專利名稱：垃圾堆肥復(fù)合菌劑在提高草坪草礦質(zhì)營養(yǎng)上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境保護技術(shù)領(lǐng)域，涉及以城市生活垃圾堆肥中提取出的有益菌種為原料，配制高效堆肥復(fù)合菌劑。更具體的說是采用微生物的菌劑，研究對黑麥草和高羊茅初期生長的影響及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
堆肥化(composting)是利用自然界廣泛存在的微生物(細菌、放線菌、真菌等) 或商業(yè)菌株，有控制地促進可被生物降解的有機物向穩(wěn)定的腐殖質(zhì)〔humicsubstance，HS) 轉(zhuǎn)化的生物化學(xué)過程。這一過程也是地球表面生態(tài)過程的一部分，它參與地球表面的物質(zhì)和能量循環(huán)。在人為控制條件下，通過堆肥化可以將固體廢物中的有機物轉(zhuǎn)化成為有機肥料一堆肥(compost)，這種有機肥料作為堆肥化的最終產(chǎn)物，不僅性能穩(wěn)定，并且對環(huán)境的危害甚小。因此，堆肥化是固體廢物，尤其是城市生活垃圾無害化、穩(wěn)定化和資源化的有效途徑之一。堆肥化發(fā)展至今，已經(jīng)歷了漫長的歷史，對其產(chǎn)生和發(fā)展的歷史過程進行回顧和分析，可為今后開發(fā)新的堆肥工藝技術(shù)提供理論和實踐上的借鑒和幫助。陳世和等(1989)采用垃圾培養(yǎng)基，在城市生活垃圾堆肥處理過程中，溫度達 45°C和55°C時，對堆肥菌株進行分離，發(fā)現(xiàn)在45°C時曲霉菌[Aspergillus]、芽孢桿菌屬[Bacillus]、假單孢菌屬[Pseudomonas]禾Π 芽孢乳桿菌屬[Sporolactobaci Ilus] 等是堆肥中的優(yōu)勢菌群。而到55°C時則有所不同，除了芽孢桿菌屬[Bacillus]和假單孢菌屬Pseudomonas]仍然為優(yōu)勢菌群外，乳酸桿菌屬[LactcAacilIus]、鏈球菌屬 [Streptococcus]和小單孢菌[Micromonospora]屬則成為新的優(yōu)勢菌群，替代了其它種微生物，表明在堆肥化過程中，微生物種群處在一個不斷變化的動態(tài)平衡之中。從城市生活垃圾中分離出大量參與高溫好氧堆肥的微生物，經(jīng)鑒定分別為芽孢桿菌屬、假單孢菌屬，乳酸桿菌屬、葡萄球菌屬、埃希氏菌屬等5屬細菌；曲霉屬，毛霉屬、紅曲霉屬，青霉屬、地霉屬、霉屬、脈孢苗屬、頭孢霉屬等8屬霉菌；鏈霉菌屬1屬放線菌；酵母菌屬，裂殖酵母菌等2屬酵母菌。該研究結(jié)果有力地促進了對垃圾堆肥中微生物的研究和利用。Hassen (2001)對城市垃圾堆肥過程誒生物變化的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，分解有機物產(chǎn)生的高溫引起微生物群落的重要變化，使致病菌、酵母菌及中溫菌大量減少，而產(chǎn)芽孢的桿菌大量存在，在堆肥過程中，高溫階段初期和中文階段細菌均占主要地位。馬文漪等也報道了嗜熱真菌，嗜熱褐色放線菌等參與垃圾堆肥的微生物種群。從城市生活垃圾中有機物的組成來看，而被微生物所分解利用。但各種微生物對各種物質(zhì)的分解能力和分解速度是不盡相同的，不同溫度下(中溫、高溫)堆肥過程中出現(xiàn)的微生物種群和數(shù)量上亦截然不同。