專利名稱：垃圾堆肥微生物菌劑在提高草坪草抗鹽性方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，涉及以城市生活垃圾堆肥中提取出的有益菌種為原料，配制高效堆肥復(fù)合菌劑。更具體的說(shuō)是堆肥復(fù)合微生物菌劑在提高草坪植物抗鹽性方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
堆肥化(composting)是利用自然界廣泛存在的微生物(細(xì)菌、放線菌、真菌等) 或商業(yè)菌株，有控制地促進(jìn)可被生物降解的有機(jī)物向穩(wěn)定的腐殖質(zhì)〔humicsubstance，HS) 轉(zhuǎn)化的生物化學(xué)過(guò)程。這一過(guò)程也是地球表面生態(tài)過(guò)程的一部分，它參與地球表面的物質(zhì)和能量循環(huán)。在人為控制條件下，通過(guò)堆肥化可以將固體廢物中的有機(jī)物轉(zhuǎn)化成為有機(jī)肥料一堆肥(compost)，這種有機(jī)肥料作為堆肥化的最終產(chǎn)物，不僅性能穩(wěn)定，并且對(duì)環(huán)境的危害甚小。因此，堆肥化是固體廢物，尤其是城市生活垃圾無(wú)害化、穩(wěn)定化和資源化的有效途徑之一。堆肥化發(fā)展至今，已經(jīng)歷了漫長(zhǎng)的歷史，對(duì)其產(chǎn)生和發(fā)展的歷史過(guò)程進(jìn)行回顧和分析，可為今后開發(fā)新的堆肥工藝技術(shù)提供理論和實(shí)踐上的借鑒和幫助。陳世和等(1989)采用垃圾培養(yǎng)基，在城市生活垃圾堆肥處理過(guò)程中，溫度達(dá) 45°C和55°C時(shí)，對(duì)堆肥菌株進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)在45°C時(shí)曲霉菌[Aspergillus]、芽孢桿菌屬[Bacillus]、假單孢菌屬[Pseudomonas]禾Π 芽孢乳桿菌屬[Sporolactobaci Ilus] 等是堆肥中的優(yōu)勢(shì)菌群。而到55°C時(shí)則有所不同，除了芽孢桿菌屬[Bacillus]和假單孢菌屬[Pseudomonas]仍然為優(yōu)勢(shì)菌群外，乳酸桿菌屬[Lactobacillus]、鏈球菌屬 [Streptococcus]和小單孢菌[Micromonospora]屬則成為新的優(yōu)勢(shì)菌群，替代了其它種微生物，表明在堆肥化過(guò)程中，微生物種群處在一個(gè)不斷變化的動(dòng)態(tài)平衡之中。從城市生活垃圾中分離出大量參與高溫好氧堆肥的微生物，經(jīng)鑒定分別為芽孢桿菌屬、假單孢菌屬，乳酸桿菌屬、葡萄球菌屬、埃希氏菌屬等5屬細(xì)菌；曲霉屬，毛霉屬、紅曲霉屬，青霉屬、地霉屬、霉屬、脈孢苗屬、頭孢霉屬等8屬霉菌；鏈霉菌屬1屬放線菌；酵母菌屬，裂殖酵母菌等2屬酵母菌。該研究結(jié)果有力地促進(jìn)了對(duì)垃圾堆肥中微生物的研究和利用。Hassen (2001)對(duì)城市垃圾堆肥過(guò)程誒生物變化的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，分解有機(jī)物產(chǎn)生的高溫引起微生物群落的重要變化，使致病菌、酵母菌及中溫菌大量減少，而產(chǎn)芽孢的桿菌大量存在，在堆肥過(guò)程中，高溫階段初期和中文階段細(xì)菌均占主要地位。馬文漪等也報(bào)道了嗜熱真菌，嗜熱褐色放線菌等參與垃圾堆肥的微生物種群。從城市生活垃圾中有機(jī)物的組成來(lái)看，而被微生物所分解利用。但各種微生物對(duì)各種物質(zhì)的分解能力和分解速度是不盡相同的，不同溫度下(中溫、高溫)堆肥過(guò)程中出現(xiàn)的微生物種群和數(shù)量上亦截然不同。