTGAATTCcactggattttggttttaggaattagaaat-3‘用限制性內(nèi)切酶HindIII和SbfI酶切PCR擴增產(chǎn)物，得到酶切產(chǎn)物。用限制性內(nèi)切酶HindIII和SbfI酶切重組質(zhì)粒pUG，得到載體骨架(約2780bp)。將所述酶切產(chǎn)物與所述載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pUGA。3、重組質(zhì)粒pUGRA的構(gòu)建參考NCBI中AlcR基因的序列(GenBankAF496548.1)設(shè)計上游引物AlcR5，(下劃線標注SbfI酶切位點)和下游引物AlcR3’(下劃線標注SbfI酶切位點)。AlcR5’5，-GGGCCTGCAGGATGGCAGATACGCGCCGACGCCAGAATC-3’；AlcR3’5，-GGGCCTGCAGGCTACAAAAAGCTGTCAACTTTCCCATTCAAACCTCTC-3’。提取構(gòu)巢曲霉的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，用AlcR5，和AlcR3，組成的引物對進行PCR擴增。用限制性內(nèi)切酶SbfI酶切PCR擴增產(chǎn)物，得到酶切產(chǎn)物。用限制性內(nèi)切酶SbfI酶切重組質(zhì)粒pUGA，得到載體骨架(約^95bp)。將所述酶切產(chǎn)物與所述載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pUGRA(AlcR基因表達框載體)。重組質(zhì)粒pUGRA中，Gich9ci啟動子、AlcR基因和35S終止子組成GichxiAlcR:35S_T片段(表達盒乙)。三、重組質(zhì)粒pBSK-alcA的構(gòu)建參考NCBI中alcA啟動子的序列(GenBankDQ076245.1)設(shè)計上游引物alcA5，(下劃線標注HindIII酶切位點)和下游引物alcA3’(下劃線標注EcoRI酶切位點)。alcA5，5，-CGCMGCTTgggatagttccgacctaggattgg-S'；alcA3，5，-G^Mll￡tttgaggcgaggtgataggattgg-3，。提取構(gòu)巢曲霉的基因組DNA。以基因組DNA為模板，用alcA5，和alcA3，組成的引物對進行PCR擴增。用限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoRI雙酶切PCR擴增產(chǎn)物，得到酶切產(chǎn)物。用限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoRI雙酶切載體pBluescriptIIKS+，得到載體骨架(約2949bp)。將所述酶切產(chǎn)物與所述載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pBSK-alcA(alcA啟動子載體)。四、重組質(zhì)粒pAC的構(gòu)建1、alcA_mini35S片段的擴增以重組質(zhì)粒pBSK-alcA為模板，用上游引物alcA_P5，(下劃線標注HindIII酶切位點)和下游引物mini35S3’組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(alcA_mini35S片段)。alcA_P5，5，-CGCAAGCTTGGGATAGTTCCGACCTAGGATTGG-3>；mini35S3，5，-gtcgtcctctccaaatgaaatgaacttccttatatagatgttcagctatgcgg-3，PCR擴增體系(20ul)=IOXTaqBuffer2ul,IOmMdNTP0.8ul，10μM上、下游引物各0.25ul,Tag酶0.5U,ddH20補至20ul。PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min；94°C30s、64°C40s,72°C30s，;35個循環(huán)；72°C延伸IOmin0電泳去除剩余引物，回收PCR擴增產(chǎn)物。2,mini35SCreNos_TLoxP片段的擴增以質(zhì)粒pX7-GFP為模板，用上游引物mini35S5’和下游引物N0SL0XP3，(下劃直線標注SpeI酶切位點，下劃曲線標注kal位點，方框標注LoxP位點)組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(mini35S:Cre:Nos_T:LoxP片段)。