近期的相關(guān)文獻及實際生產(chǎn)表明目前如何提高城市生活垃圾堆肥處理的技術(shù)水平、提高處理效率、改善產(chǎn)品質(zhì)量，一直是相關(guān)科研人員所重點關(guān)注的研究內(nèi)容；在堆肥物料中針對特定物質(zhì)有目的的添加一些人工微生物制劑，已經(jīng)被很多研究所證實是可以加快堆肥腐熟，提高堆肥效率的方法。考慮到在很多研究和生產(chǎn)實踐中，合理配比的復(fù)合菌劑往往較單一菌株更具好的效果，于是如何將堆肥中提取和篩選出來的各種功能菌株結(jié)合起來開發(fā)高效堆肥復(fù)合菌劑，從根本上優(yōu)化和合理配制使用城市垃圾堆肥基質(zhì)便成了相關(guān)科研人員研究的熱點問題。盡管植物接種微生物的效應(yīng)研究報道較多，但大部分研究工作涉及的微生物菌劑只限于從土壤中提取。生活垃圾堆肥化是利用自然界廣泛存在的微生物(細菌、放線菌、真菌等)或商業(yè)菌株，有控制地促進可被生物降解的有機物向穩(wěn)定腐殖質(zhì)轉(zhuǎn)化的生物化學(xué)過程，是由群落結(jié)構(gòu)演替非常迅速的多個微生物群體共同作用而實現(xiàn)有機廢棄物資源化、無害化的動態(tài)過程。研究表明，單一的細菌、真菌、放線菌群體，無論其活性多高，在加快堆肥化進程中的作用都比不上復(fù)合微生物菌群的共同作用。Ros和Wrez-Piqueres等人研究了接種外源微生物復(fù)合菌劑對堆肥化過程中微生物的影響，有利于了解堆肥過程的生物化學(xué)過程及加入微生物制劑對堆肥的影響。近年來國內(nèi)外學(xué)者對堆肥過程中的微生物現(xiàn)象進行了一系列理論和實踐研究，Vaz-Moreira等人對堆肥中細菌的群落多樣性進行分析，以期深入認識堆肥過程的本質(zhì)，為堆肥技術(shù)和工藝的研究提供理論基礎(chǔ)。但在復(fù)合微生物菌劑研究過程中，有關(guān)堆肥內(nèi)部微生物種類的鑒定和分類，堆肥菌種之間共生及相互影響關(guān)系具有模糊性和復(fù)雜性，以及將堆肥微生物菌劑應(yīng)用于正常條件下對植物生長的影響方面，相關(guān)研究也鮮為報道。而有關(guān)堆肥內(nèi)部微生物種類的鑒定和分類，堆肥菌種之間共生及相互影響關(guān)系具有模糊性和復(fù)雜性，以及從城市生活垃圾堆肥中提取篩選和配制堆肥復(fù)合有益微生物菌劑，對草坪植物生長、生理特性的影響方面的研究還未見報道。城市垃圾堆肥中含有豐富的有機質(zhì)和植物營養(yǎng)元素，對多種作物均有增產(chǎn)效果分別對堆肥中有機質(zhì)和營養(yǎng)需求進行了研究，發(fā)現(xiàn)堆肥中的有機質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)可以改善土壤理化性質(zhì)，提高作物產(chǎn)量。顧文杰等(2009)研究接種外源菌劑對堆肥中微生物數(shù)量和酶活性變化的影響，為微生物菌劑的應(yīng)用和堆肥工藝的改進提供依據(jù)。Ivone V M等(2008)對堆肥中細菌的群落多樣性進行分析，以期深入認識堆肥過程的本質(zhì)，為堆肥技術(shù)和工藝的研究提供理論基礎(chǔ)。 但在復(fù)合微生物菌劑研究過程中，有關(guān)堆肥內(nèi)部微生物種類的鑒定和分類，堆肥菌種之間共生及相互影響關(guān)系具有模糊性和復(fù)雜性，而有關(guān)將堆肥微生物菌劑應(yīng)用于草坪植物對其體內(nèi)礦質(zhì)營養(yǎng)的需求和影響，相關(guān)研究也鮮為報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明選擇城市固體廢棄物(生活垃圾)為研究對象，探討其垃圾堆肥內(nèi)部微生物組分和營養(yǎng)成分，篩選出有益的微生物菌種(枯草芽孢桿菌、放線菌和酵母菌)，配制成不同濃度的復(fù)合微生物菌劑噴灑到建植的草坪植物體系中。