近期的相關(guān)文獻(xiàn)及實(shí)際生產(chǎn)表明目前如何提高城市生活垃圾堆肥處理的技術(shù)水平、提高處理效率、改善產(chǎn)品質(zhì)量，一直是相關(guān)科研人員所重點(diǎn)關(guān)注的研究?jī)?nèi)容；在堆肥物料中針對(duì)特定物質(zhì)有目的的添加一些人工微生物制劑，已經(jīng)被很多研究所證實(shí)是可以加快堆肥腐熟，提高堆肥效率的方法。考慮到在很多研究和生產(chǎn)實(shí)踐中，合理配比的復(fù)合菌劑往往較單一菌株更具好的效果，于是如何將堆肥中提取和篩選出來(lái)的各種功能菌株結(jié)合起來(lái)開發(fā)高效堆肥復(fù)合菌劑，從根本上優(yōu)化和合理配制使用城市垃圾堆肥基質(zhì)便成了相關(guān)科研人員研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。盡管植物接種微生物的效應(yīng)研究報(bào)道較多，但大部分研究工作涉及的微生物菌劑只限于從土壤中提取。生活垃圾堆肥化是利用自然界廣泛存在的微生物(細(xì)菌、放線菌、真菌等)或商業(yè)菌株，有控制地促進(jìn)可被生物降解的有機(jī)物向穩(wěn)定腐殖質(zhì)轉(zhuǎn)化的生物化學(xué)過(guò)程，是由群落結(jié)構(gòu)演替非常迅速的多個(gè)微生物群體共同作用而實(shí)現(xiàn)有機(jī)廢棄物資源化、無(wú)害化的動(dòng)態(tài)過(guò)程。研究表明，單一的細(xì)菌、真菌、放線菌群體，無(wú)論其活性多高，在加快堆肥化進(jìn)程中的作用都比不上復(fù)合微生物菌群的共同作用。Ros和PSrez-Piqueres等人研究了接種外源微生物復(fù)合菌劑對(duì)堆肥化過(guò)程中微生物的影響，有利于了解堆肥過(guò)程的生物化學(xué)過(guò)程及加入微生物制劑對(duì)堆肥的影響。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)堆肥過(guò)程中的微生物現(xiàn)象進(jìn)行了一系列理論和實(shí)踐研究，Vaz-Moreira等人對(duì)堆肥中細(xì)菌的群落多樣性進(jìn)行分析，以期深入認(rèn)識(shí)堆肥過(guò)程的本質(zhì)，為堆肥技術(shù)和工藝的研究提供理論基礎(chǔ)。但在復(fù)合微生物菌劑研究過(guò)程中，有關(guān)堆肥內(nèi)部微生物種類的鑒定和分類，堆肥菌種之間共生及相互影響關(guān)系具有模糊性和復(fù)雜性，以及將堆肥微生物菌劑應(yīng)用于正常條件下對(duì)植物生長(zhǎng)的影響方面，相關(guān)研究也鮮為報(bào)道。而有關(guān)堆肥內(nèi)部微生物種類的鑒定和分類，堆肥菌種之間共生及相互影響關(guān)系具有模糊性和復(fù)雜性，以及從城市生活垃圾堆肥中提取篩選和配制堆肥復(fù)合有益微生物菌劑，對(duì)鹽脅迫下草坪植物生長(zhǎng)、生理特性的影響方面的研究還未見報(bào)道
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明將配制成不同濃度的城市生活垃圾堆肥復(fù)合微生物菌劑接種到草坪建植體系中。試驗(yàn)輕度、中度和重度鹽脅迫處理下進(jìn)行，通過(guò)研究不同濃度的復(fù)合微生物菌劑對(duì)黑麥草和高羊茅生理生態(tài)特性的影響，目的是為篩選優(yōu)良抗鹽堆肥復(fù)合微生物菌劑，提高草坪植物抗鹽性，促進(jìn)鹽脅迫環(huán)境草坪植物的建植提供依據(jù)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案