mini35S5’和mini35S3’為部分反向互補序列。mini35S5，5，-TCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGAC-3，；NosLoxP3，5，-GACTAGTAGTACT]^TAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCGATCTAGTAACATAGATGACACC-3‘。PCR擴增體系同步驟1。PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min-MV30s、64°C40s、72°C120s,35個循環(huán)；72°C延伸lOmin。電泳去除剩余引物，回收PCR擴增產(chǎn)物。3、重組質(zhì)粒pAC的構(gòu)建將alcA-mini35S片段和mini;35S:Cre:Nos_T:LoxP片段同時作為模板，用alcA_P5’和NosLoxP3’組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(alcA_mini35S片段與mini35S:Cre:Nos_T:LoxP片段的融合片段)。PCR擴增體系同步驟1。PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min-MV30s、55°C40s,72°C120s,10個循環(huán)(不加引物)；94°C30s、64°C40s,72°C150s，；35個循環(huán)(加入引物)72°C延伸IOmin0電泳回收PCR擴增產(chǎn)物，并連接到載體PGEM-Tfesy上，得到重組質(zhì)粒pAC(含右側(cè)LoxP位點的alcA-mini35SCreNos_TLoxP表達載體)。重組質(zhì)粒pAC中，含有alcA-mini35S嵌合啟動子，Cre重組酶編碼基因和Nos終止子丙組成的表達盒丙和右側(cè)LoxP位點。五、重組質(zhì)粒pBBB_LB:LoxP的構(gòu)建植物表達載體pBBBH的LB與選擇標記Bar基因表達框間有一個ClaI酶切位點，表達框外側(cè)靠近Nos終止子的多克隆位點為EcoRI酶切位點。以植物表達載體pBBBH為模板，用上游引物L(fēng)oxP-35S5，(下劃線標注ClaI位點，方框標注LoxP位點)和下游引物35S-Bar-NOS3’(下劃線標注EcoRI位點)組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(LoxP35S_PBarNos_T片段)。LOXP-35S5:5’-CCATCGAT^TAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT,AAGCTAGAGATCCGTCAACATGGTGG-3‘；35S-Bar-Nos3':5，-GCAGGAATTCGATATCAAGCTAGAGATC-3’。PCR擴增體系同步驟1。PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min；94°C30s、62°C40s,72°C120s,35個循環(huán)；72°C延伸lOmin。電泳去除剩余引物，回收PCR擴增產(chǎn)物。用限制性內(nèi)切酶ClaI和EcoRI雙酶切PCR擴增產(chǎn)物得到酶切產(chǎn)物。用限制性內(nèi)切酶ClaI和EcoRI雙酶切植物表達載體pBBBH，回收載體骨架(約5109bp)。將所述酶切產(chǎn)物和所述載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pBBB-LBLoxP(在pBBBH的LB35S啟動子之間添加了LoxP位點)。重組質(zhì)粒pBBB-LB:LoxP的結(jié)構(gòu)示意圖見圖1B。六、重組質(zhì)粒ρΒΒΒ-GRA的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶EocRI酶切重組質(zhì)粒pUGRA，回收約^OObp的G1(1_9(1:AlcR:35S_T片段。用限制性內(nèi)切酶EocRI酶切重組質(zhì)粒pBBB-LB:LoXP，回收載體骨架(約6448bp)。將所述Gich9ci:AlcR:35S_T片段和所述載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pBBB-GRA。