專利名稱：硫代巴比妥酸用于抑制黑色素生成及生物殺蟲劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及硫代巴比妥酸(Thiobarbituric acid，TBA)作為酪氨酸酶抑制劑在醫(yī)藥品、化妝品及食品、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
酪氨酸酶(EC 1. 14. 18. 1，Tyrosinase)是一種含銅的金屬酶，廣泛分布于微生物、動(dòng)植物及人體中.酪氨酸酶是皮膚色素合成中具有多重催化功能的重要的酶， 該酶兼有加氧酶和氧化酶的雙重功能，在黑色素合成過(guò)程中起關(guān)鍵作用，是黑色素合成過(guò)程的限速酶。酪氨酸酶屬于第三類銅蛋白家族(人Yoon J，F(xiàn)ujii S，Solomon ΕΙ. Proc Natl Acad Sci USA. 2009 Apr 21; 106 (16) :6585-90; 2. Li Y, Wang Y, Jiang H， Deng J. Proc Natl Acad Sci USA. 2009 Oct 6; 106 (40): 17002-6.)，在活性部位 2 個(gè)銅離子分別與3個(gè)組氨酸相連，并且該2個(gè)銅離子與不同的催化反應(yīng)直接相關(guān)，如單酚羥基化為二酚(甲酚酶活性)和二酚氧化為二醌(鄰苯二酚氧化酶活性)C . Decker, H. and Tuczek, F. (2000) Trends Biochem. Sci. 25，392-397.)。酪氨酸酶的活性與黑色素合成量密切相關(guān)，在人體內(nèi)的活性增高回導(dǎo)致雀斑、黃褐斑等黑色素過(guò)度沉積等疾病的發(fā)生 {4. Olivares C，Solano F. Pigment Cell Melanoma Res. 2009 Dec;22 (6) :750-60 ； 5.
Jimbow K，Park JS, Kato F，Hirosaki K，Toyofuku K，Hua C，Yamashita T. Pigment Cell Res. 2000 Aug; 13(4):222-9.)。食物(果蔬、蝦蟹等)中的酪氨酸酶會(huì)引起食物加工及貯藏過(guò)程中的褐變，導(dǎo)致食物變質(zhì)(6. Kim YJ, Uyama H. Cell Mol Life Sci. 2005 Aug;62(15) 1707-23 ；7. Rescigno A, Sollai F，Pisu B，Rinaldi A, Sanjust Ε. J Enzyme Inhib Med Chem. 2002 Aug; 17(4):207-18.)。酪氨酸酶在昆蟲體內(nèi)也普遍存在， 在昆蟲創(chuàng)傷愈合以 Kanost MR, Jiang H, Yu XQ. Immunol Rev. 2004 Apr; 198:97-105； 9. Lai SC，Chen CC，Hou RF. J Med Entomo1. 2002 Mar;39(2):266-74.)琳衰躍I傲 {10. Guerrero, A. and Resell, G. (2005) Curr. Med. Chem. 12，461-469.)中起重要作用。由于酪氨酸酶在醫(yī)藥、化妝品和農(nóng)業(yè)上的潛在應(yīng)用前景，其活性調(diào)控研究成為研究的焦點(diǎn)。迄今為止，已研制出多種類型的酪氨酸酶抑制劑，可作為開發(fā)增白劑及生物殺蟲劑的候選。目前，已有不少來(lái)源于化學(xué)合成和天然產(chǎn)物的酪氨酸酶抑制劑作為藥品、化妝品或食品添加劑及生物殺蟲劑。已普遍應(yīng)用的酪氨酸酶抑制劑有氫醌、曲酸及其衍生物、壬二酸、熊果苷、黃酮類化合物、Vc及其衍生物、綠茶提取物、甘草提取物等。但現(xiàn)有的酪氨酸酶抑制劑在活性、穩(wěn)定性或安全性等多方面存在著不同程度的缺陷，因此繼續(xù)尋找活性高、安全性好、性質(zhì)穩(wěn)定的酪氨酸酶抑制劑仍然具有十分重要的意義。硫代巴比妥酸(TBA)是一種抗氧化劑，作為血漿和組織內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)和氧化壓力的指數(shù)頻繁應(yīng)用，稱為TBARS鑒定分析(從Y.J. Garcia e t al. /Journal of Neuroscience Methods 144 (2005) 127-135； 12. Gutteridge JM，Halliwell B.Trends Biochem Sci (1990) 15:129-34 ； 13. Janero DR/ Free Radic Biol Med (1990) 9: 515-40.)