研究堆肥復(fù)合微生物菌劑對草坪植物幼苗生長和營養(yǎng)成分的影響，以及Ca2+、K+、Mg2—和Na+離子的吸收和分布狀況，為篩選有益配比的微生物菌劑在生產(chǎn)中應(yīng)用提供依據(jù)。為實現(xiàn)上述目的本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案
復(fù)合菌劑在制備提高草坪植物體內(nèi)礦質(zhì)營養(yǎng)需求方面的應(yīng)用；其中采用的復(fù)合菌劑由體積比例為枯草芽孢桿菌放線菌酵母菌=1 :1 :1的3菌種稀釋100-200倍的液體噴撒完成。
本發(fā)明所述的應(yīng)用，其中3菌種的菌落數(shù)在2.44X 109-2.47X 109/ml之間；草芽孢桿菌的0D_值為0. 567，酵母菌的OD56tl值為0. 5450本發(fā)明所述的應(yīng)用，其中的礦質(zhì)營養(yǎng)指的是Ca2+、K+、Mg2—和Na+離子的吸收和分布狀況。本發(fā)明所述的應(yīng)用，其中的草坪植物為黑麥草和高羊茅。本發(fā)明所述的應(yīng)用，其中復(fù)合菌劑在種子萌發(fā)生長到分蘗期時，在葉面施加不同的處理方式，采用浸蘸的方法替代液面噴施；白天植物能接受到光照的時間為7—8 h,室溫平均溫度為18 °C，平均最高溫度為21. 8 °C，最低溫度為15. 60C，平均濕度為35. 1%，平均最大濕度為52. 7%，平均最小濕度3496，平均光量子密度為600— 800 μ mol · m_2 · s—1，持續(xù)處理35天測定各項指標。接種復(fù)合微生物菌劑后，莖葉部分礦質(zhì)元素的累積量都有顯著性差異。高羊茅在稀釋倍液為200的濃度時，莖葉部分積累的4種大量元素(Ca、K、Mg和Na)含量最高，與對照相比分別超過86. 49%,63. 41%,79. 49%和28. 16%。而對于黑麥草，復(fù)合菌劑1倍液下，莖葉部分積累的礦質(zhì)營養(yǎng)最高，與沒菌劑相比分別高出76. 27%,68. 75%,76. 92%和84. 54%.本發(fā)明進一步公開了高效堆肥復(fù)合菌劑，其中3菌種的篩選方法如下
(1)富集將采集的堆肥樣品稱取IOg置于無菌三角瓶中，加入IOOml無菌水和玻璃珠振蕩均勻后，取IOml懸浮液于盛有IOOml富集培養(yǎng)基的三角瓶中，分別在適合的溫度，搖床振蕩培養(yǎng)3天；
(2)初篩將富集后的培養(yǎng)液進行濃度梯度稀釋后，涂布于分離篩選培養(yǎng)基上，倒置恒溫培養(yǎng)，觀察透明圈的大小，選取透明圈/菌落直徑比值較大菌落的菌株進行復(fù)篩；
(3)復(fù)篩將初篩得到的菌株接種到相應(yīng)搖瓶培養(yǎng)基中，在適合的溫度和搖床速度的條件下培養(yǎng)，以O(shè)D值為縱坐標，培養(yǎng)時間為橫坐標，繪制菌株的生長曲線；
(4)合微生物菌劑的制備將篩選的枯草芽孢桿菌、放線菌、酵母菌在相應(yīng)的培養(yǎng)基上，具體步驟為
①用無菌生理鹽水洗滌保存斜面，至無菌三角瓶中搖勻即成菌懸液；