重組質(zhì)粒pBBB-GRA的結(jié)構(gòu)示意圖見圖1C。七、重組質(zhì)粒pBBB-GRA-Cre/LoxP的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶HindiII和SpeI雙酶切重組質(zhì)粒pAC，回收約2000bp的alcA-mini35S:Cre:Nos_T:LoxP片段。用限制性內(nèi)切酶HindIII和SpeI雙酶重組質(zhì)粒pBBB-GRA,回收載體骨架(約9274bp)。將所述alcA_mini35S:Cre:Nos_T:LoxP片段和所述載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pBBB-GRA-Cre/LoxP。重組質(zhì)粒pBBB-GRA-Cre/LoxP的結(jié)構(gòu)示意圖見圖1D。重組質(zhì)粒pBBB-GRA-Cre/LoxP就是在載體pBBRlMCS_2的kpl酶切位點之間插入序列表的序列1所示DNA得到的重組質(zhì)粒。序列表的序列1中，自5’末端第1-84位核苷酸為T-DNA的左邊界(LB)，自5，末端第85-90位核苷酸為ClaI位點，第91-1M位核苷酸為LoxP位點，第125-576位核苷酸為35S啟動子甲，第577-11位核苷酸為Bar基因，第1129-1422位核苷酸為Nos終止子甲，第1423-14位核苷酸為EcoRI位點，第1429-1574位核苷酸為Gichxi啟動子，第1575-4040位核苷酸為AlcR基因，第4041-4M9位核苷酸為35S終止子，第4250-4255位核苷酸為EcoRI位點，第4262-4267位核苷酸為HindIII位點，第4268-4568位核苷酸為alcA_mini35S嵌合啟動子，第4569-5770位核苷酸為Cre重組酶編碼基因(第5003-5172位核苷酸為內(nèi)含子)，第5771-6201位核苷酸為Nos終止子丙，第6202-6235位核苷酸為LoxP位點，第6236-6M1位核苷酸為kaI位點，第6242-6247位核苷酸為SpeI位點，第6248-6452位核苷酸為T-DNA的右邊界(RB)。重組質(zhì)粒pBBB-GRA-Cre/LoxP含有兩個同向LoxP位點，LoxP位點間包含Bar基因表達盒(表達盒甲，組成型表達Bar基因)、AlcR轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的表達盒(表達盒乙，組成型表達，但只有在有乙醇的條件下才能得到活性AlcR轉(zhuǎn)錄因子)、受AlcR轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的Cre基因表達盒(表達盒丙，受活性AlcR轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)表達)。重組質(zhì)粒pBBB-GRA_Cre/LoxP是一種基于乙醇誘導(dǎo)，位點專一重組識別標記基因刪除系統(tǒng)。八、重組質(zhì)粒pBBB-GRA-Cre/LoxP-GUS的構(gòu)建1、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII雙酶切載體pBI121，回收約3033bp的35S:GUS:Nos片段。用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII雙酶切載體pBluescriptIIKS+,回收載體骨架(約^49bp)。將所述35S:⑶S:Nos片段和所述載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pBSK-GUS。2、用限制性內(nèi)切酶kal和SpeI雙酶切重組質(zhì)粒pBSK_GUS，回收約^OObp的35S⑶SNos片段(表達盒丁)。用限制性內(nèi)切酶kaI和SpeI雙酶切重組質(zhì)粒pBBB-GRA-Cre/LoxP,回收載體骨架(約11300bp)。將所述35S:⑶S:Nos片段和所述載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pBBB-GRA-Cre/LoxP-GUS。重組質(zhì)粒pBBB-GRA-Cre/LoxP-GUS的結(jié)構(gòu)示意圖見圖1E。重組質(zhì)粒pBBB-GRA-Cre/LoxP-GUS的報告基因為⑶S基因，⑶S基因表達框位于LoxP位點外側(cè)，當(dāng)選擇標記Bar基因表達框及整套誘導(dǎo)系統(tǒng)被刪除后，做為目的基因⑶S仍將保留并表達。