。它可以分析丙二醛，并且用作確定食物中油脂自由基氧化的變化α么 Guilllen-Sans R/ Crit Rev Food Sci Nutr. (1998) 38:力 )。TBA 還被用于篩選艾滋病毒整合酶抑制劑(75 S. Rajamake et al./Bioorg. Med. Chem. Lett. 19 (2009) 3615-3618~)。.因此，我們提出TBA對(duì)酪氨酸酶的抑制作用，并提出一種抑制動(dòng)力學(xué)研究和計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)TBA在酪氨酸酶催化反應(yīng)中作用研究相結(jié)合的研究途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述存在的不足，提供一種克服現(xiàn)有酪氨酸酶抑制劑在穩(wěn)定性、安全性的缺陷，提供一種新的穩(wěn)定性好、細(xì)胞毒性非常微小的酪氨酸酶抑制劑，從而抑制黑色素細(xì)胞中的黑色素生成的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)完成的，本發(fā)明所用的酪氨酸酶(M.W. 128 kDa)購(gòu)自于 Sigma-Aldrich 公司。本發(fā)明所用的硫代巴比妥酸Q-Thiobarbituric acid, TBA)，分子量144. 15，微黃色或微橙紅色粉狀結(jié)晶，溶于沸水、堿液中，常溫貯存，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如公式1
1.酪氨酸酶活性分析
酪氨酸酶活力的測(cè)定采用分光光度法。我們以L-DOPA作為底物，采用 Lineweaver-Burk 法測(cè)得酪氨酸酶 Km = 0. 51 士 0.03 mM (Vmax = 0. 3 士 0. 01)。反應(yīng)采用典型的Iml反應(yīng)底物體系加入IOml酶溶液來(lái)測(cè)量酪氨酸酶活性。在本研究中通過(guò)Perkin Elmer Lambda Bio紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)吸收值來(lái)計(jì)算酶活性，即用在492nm處每分鐘吸光值變化來(lái)指示ν值。2.酪氨酸酶非競(jìng)爭(zhēng)性抑制動(dòng)力學(xué)分析
非競(jìng)爭(zhēng)性抑制動(dòng)力學(xué)分析的Lineweaver-Burk方程如公式2 公式3 以[I]為橫坐標(biāo)，1/Vmax為縱坐標(biāo)進(jìn)行二次作圖，如得到一條直線，說(shuō)明在單一位置或同類位置發(fā)生抑制。3.內(nèi)源和外源熒光測(cè)定
熒光發(fā)射光譜由Jasco FP750熒光光譜儀用Icm光徑比色皿檢測(cè)。激發(fā)波長(zhǎng)在^Onm 檢測(cè)色氨酸熒光，檢測(cè)波長(zhǎng)范圍在300至410nm。酶溶液中加入終濃度為40M ANS孵育30min 后檢測(cè)酪氨酸酶液的外源熒光強(qiáng)度變化情況。外源熒光測(cè)定時(shí)激發(fā)波長(zhǎng)為390nm，檢測(cè)波長(zhǎng)范圍在400至520nm。所有動(dòng)力學(xué)反應(yīng)和檢測(cè)均采用50 mM磷酸鈉緩沖溶液(pH 7. 0)。4.硫代巴比妥酸(TBA)與酪氨酸酶結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量的檢測(cè)
根據(jù)先前的報(bào)道(彬.M.X. Xie, XY. Xu, Y. D. Vang, Biochim. Biophys. Acta. 1724 (2005)力)，當(dāng)小分子等價(jià)結(jié)合到大分子上時(shí)，自由分子和結(jié)合分子的平衡方程如下，可用于計(jì)算結(jié)合常數(shù)(K)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量(η)，公式4中，F(xiàn)tl和F分別為無(wú)熒光猝滅劑和有熒光猝滅劑時(shí)反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)的相對(duì)熒光強(qiáng)度。⑴]是熒光猝滅劑(TBA)的濃度。 基于方程[3]作圖得到截距和斜率，可用來(lái)計(jì)算K和η的值。5.酪氨酸酶的同源性模型