②接種斜面培養(yǎng)物于種子瓶，枯草芽孢桿菌在3(TC、180r/ min培養(yǎng)1 得到種子液， 放線菌和酵母菌在觀220 r / min培養(yǎng)48 h得到種子液；
③濃度10%的種子液接種到發(fā)酵瓶中擴大培養(yǎng)48h得到發(fā)酵液。按體積比例為枯草芽孢桿菌放線菌酵母菌=1:1:1配制復(fù)合微生物菌液。本發(fā)明更加詳細的制備方法如下
桿菌(保藏號CCTCCM207094)、放線菌(保藏號CPC(^60118)、酵母菌(保藏號 CGMCCN0. 1147)均由市售，但根據(jù)需要也可以采用下述的方法制備得到3個菌株。其得到的3個菌株的生化特性與市售的相同。研制材料與方法 1. 1材料
選用我國北方比較常見多年生黑麥草(ZWi perenne L.)和高羊茅(/^stoca arundinacea L.)為試驗材料。方法
1. 2. 1菌株的篩選方法
富集將采集的堆肥樣品稱取IOg置于無菌三角瓶中，加入IOOml無菌水和玻璃珠振蕩均勻后，取IOml懸浮液于盛有IOOml富集培養(yǎng)基的三角瓶中，分別在適合的溫度下?lián)u床振蕩培養(yǎng)3—5天。初篩將富集后的培養(yǎng)液進行濃度梯度稀釋后，涂布于分離篩選培養(yǎng)基上，倒置恒溫培養(yǎng)，觀察透明圈的大小，選取透明圈/菌落直徑比值較大菌落的菌株進行復(fù)篩。復(fù)篩生長曲線的繪制將初篩得到的菌株接種到相應(yīng)搖瓶培養(yǎng)基中，在適合的溫度和搖床速度的條件下培養(yǎng)，以O(shè)D值為縱坐標，培養(yǎng)時間為橫坐標，繪制菌株的生長曲線。復(fù)合微生物菌劑的制備
菌種培養(yǎng)將篩選的枯草芽孢桿菌、放線菌、酵母菌在相應(yīng)的培養(yǎng)基上擴大培養(yǎng)，具體步驟①用無菌生理鹽水洗滌保存斜面，至無菌三角瓶中搖勻即成菌懸液；②接種斜面培養(yǎng)物于種子瓶，枯草芽孢桿菌在3(TC，180r / rain培養(yǎng)12 h得到種子液，放線菌和酵母菌在觀°C, 220 r / rain培養(yǎng)48 h得到種子液；③濃度10%的種子液接種到發(fā)酵瓶中擴大培養(yǎng)48 h得到發(fā)酵液。按以下處理配制復(fù)合微生物菌液。植物的無土培養(yǎng)和復(fù)合微生物菌劑的應(yīng)用
植物的無土培養(yǎng)草坪植物種子經(jīng)1% 溶液消毒3-5min，然后用蒸餾水沖洗干凈，把種子放進離心管中，在飽和的CaSO4溶液中浸泡4h后，培養(yǎng)皿中加少許CaSO4溶液，其中墊上一層濾紙，把浸泡4h后的種子放在濾紙上，選取浸種后籽粒飽滿、大小一致的草坪植物種子100粒，用蒸餾水沖洗干凈后播種于其中，試驗中每一處理設(shè)置3次重復(fù)，早晚各加一次蒸餾水來補充由蒸發(fā)而散失的水分。復(fù)合微生物菌劑的應(yīng)用處理1加入原菌劑，簡稱CM1 ；處理2加入100倍液的，簡稱CM2 ；處理3加入200倍液的，簡稱CM3 ；處理4加入300倍液的，簡稱CM4 ；處理5加入400 倍液的，簡稱CM5;處理6不接菌劑，簡稱CK。每天統(tǒng)一定量給水，試驗盆隨機排列。種子萌發(fā)生長到分蘗期時，在葉面施加不同的處理方式，采用浸蘸的方法替代液面噴施。每天植物能接受到光照的時間為7—8 h。室溫平均溫度為18 °C，平均最高溫度為21. 8 °C，最低溫度為15. 6°C。平均濕度為35. 1%，平均最大濕度為52. 7%，平均最小濕度34%。平均光量子密度為600—800 μ mol · m_2 · s-1。持續(xù)處理35天測定各項指標。指標測定