重組質(zhì)粒pBBB-GRA-Cre/LoxP-GUS中，自上游至下游依次具有如下元件T_DNA的左邊界(LB),LoxP位點、表達盒甲、表達盒乙、表達盒丙、LoxP位點、表達盒丁和T-DNA的右邊界(RB)。表達盒甲包括35S啟動子甲(組成型啟動子)、Bar基因(篩選基因)、Nos終止子甲。表達盒乙包括Gich9ci啟動子、AlcR基因、35S終止子。表達盒丙包括alcA-mini35S嵌合啟動子、Cre重組酶編碼基因、Nos終止子丙。表達盒丁包括35S啟動子丁、GUS基因和Nos終止子丁。重組質(zhì)粒pBBB-GRA-Cre/LoxP-GUS中，在重組質(zhì)粒pBBB-GRA-Cre/LoxP的kal和SpeI位點之間插入了序列表的序列4所示的DNA。序列表的序列4中，自5’末端第1-662位核苷酸為35S啟動子丁，第663-M74位核苷酸為⑶S基因，第M75-2799位核苷酸為Nos終止子丁，第觀00-2805位核苷酸為EcoRI位點。重組質(zhì)粒pBBB-GRA-Cre/LoxP-GUS導(dǎo)入出發(fā)植物后得到轉(zhuǎn)基因植物，轉(zhuǎn)基因植株誘導(dǎo)前刪除系統(tǒng)不表達，當(dāng)施加乙醇時，由活性的AlcR轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到alcA-mini35S嵌合啟動子上激活Cre基因的表達，Cre重組酶識別2個同向IoxP位點，剔除位點之間的DNA片段(包括選擇標記基因表達框、AlcR/alcA系統(tǒng)和Cre/loxP系統(tǒng))，而目的基因⑶S將始終表達(參見圖2)。實施例2、轉(zhuǎn)基因植物的獲得和鑒定一、抗性植株的獲得用重組質(zhì)粒pBBB-GRA-Cre/LoxP-GUS轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101pMP90，得到重組農(nóng)桿菌。將重組農(nóng)桿菌通過花序浸漬法(StevenJ.CloughandAndrewF.Bent.Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.ThePlantJournal.1998,16(6):735-743.)1Columbia^L態(tài)型擬南芥。收獲的種子即為Ttl代種子；Ttl代種子發(fā)芽后噴灑0.1%-0.2%Basta除草劑2_3次，非轉(zhuǎn)基因苗不能繼續(xù)生長，逐漸枯黃死亡，轉(zhuǎn)基因苗長勢茁壯，葉片保持綠色。Tl代苗自交留種，得到T2代種子；T2代種子發(fā)芽后噴灑0.1%-0.2%Basta除草劑2_3次；T2代幼苗存活/死亡約為31的初步確定其Tl代為單拷貝植株，并單株自交留種。種子播于盛有營養(yǎng)土的苗盤中。播種的種子和幼苗的培養(yǎng)在人工氣候室進行培養(yǎng)；培養(yǎng)條件溫度為220C(晝)/18°C(夜)，光周期為16h(光)/8h(暗)。共獲得103個T1代抗性植株(單拷貝植株)。二、T1代抗性植株的鑒定1、Bar基因表達框的鑒定隨機抽取M個T1代抗性植株單株提取基因組DNA，用LoxP-35S5，和35S-Bar-N0s3’組成的引物對進行PCR擴增，靶序列為Bar基因表達框(約1300bp)。M個單株全部為陽性結(jié)果。2、Cre表達框的鑒定將步驟1為陽性的M個單株分別提取基因組DNA，用alcA5，和N0SL0XP3，組成的引物對進行PCR擴增，靶序列為Cre表達框(約2000bp)。設(shè)置Columbia生態(tài)型擬南芥作為陰性對照。設(shè)置水作為模板的空白對照。設(shè)置重組質(zhì)粒pBBB-GRA-Cre/LoxP-GUS為陽性對照。反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min；94°C30s、67°C40s,72°C150s，；35個循環(huán)；72°C延伸IOmin0PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。19個單株為陽性結(jié)果，擴增出與陽性對照一致的條帶，符合預(yù)期大小01Λ)。野生株或空白對照則不能擴增出相應(yīng)條帶(圖3)。部分結(jié)果見圖3。3、alcR基因的鑒定將步驟2為陽性的19個單株(以Columbia生態(tài)型擬南芥作為對照)分別采用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。