根據(jù)以往的報(bào)道進(jìn)行蘑菇酪氨酸酶3D結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)(77. Guo L, Lu ZR, Park D, Oh SHf Shi L, Park SJf Bhak J，Park YD，Ren ZL, Zou F. J Biomol Struct Dyn. 2008Dec ；26 (3) :395-402 ； 18. Lu ZR, Shi L, Wang J, Park D, Bhak J, Yang JM，Park YD， Zhou HWf Zou F. Appl Biochem Biotechnol. 2010 Apr; 160 (7): 1896-908.)，％_覓基予同源性模擬的軟件M0DELLER9vl生成包含556個(gè)氨基酸的酪氨酸酶三維模型(19. John, B. and Salif Α. (2003) Nucleic Acids Res. 31，3982-3992.)。我們從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù) Protein Data Bank (PDB) (http://www. pdb. org)檢索已知的酪氨酸酶同源結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)4 個(gè)條目(PDB entry: lwxc, lxom, 2oic, 2oid)為適用的結(jié)構(gòu)模板(平均26%序列一致)， 與酪氨酸酶具有部分同源性。采用MODELLER程序包的ALIGN2D校準(zhǔn)酪氨酸酶與模板的序列?；谠撔蛄行?zhǔn)，酪氨酸酶的3D結(jié)構(gòu)構(gòu)成具有很高的置信水準(zhǔn)。隨之，我們采用作為穩(wěn)定性度量標(biāo)準(zhǔn)的離散優(yōu)化蛋白質(zhì)能量(DOPE)評(píng)分計(jì)算了酪氨酸酶結(jié)構(gòu)模型的結(jié)構(gòu)能。6.計(jì)算機(jī)模擬酪氨酸酶和TBA的對(duì)接
在所有用于蛋白質(zhì)-配體對(duì)接的計(jì)算機(jī)模擬應(yīng)用工具中，AutoDock4和D0CK6由于其自動(dòng)對(duì)接性能應(yīng)用最為廣泛。該程序利用一套預(yù)設(shè)的目標(biāo)蛋白3D網(wǎng)格完成配體的連接，AutoDock 采用隨機(jī)的搜索技術(shù)(湖.Huey, R., Morris, G. Μ.，Olson，A. J., and Goodsell, D. S. (2007) J. Comput. Chem. 28，)而 DOCK 采用系統(tǒng)的搜索技術(shù){21. Moustakas, D. Τ.，Lang, P. Τ., Pegg, S., Pettersen, Ε.，Kuntz, I. D., Brooijmans, N., and Rizzo, R. C. (2006) J. Comput. Aided MoL Des. 20, 601-619.).因此，我們采用兩種稍有不同的途徑評(píng)估酪氨酸酶和TBA的結(jié)合。原始的 TBA 結(jié)構(gòu)源自于 PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)(Compound ID 2723628) (http //www. pubchem. org) {22. Xie, Z Q. and Chen, J. Z. J. (2008) Chem. Inf. Model 48，465-475.)。對(duì)接步驟之前需進(jìn)行1) 2D結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為3D結(jié)構(gòu)，2)估算電荷，3)添加氫原子，4)凹陷區(qū)域定位。以上步驟中我們使用J-Chem軟件包(http://驟w. chemaxon. com/)中的轉(zhuǎn)化程序和 OpenBabel (http//openbabel. sourceforge. org)。7. HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)和MTT分析