城市生活垃圾堆肥復(fù)合微生物菌劑在提高草坪植物抗鹽性方面的應(yīng)用，其中的復(fù)合微生物菌劑為稀釋100-200倍的體積比為枯草芽孢桿菌放線菌酵母菌=1 1 1的3菌種組成；所述的鹽指的是0. 3%-0. 9%NaCl鹽堿土。本發(fā)明所述的應(yīng)用，其中的草坪植物為黑麥草或高羊茅。本發(fā)明所述的應(yīng)用，其中所述的抗鹽性指的是堆肥微生物菌劑在促進(jìn)黑麥草光合速率、緩解鹽脅迫造成的葉綠素含量下降方面的應(yīng)用；所述的復(fù)合微生物菌劑為稀釋 100倍的體積比為枯草芽孢桿菌放線菌酵母菌=1 :1 :1的3菌種組成。本發(fā)明所述的應(yīng)用，其中所述的抗鹽性指的是堆肥微生物菌劑在增強(qiáng)植物根系抵抗鹽脅迫方面的應(yīng)用；所述的鹽指的是0. 3%-0. 9%NaCl鹽堿土。本發(fā)明所述的應(yīng)用，其中所述的抗鹽性指的是堆肥微生物菌劑在增加高羊茅葉綠素含量方面的應(yīng)用；其中的復(fù)合微生物菌劑為稀釋200倍的體積比為枯草芽孢桿菌放線菌酵母菌=1 :1 :1的3菌種組成。
具體實(shí)施方式
為了更充分的解釋本發(fā)明的實(shí)施，提供下述制備方法實(shí)施實(shí)例。這些實(shí)施實(shí)例僅僅是解釋、而不是限制本發(fā)明的范圍。其中草芽孢桿菌、放線菌、酵母菌均由市售，也可以根據(jù)實(shí)施例1的方法加以配制。實(shí)施例1 1、菌株的篩選
①富集將采集的堆肥樣品稱取10 g置于無(wú)菌三角瓶中，加入100 ml無(wú)菌水和玻璃珠振蕩均勻后，取10 ml懸浮液于盛有100 ml富集培養(yǎng)基的三角瓶中，在28°C，220 r / min 下振蕩培養(yǎng)3-5天。②初篩將富集后的培養(yǎng)液進(jìn)行濃度梯度稀釋后，涂布于分離篩選培養(yǎng)基上，倒置恒溫培養(yǎng)，觀察透明圈的大小，選取透明圈/菌落直徑比值較大菌落的菌株進(jìn)行復(fù)篩。③生長(zhǎng)曲線的繪制將初篩得到的枯草芽孢桿菌和酵母菌接種到相應(yīng)搖瓶培養(yǎng)基中， 分別在37°C和28°C，220 r / min的條件下培養(yǎng)，并分別以波長(zhǎng)600 nm和560 nm下的OD 值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制菌株的生長(zhǎng)曲線。2、復(fù)合微生物菌劑制備
菌種培養(yǎng)將篩選的枯草芽孢桿菌、放線菌、酵母菌在相應(yīng)的培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)，具體步驟①用無(wú)菌生理鹽水洗滌保存斜面，至無(wú)菌三角瓶中搖勻即成菌懸液；②接種斜面培養(yǎng)物于種子瓶，枯草芽孢桿菌在3(TC，180r / min培養(yǎng)12 h得到種子液，放線菌和酵母菌在28 °C, 220 r / min培養(yǎng)48 h得到種子液；③濃度10%的種子液接種到發(fā)酵瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)48 h得到發(fā)酵液，復(fù)合微生物菌液按以下處理進(jìn)行配制(葉峰等，2009)。實(shí)施例2 復(fù)合微生物菌劑應(yīng)用
采用單因素隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，受限因素分別為①鹽脅迫，三個(gè)鹽脅迫處理水平；輕度(0. 3%NaCl) =T1,中度(0. 6%NaCl) =T2和重度(0. 9%NaCl)鹽堿土 T3。②不同濃度的復(fù)合微生物菌劑應(yīng)用，在此鹽脅迫條件下設(shè)定處理方式處理1為對(duì)照，不接種菌劑(CK)；處理 2加入100倍稀釋液的菌劑(CM1)；處理3加入200倍稀釋液的菌劑(CM2)；處理4加入300 倍稀釋液菌劑(CM3)。實(shí)施例3草坪建植