將步驟2為陽性的19個單株分別提取基因組DNA。以TOR基因(Atlg50030)的FRB區(qū)段為內(nèi)參，檢測cDNA翻轉(zhuǎn)是否成功及有無基因組DNA污染。用FRB5，和FRB3，組成的弓|物對進行PCR鑒定，以cDNA為模板應(yīng)擴增出300bp條帶，以基因組DNA為模板應(yīng)擴增出700bp條帶。FRB5，5，-AGGGTTGCCATACTTTGGCATG-3，；FRB3，5，-TGGCTAGCTGTTTGTCAATCCG-3，。結(jié)果表明所有cDNA均沒有基因組DNA污染。部分樣本的電泳圖見圖4。分別以cDNA和基因組DNA為模板，用alcR-5，和alcR-3，組成的引物對進行PCR鑒定，靶序列為alcR基因片段(約600bp)。以重組質(zhì)粒pBBB-GRA-Cre/LoxP-GUS為陽性對照，以水為空白對照。alcR-5，5，-CGACGCCAGAATCATAGC-3，；alcR-3，5，-CCATCTTGAGCGACCTGTTG-3，。反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min；94°C30s、50°C40s、72°C40s,35個循環(huán)；72°C延伸IOmin0PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。以cDNA為模板，19株單株均得到與陽性對照一致的625bp條帶，野生株和空白對照不能擴增出相應(yīng)條帶，證明alcR基因是組成型表達。部分樣本的電泳圖見圖5。4、表型鑒定在沒有加入Basta除草劑的正常環(huán)境中培養(yǎng)步驟2為陽性的19個單株和Columbia生態(tài)型擬南芥，19株單株和野生株相比生長正常，表明alcR基因組成型表達對擬南芥生長無影響。5、⑶S組織化學(xué)染色分別將步驟2為陽性的19個單株的葉片為材料，進行GUS組織化學(xué)染色(JeffersonRA,KavanaghΤΑ,BevanMW.GUSfusionsβ-glucuronidaseasasensitiveandversatilegenefusionmarkerinhigherplants.EMBOJ，1987，6:3901-3907.)。以Columbia生態(tài)型擬南芥作為陰性對照。結(jié)果表明19個單株均呈藍色，⑶S表達活性很強；而野生型未觀察到藍色。部分結(jié)果見圖6。三、T3代轉(zhuǎn)基因植株的鑒定1、T3代轉(zhuǎn)基因植株的獲得分別將步驟二的2鑒定為陽性的19個1\代單株中連續(xù)自交，得到19個純合的轉(zhuǎn)基因純合株系，將各個轉(zhuǎn)基因株系的T3代轉(zhuǎn)基因植株進行步驟三的鑒定。2、乙醇誘導(dǎo)表達前后Cre基因的檢測(1)乙醇誘導(dǎo)表達分別將19個純合的轉(zhuǎn)基因純合株系的T3代轉(zhuǎn)基因植株(種子)和Columbia生態(tài)型擬南芥(種子)進行如下兩組處理第一組點播于9cm培養(yǎng)皿(內(nèi)含1/2MS培養(yǎng)基)上，約25粒種子，均勻滴加2_3滴無水乙醇(總約10-15ul)；第二組點播于9cm培養(yǎng)皿(內(nèi)含1/2MS培養(yǎng)基)上，約25粒種子，不滴加無水乙醇。(2)Cre基因的檢測7天后將種子萌發(fā)的小苗進行Cre基因的檢測。分別采用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。分別提取基因組DNA。分別以cDNA和基因組DNA為模板，用cre5，和ere3，組成的引物對進行PCR鑒定，靶序列為Cre基因。以TOR基因FRB區(qū)段為內(nèi)參，檢測cDNA反轉(zhuǎn)錄是否成功，及有無基因組DNA污染(同步驟二的3)。以水為空白對照。cre5':5，-ATGTCCAATTTACTGACCGTACA-3，；ere3，5，-CTAATCGCCATCTTCCAGCA-3，。本發(fā)明構(gòu)建質(zhì)粒時，Cre重組酶的編碼基因中插入了一個170bp的擬南芥K0RRIGAN(KOR)基因第5內(nèi)含子，所以以基因組DNA為模板，產(chǎn)物應(yīng)為1202bp，以cDNA為模板，產(chǎn)物應(yīng)為1032bp。反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min；94°C30s、55°C30s、72°C90s,35個循環(huán)；72°C延伸IOmin0PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。