HaCaT細(xì)胞系是一種能無(wú)限次傳代的常用角質(zhì)細(xì)胞0 ". Boukamp P, Petrussevska RT, Breitkreutz D, Hornung J，Markham A, Fusenig NE. J Cell Biol. 1988 Mar; 106(3) :761-71.)。該細(xì)胞在含有10%胎牛血清FBS和1%抗生素-抗霉劑(Gibco， Rockville, MD)的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用Sigma-Aldrich公司購(gòu)買的MTT試劑盒分析 HaCaT細(xì)胞中TBA的細(xì)胞毒性，操作過(guò)程根據(jù)供應(yīng)商的說(shuō)明進(jìn)行。本發(fā)明將在結(jié)構(gòu)特征方面，TBA屬于硫醇類化合物，我們的結(jié)果與之前報(bào)道的硫醇類化合物對(duì)酪氨酸酶的顯著抑制現(xiàn)象類似。我們發(fā)現(xiàn)TBA在不同溫度的水溶液中均非常穩(wěn)定，且對(duì)皮膚角質(zhì)化細(xì)胞毒性非常微小。TBA抑制代表了不同于銅離子螯合劑抑制酪氨酸酶活性的另一種模式。與之前報(bào)道的銅離子螯合劑抑制酪氨酸酶活性相比，TBA誘發(fā)抑制反應(yīng)的機(jī)理不同，主要有兩個(gè)理由一、TBA并非直接連接于活性位點(diǎn)的銅離子上，因此，不存在與L-DOPA的競(jìng)爭(zhēng)。二、活性位點(diǎn)的兩個(gè)銅離子共享源自生物體的酪氨酸酶殘基，但作為抑制劑的連接殘基存在于活性位點(diǎn)處的不同連接部位。TBA能引起酪氨酸酶的完全失活，不伴隨三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。TBA未引起酪氨酸酶三級(jí)結(jié)構(gòu)的調(diào)整現(xiàn)象反映TBA只是連接在與L-DOPA催化作用相關(guān)的特定殘基上，該位置存在于酪氨酸酶活性部位，因此該抑制作用沒(méi)有伴隨顯著的結(jié)構(gòu)變化。由于抑制類型為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制方式，在活性位點(diǎn)內(nèi)部，TBA結(jié)合部位區(qū)別于L-DOPA的結(jié)合位點(diǎn)。TBA并非直接與L-DOPA競(jìng)爭(zhēng)，但影響了一系列的催化過(guò)程，暗示TBA結(jié)合位置與L-DOPA的連接位點(diǎn)非常接近?；谝陨辖Y(jié)果，我們進(jìn)一步進(jìn)行了計(jì)算機(jī)模擬預(yù)測(cè)與TBA 連接的氨基酸，以證明我們預(yù)測(cè)的TBA抑制作用機(jī)理。計(jì)算機(jī)模擬表明TBA能夠直接與酪氨酸酶殘基形成配基結(jié)合復(fù)合物。在TBA結(jié)合的第一步，這些氨基酸殘基非常重要。結(jié)合位點(diǎn)在活性部位內(nèi)，TBA和L-DOPA底物存在下的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用不引起酪氨酸酶構(gòu)象的顯著變化。綜上所述，本發(fā)明研究的結(jié)果總結(jié)如下1) TBA配基與酪氨酸酶結(jié)合，弓丨發(fā)對(duì)酪氨酸酶的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，抑制效果明顯；2)即使在高濃度的TBA存在下，也未發(fā)生酪氨酸酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)變化；3)通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬酪氨酸酶與TBA的結(jié)合，預(yù)測(cè)出結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸，且這些殘基位于活性部位內(nèi)；4) TBA對(duì)酪氨酸酶的抑制作用代表了抑制酪氨酸酶活性的新類型，為開發(fā)治療皮膚色素沉著的新的抑制劑和生物殺蟲劑提供研究基礎(chǔ)。


圖1是公式1:
圖2是公式2 圖3是公式3 圖4公式4