選用我國(guó)北方比較常見的多年生黑麥草Holium perenne L.)和高羊茅ifestuca arundinacea L.)為試驗(yàn)材料。供試草坪植物種子籽粒飽滿、大小均勻。所用土壤為天津師范大學(xué)院內(nèi)園土，其理化性質(zhì)為pH 7.44，飽和含水量0.58 ml/g,有機(jī)質(zhì)4. 68%，全氮 0. 21%,有效磷22. 03 mg/kg,全鉀45. 61g/kg。采集后，剔除植物殘根和石礫等雜物，過(guò)2 mm篩，在121°C下滅菌30 min，備用。實(shí)驗(yàn)采用盆栽的方法，每培養(yǎng)容器內(nèi)放置滅菌土壤 200 g，將0.4 g草坪種子播種其上。每天統(tǒng)一定量給水，以保持培養(yǎng)基質(zhì)有較好的水分狀況，經(jīng)常調(diào)換各培養(yǎng)容器位置，以保證光照一致。當(dāng)植株生長(zhǎng)高度達(dá)到2-3 cm時(shí)，加入不同濃度的堆肥復(fù)合微生物菌劑(CM)。各處理3次重復(fù)，實(shí)驗(yàn)在溫室植物培養(yǎng)臺(tái)上進(jìn)行，溫度為 2(T22°C，相對(duì)濕度為34%飛5%，光照為透入室內(nèi)的自然光。處理35天后進(jìn)行植物各指標(biāo)的測(cè)定。實(shí)施例4測(cè)定指標(biāo)
(1)天津鹽堿土中可溶性鹽濃度的測(cè)定可溶性鹽分析采用重量法分別稱取5 g樣品，放入50 mL燒杯中。在燒杯中放入25 mL無(wú)CO2蒸餾水，用玻璃棒攪拌3 min，取一已稱重的100 mL燒杯(W1),用已經(jīng)準(zhǔn)備好的過(guò)濾裝置過(guò)濾。放置的時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)可溶性鹽分的分析結(jié)果誤差越大，因此，過(guò)濾要盡量迅速并盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將已稱重的燒杯和濾液移置恒溫水浴鍋上，水浴蒸干。在蒸干中，若殘?jiān)庶S色(殘?jiān)写嬖谟袡C(jī)質(zhì))要用15%過(guò)氧化氫溶液除去有機(jī)質(zhì)(遵循少量多次原則，反復(fù)處理，直至殘?jiān)儼诪橹?。然后用濾紙擦干燒杯外壁，放入烘箱，在100-105°C條件下烘干約 3-4 h至恒重，稱量(W2)。蒸干時(shí)溫度不宜過(guò)高，以免濺失鹽分，在接近蒸干時(shí)，更要注意濺失，以免影響測(cè)定結(jié)果。結(jié)果計(jì)算
可溶性鹽=5.000 χφθ%
株高，采用厘米刻度尺每個(gè)培養(yǎng)皿隨機(jī)測(cè)5個(gè)株高。

地上和地下生物量的測(cè)定。葉綠素含量的測(cè)定采用分光光度法。即取0. 2g的草坪植物地上部分置于研缽中，加入少量石英砂、碳酸鈣和80%丙酮， 進(jìn)行充分研磨提取，將勻漿轉(zhuǎn)入15ml離心管中，并用適量80%丙酮洗滌缽體，一并轉(zhuǎn)入離心管中，離心后棄沉淀，取上清液轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，用80%丙酮定容至刻度線；以80%丙酮作為對(duì)照，用SHIMADZU產(chǎn)UV-1700型紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定在663nm、645nm波長(zhǎng)處的吸光度值。計(jì)算公式如下
Ca=12.7 OD663-2.69 OD645; Cb=22.9 OD645-4.68 OD663i