FRB區(qū)段的檢測結(jié)果所有cDNA均沒有基因組DNA污染。部分樣本的電泳圖見圖7。FRB區(qū)段在乙醇誘導(dǎo)前后沒有差異。Cre基因的檢測結(jié)果乙醇誘導(dǎo)后，各轉(zhuǎn)基因植株的cDNA均能擴增出符合預(yù)期大小的1032bp條帶，野生株的cDNA沒有得到相應(yīng)條帶；說明誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)基因植株Cre基因表達，野生型沒有表達。1032bp條帶大小說明PCR檢測的模板來源于cDNA，而非基因組DNA。乙醇誘導(dǎo)前，各轉(zhuǎn)基因植株和野生株的cDNA均不能擴增出符合預(yù)期大小的1032bp條帶；說明誘導(dǎo)前轉(zhuǎn)基因植株和野生型均沒有Cre基因表達。乙醇誘導(dǎo)前，各轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA均能擴增出1202bp條帶，野生株的的基因組DNA沒有得到相應(yīng)條帶，說明Cre基因已經(jīng)整合到轉(zhuǎn)基因植株的基因組，1202bp條帶大小說明PCR檢測的模板來源于基因組DNA，與cDNA模板有差異。部分結(jié)果見圖8。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株的Cre基因是受AlcR蛋白調(diào)控的誘導(dǎo)型表達，由乙醇嚴格控制“開”和“關(guān)”；并且Cre基因中的KOR內(nèi)含子能在擬南芥RNA轉(zhuǎn)錄中正常剪切，加工成正確的mRNA。3、刪除效果的表觀檢測(1)乙醇誘導(dǎo)表達從19個純合的轉(zhuǎn)基因純合株系中隨機選取5個株系。分別將5個株系的T3代轉(zhuǎn)基因植株(種子)和Columbia生態(tài)型擬南芥(種子)進行如下兩組處理第一組點播于9cm培養(yǎng)皿(內(nèi)含1/2MS培養(yǎng)基和草銨膦，草銨膦的濃度為50mg/L)上，約25粒種子，均勻滴加2-3滴無水乙醇(總約10-15ul)；第二組點播于9cm培養(yǎng)皿(內(nèi)含1/2MS培養(yǎng)基和草銨膦，草銨膦的濃度為50mg/L)上，約25粒種子。(2)表型觀察第一組和第二組的野生株均在長出2片子葉后陸續(xù)變黃死亡。在經(jīng)乙醇誘導(dǎo)后，5個株系的轉(zhuǎn)基因植株(第一組)仍能繼續(xù)長出綠色真葉，但隨著誘導(dǎo)時間的持續(xù)延長，轉(zhuǎn)化株停止生長，葉片失綠，逐漸死亡。未經(jīng)乙醇誘導(dǎo)的5個株系的轉(zhuǎn)基因植株(第二組)可以持續(xù)生長。處理30天各株系部分植株的照片見圖9。4、刪除效果的分子檢測轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pBBB-GRA-Cre/LoxP-GUS的擬南芥，誘導(dǎo)前T-DNA左邊界附近序列是LB-loXP-35S-Bar，乙醇誘導(dǎo)后刪除兩個IoxP位點間之間的DNA片段(包括選擇標記基因、AlcR/alcA系統(tǒng)和Cre/loxP系統(tǒng))，而留下一個IoxP位點和目的基因GUS表達框，因此左邊界附近序列應(yīng)是LB-loxP-35S-GUS。為在分子水平上檢測乙醇誘導(dǎo)刪除效果，設(shè)計引物進行PCR擴增檢測。在LB區(qū)段內(nèi)設(shè)計上游引物L(fēng)B-loxP5’，在⑶S基因區(qū)段內(nèi)設(shè)計下游引物35S-gus3，，經(jīng)乙醇誘導(dǎo)后，提取基因組DNA進行PCR檢測，應(yīng)擴增出約94^p的片段。LB-loxP5，5，-GTAAAAATGAGGGCAATCG-3，；35S-gus3，5，-AAAGACTTCGCGCTGATACCA-3，。(1)乙醇誘導(dǎo)表達從19個純合的轉(zhuǎn)基因純合株系中隨機選取2個株系。分別將2個株系的T3代轉(zhuǎn)基因植株(種子)和Columbia生態(tài)型擬南芥(種子)進行如下處理點播于9cm培養(yǎng)皿(內(nèi)含1/2MS培養(yǎng)基和草銨膦，草銨膦的濃度為50mg/L)上，約25粒種子，均勻滴加2_3滴無水乙醇(總約10_15ul)。