株高，采用厘米刻度尺每個培養(yǎng)皿隨機測5個株高，以及萌發(fā)率的測定。葉綠素的測定參考李合生(2000)。生物量的測定，將植物分地上與地下兩部分放至烘箱，80°C烘至恒重。 采用SpectrAA-2000原子吸收光譜儀，測定草坪植物地上部分的大量元素。數(shù)據(jù)分析采用 EXCEL和SPSSl 1. 5分析軟件進行處理。研制結(jié)果分析 2. 1菌種篩選
2. 1. 1初篩
通過平板分離篩選，得到透明圈/菌落直徑比值較大且生長較快的菌落。將所得的枯草芽孢桿菌、放線菌、酵母菌分別進行劃線分離、編號并保藏于固體斜面培養(yǎng)基上。復(fù)篩
通過測定初篩菌種的生長曲線、OD值和菌落數(shù)，來研究堆肥中各類微生物的數(shù)量變化和活性大小，篩選出生長活性最高和繁殖能力最好時期的菌種，配制成各種不同濃度的堆肥復(fù)合微生物菌劑，接種到草坪植物建植體系中。表1微生物菌劑所富含的菌落數(shù)
權(quán)利要求
1.復(fù)合菌劑在制備提高草坪植物體內(nèi)礦質(zhì)營養(yǎng)需求方面的應(yīng)用；其中所述的采用生活垃圾堆肥制備的復(fù)合菌劑由體積比例為草芽孢桿菌放線菌酵母菌=1 :1 1的3菌種稀釋100-200倍的液體噴撒完成。
2.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中3菌種的菌落數(shù)在2.44X 109-2· 47Χ 109/ml之間；草芽孢桿菌的OD6tltl值為0. 567，酵母菌的OD56tl值為0. 545 0
3.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中的草坪植物為黑麥草和高羊茅。
4.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中復(fù)合菌劑在種子萌發(fā)生長到分蘗期時，在葉面施加不同的處理方式，采用浸蘸的方法替代液面噴施；白天植物能接受到光照的時間為7—8 h, 室溫平均溫度為18 °C，平均最高溫度為21. 8 °C，最低溫度為15. 60C，平均濕度為35. 1%， 平均最大濕度為52. 7%，平均最小濕度3496，平均光量子密度為600— 800 μ mol · m_2 · s—1， 持續(xù)處理35天測定各項指標。
5.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中的礦質(zhì)營養(yǎng)指的是Ca2+、K+、Mg2—和Na+離子的吸收和分布狀況。
全文摘要
本發(fā)明公開了生活垃圾復(fù)合菌劑在制備提高草坪植物體內(nèi)礦質(zhì)營養(yǎng)需求方面的應(yīng)用；其中采用的復(fù)合菌劑由體積比例為枯草芽孢桿菌放線菌酵母菌=111的3菌種稀釋100-200倍的液體噴撒完成。噴灑堆肥復(fù)合微生物菌劑后，植株體內(nèi)幾種大量元素(Na、K、Ca、Mg)隨菌劑稀釋倍數(shù)的增加的變化趨勢基本相同，但堆肥復(fù)合微生物菌劑對草坪植物生長影響因宿主植物種類、和環(huán)境因子而有明顯差異，這有利于草坪植物對礦質(zhì)元素的吸收和利用。
文檔編號C05F11/08GK102180712SQ201110037029
公開日2011年9月14日 申請日期2011年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月14日
發(fā)明者多立安, 王晶晶, 趙樹蘭 申請人:天津師范大學(xué)