Ct= Ca + Cb =8.02 OD663 + 20.21 OD645； 式中，Ca為葉綠素a的濃度，Cb為葉綠素b的濃度，Ct為總?cè)~綠素濃度，單位為mg/g 干重。
葉綠色含畺計(jì)算公式(mg/g) = mmmmmxmmmmRxmmim
樣品鮮重(或干重〉(2)數(shù)據(jù)分析采用Microsoft Excel 2003和SPSS 11. 5軟件進(jìn)行處理。菌種篩選
初篩通過(guò)平板分離篩選，得到透明圈/菌落直徑比值較大且生長(zhǎng)較快的菌落。將所得的枯草芽孢桿菌、放線菌、酵母菌分別進(jìn)行劃線分離、編號(hào)并保藏于固體斜面培養(yǎng)基上。復(fù)篩通過(guò)測(cè)定枯草芽孢桿菌和酵母菌的生長(zhǎng)曲線，分析菌種生長(zhǎng)活性最高和繁殖能力最好時(shí)期為對(duì)數(shù)期，將此期的菌種提取出來(lái)，稀釋成不同濃度，用于草坪植物接種。 由表1和可以看出，所得微生物菌劑中富含枯草芽孢桿菌、放線菌和酵母菌，三菌種的菌落數(shù)在2. 44X 109-2· 47X IO9之間，枯草芽孢桿菌的OD600值為0. 545，酵母菌的OD560值為 0.567。
權(quán)利要求
1.城市生活垃圾堆肥堆肥復(fù)合微生物菌劑在提高草坪植物抗鹽性方面的應(yīng)用，其中的復(fù)合微生物菌劑為稀釋100-200倍的體積比為枯草芽孢桿菌放線菌酵母菌=1 :1 :1的3 個(gè)菌種組成；所述的鹽指的是0. 3%-0. 9%NaCl鹽堿土。
2.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中的草坪植物為黑麥草或高羊茅。
3.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述的抗鹽性指的是城市生活垃圾堆肥堆肥微生物菌劑在促進(jìn)黑麥草光合速率、緩解鹽脅迫造成的葉綠素含量下降方面的應(yīng)用；所述的復(fù)合微生物菌劑為稀釋100倍的體積比為枯草芽孢桿菌放線菌酵母菌=1 1 1的3個(gè)菌種組成。
4.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述的抗鹽性指的是堆肥微生物菌劑在增強(qiáng)植物根系抵抗鹽脅迫方面的應(yīng)用；所述的鹽指的是0. 3%-0. 9%NaCl鹽堿土。
5.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述的抗鹽性指的是堆肥微生物菌劑在增加高羊茅葉綠素含量方面的應(yīng)用；其中的復(fù)合微生物菌劑為稀釋200倍的體積比為枯草芽孢桿菌 放線菌酵母菌=1 1 1的3個(gè)菌種組成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種城市生活垃圾堆肥復(fù)合微生物菌劑在提高草坪植物抗鹽性方面的應(yīng)用，其中的復(fù)合微生物菌劑為稀釋100-200倍的體積比為枯草芽孢桿菌放線菌酵母菌=1∶1∶1的3菌種組成；所述的抗鹽性指的是0.3%-0.9%NaCl鹽堿土。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩種草坪植物接種了城市生活垃圾堆肥復(fù)合微生物菌劑后，抗鹽脅迫的最大脅迫能力可以達(dá)到0.9%的鹽脅迫，說(shuō)明采用本發(fā)明配制的稀釋100-200倍的復(fù)合微生物菌劑對(duì)緩解草坪植物鹽脅迫有明顯的促進(jìn)作用。
文檔編號(hào)C05G3/04GK102172145SQ20111003705
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月14日
發(fā)明者多立安, 王晶晶, 趙樹蘭 申請(qǐng)人:天津師范大學(xué)