O)PCR鑒定處理17天后，提取小苗的基因組DNA為模板，用LB-loxP5，和35S-gus3，組成的引物對進行PCR擴增。以水為空白對照。PCR擴增的反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min；94°C30s、49°C30s、72°C60s,35個循環(huán)；72°C延伸IOmin0PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。經(jīng)乙醇誘導(dǎo)后，5個株系的轉(zhuǎn)基因植株均擴增出約9^bp的片段，野生型擬南芥或空白對照則不能擴增出相應(yīng)條帶。部分結(jié)果見圖10。(3)測序鑒定將步驟O)的PCR擴增產(chǎn)物進行測序，5個株系的轉(zhuǎn)基因植株的測序結(jié)果一致，均如序列表的序列5所示。結(jié)果表明，乙醇誘導(dǎo)后，刪除了兩個IoxP位點之間的DNA片段。權(quán)利要求1.一種培育無篩選基因的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟(1)用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化出發(fā)植物，通過所述篩選基因篩選得到同時含有所述篩選基因和所述外源目的基因的轉(zhuǎn)基因植物；所述重組質(zhì)粒包括特異DNA片段甲和特異DNA片段乙；所述特異DNA片段甲和所述特異DNA片段乙沒有重疊區(qū)域；所述DNA片段甲的兩端各具有一個同向的LoxP位點，兩個LoxP位點間包括表達盒甲、表達盒乙和表達盒丙；所述表達盒甲為篩選基因的表達盒，所述篩選基因為組成型表達；所述表達盒乙為AlcR轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因的表達盒，所述AlcR轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因為組成型表達；所述表達盒丙為Cre重組酶的編碼基因的表達盒，所述Cre重組酶的編碼基因由alCA-mini35S嵌合啟動子啟動表達；所述表達盒丙位于所述表達盒甲和所述表達盒乙的下游；所述AlcR轉(zhuǎn)錄因子為序列表的序列2所示的蛋白質(zhì)；所述Cre重組酶為序列表的序列3所示的蛋白質(zhì)；所述alCA-mini35S嵌合啟動子如序列表的序列1自5’末端第4268-4568位核苷酸所示；所述特異DNA片段乙含有表達盒?。凰霰磉_盒丁為外源目的基因的表達盒；(2)將步驟(1)得到的轉(zhuǎn)基因植物在施加乙醇的條件下培養(yǎng)，得到含有所述外源目的基因且不含有所述篩選基因的目的轉(zhuǎn)基因植物。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述LoxP位點如序列表的序列1自5’末端第91-1M位核苷酸所示；所述AlcR轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因如序列表的序列1自5’末端第1575-4040位核苷酸所示；所述Cre重組酶的編碼基因如序列表的序列1自5’末端第4569-5770位核苷酸所示。3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述表達盒乙中，所述AlcR轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因由Gltl,啟動子啟動表達，由35S終止子終止表達；所述表達盒丙中，所述Cre重組酶編碼基因由Nos終止子丙終止表達；所述Gichxi啟動子如序列表的序列1自5’末端第14四-1574位核苷酸所示；所述35S終止子如序列表的序列1自5’末端第4041-4249位核苷酸所示；所述Nos終止子丙如序列表的序列1自5，末端第5771-6201位核苷酸所示。4.如權(quán)利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于所述表達盒甲中，所述篩選基因由35S啟動子甲啟動表達，由Nos終止子甲終止表達；所述35S啟動子甲如序列表的序列1自5’末端第125-576位核苷酸所示；所述Nos終止子甲如序列表的序列1自5’末端第1U9-1422位核苷酸所示；所述篩選基因優(yōu)選為序列表的序列1自5’末端第577-11位核苷酸所示的Bar基因。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述特異DNA片段甲如序列表的序列1自5’末端第91-6235位核苷酸所示。6.雙鏈DNA片段，包括兩個同向的LoxP位點以及位于兩個所述LoxP位點間的表達盒甲、表達盒乙和表達盒丙；所述表達盒甲為篩選基因的表達盒，所述篩選基因為組成型表達；所述表達盒乙為AlcR轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因的表達盒，所述AlcR轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因為組成型表達；所述表達盒丙為Cre重組酶的編碼基因的表達盒，所述Cre重組酶的編碼基因由alCA-mini35S嵌合啟動子啟動表達；所述表達盒丙位于所述表達盒甲和所述表達盒乙的下游；所述AlcR轉(zhuǎn)錄因子為序列表的序列2所示的蛋白質(zhì)；所述Cre重組酶為序列表的序列3所示的蛋白質(zhì)；所述alCA-mini35S嵌合啟動子如序列表的序列1自5’末端第4268-4568位核苷酸所示。7.如權(quán)利要求6所述的雙鏈DNA片段，其特征在于所述表達盒甲中，所述篩選基因由35S啟動子甲啟動表達，由Nos終止子甲終止表達；所述表達盒乙中，所述AlcR轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因由Gltl,啟動子啟動表達，由35S終止子終止表達；所述表達盒丙中，所述Cre重組酶編碼基因由Nos終止子丙終止表達；所述LoxP位點如序列表的序列1自5’末端第91-1位核苷酸所示；所述AlcR轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因如序列表的序列1自5’末端第1575-4040位核苷酸所示；所述Cre重組酶的編碼基因如序列表的序列1自5’末端第4569-5770位核苷酸所示；所述Gichxi啟動子如序列表的序列1自5’末端第14四-1574位核苷酸所示；所述35S終止子如序列表的序列1自5’末端第4041-4249位核苷酸所示；所述Nos終止子丙如序列表的序列1自5’末端第5771-6201位核苷酸所示；所述35S啟動子甲如序列表的序列1自5’末端第125-576位核苷酸所示；所述Nos終止子甲如序列表的序列1自5’末端第1129-1422位核苷酸所示；所述雙鏈DNA片段優(yōu)選為序列表的序列1自5，末端第91-6235位核苷酸所示的DNA，最優(yōu)選為序列表的序列1所示的DNA。8.含有權(quán)利要求6或7所述雙鏈DNA片段的重組表達載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因細胞系。9.如權(quán)利要求8所述的重組質(zhì)粒，其特征在于所述重組表達載體為在質(zhì)粒pBBRlMCS-2的kpl酶切位點之間插入序列表的序列1所示DNA得到的重組質(zhì)粒。10.權(quán)利要求6或7所述雙鏈DNA片段，或權(quán)利要求8或9所述重組質(zhì)粒在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種基于AlcR/alcA和Cre/loxP系統(tǒng)的標記基因誘導(dǎo)刪除體系。本發(fā)明提供了一種將選擇標記基因通過誘導(dǎo)予以刪除，培育無標記轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟(1)用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化出發(fā)植物，通過所述篩選基因篩選得到同時含有所述篩選基因和所述外源目的基因的轉(zhuǎn)基因植物；重組質(zhì)粒包括特異DNA片段甲和特異DNA片段乙；特異DNA片段乙含有外源目的基因的表達盒；DNA片段甲中將Cre基因置于alcA-min35S嵌合啟動子下游，誘導(dǎo)前Cre基因不表達，不發(fā)生刪除，乙醇存在時，轉(zhuǎn)錄因子AlcR構(gòu)象改變，結(jié)合到alcA-min35S上，激活下游Cre基因的表達，Cre重組酶識別2個同向loxP位點，剔除位點之間的DNA片段。本發(fā)明可以解決因標記基因可能產(chǎn)生的潛在安全性隱患。文檔編號A01H5/00GK102181463SQ20111004613公開日2011年9月14日申請日期2011年2月25日優(yōu)先權(quán)日2011年2月25日發(fā)明者姚磊,謝華,趙亮,趙青,馬榮才申請人:北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心