圖5是TBA對(duì)酪氨酸酶的抑制影響圖； 圖6是ν和[E圖]; 圖7是Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖8是不同溫度下長(zhǎng)期存放時(shí)TBA對(duì)酪氨酸酶的抑制影響圖； 圖9不同TBA濃度下酪氨酸酶的熒光強(qiáng)度變化圖； 圖 10 是 Ftl/(Ftl-F) vs. Κ Γ1 雙倒數(shù)圖； 圖11不同濃度TBA中酪氨酸酶外源熒光的變化12酪氨酸酶與TBA結(jié)合的計(jì)算機(jī)模擬圖； 圖13人HaCaT角質(zhì)化細(xì)胞的TBA毒性試驗(yàn)圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
TBA對(duì)酪氨酸酶活性的影響抑制動(dòng)力學(xué)
酪氨酸酶的活性以劑量依賴的方式被TBA顯著抑制(圖5)。當(dāng)TBA濃度高于40 mM, 酪氨酸酶的活性完全被抑制。測(cè)得的IC5tl值為8.0 士 1.0 mM。為了分析TBA抑制的可逆性，以剩余酶活力與[E]作圖(圖6)。圖示結(jié)果得到4條通過(guò)原點(diǎn)的直線，表明TBA對(duì)酪氨酸酶的抑制作用為可逆過(guò)程。為評(píng)估抑制類型，用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖(圖7)。結(jié)果顯示，表面Vmax發(fā)生變化，而Km值不變，說(shuō)明TBA對(duì)酪氨酸酶的抑制類型為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。使用Eq. [2]計(jì)算Ki值為14. 0 士 8. 5 mM。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合符合預(yù)計(jì)方程。接著，為評(píng)估TBA水溶液的穩(wěn)定性，我們分別選用-20，4和25°C三個(gè)溫度條件保存 TBA水溶液，并檢測(cè)經(jīng)不同溫度條件長(zhǎng)期保存后TBA對(duì)酪氨酸酶的抑制變化情況(圖8)。結(jié)果表明，TBA在這三個(gè)溫度下長(zhǎng)期保存后均能顯著抑制酪氨酸酶活性，證明TBA是一種穩(wěn)定的抗氧化劑。實(shí)施例2
TBA對(duì)酪氨酸酶三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響熒光光譜分析
酪氨酸酶在TBA存在下的三級(jí)結(jié)構(gòu)變化由內(nèi)源熒光和ANS結(jié)合的外源熒光檢測(cè)。我們發(fā)現(xiàn)TBA引起了酪氨酸酶內(nèi)源熒光的猝滅，隨TBA濃度增加熒光強(qiáng)度峰值降低，但峰值處波長(zhǎng)沒(méi)有出現(xiàn)位移(圖9)。熒光強(qiáng)度峰值對(duì)TBA濃度作圖顯示線性關(guān)系(圖10)。從以上數(shù)據(jù)，根據(jù)Eq. [3].，我們計(jì)算出結(jié)合常數(shù)K = 16.37 士 1. 3 χ IO3 Μ—1，成鍵數(shù)η = 2. 12 士 0.9。這些結(jié)果表明，在不含底物的體系中，TBA對(duì)酪氨酸酶有很強(qiáng)的結(jié)合力，可能的結(jié)合位點(diǎn)有2個(gè)。下一步，我們檢測(cè)了 TBA存在下，酪氨酸酶疏水性的變化(圖11)。在TBA存在下， 甚至其濃度達(dá)到80mM時(shí)，酪氨酸酶的外源熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化，證明在TBA作用下酪氨酸酶的疏水表面并未暴露。一般而言，ANS作為一種熒光染料能與疏水性氨基酸殘基結(jié)合，因此可用于檢測(cè)在抑制劑存在下酶三級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞情況。我們的結(jié)果表明即使在較高的TBA 抑制劑濃度下(從圖5可知該濃度下酶活性已被明顯抑制)，ANS結(jié)合的外源熒光仍無(wú)變化， 說(shuō)明TBA沒(méi)有引起酪氨酸酶三級(jí)結(jié)構(gòu)的顯著變化。實(shí)施例3
計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)酪氨酸酶的3D結(jié)構(gòu)和與TBA對(duì)接模擬
由于酪氨酸酶的晶體結(jié)構(gòu)還未闡明，我們從PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中分別選擇序列一致性為25%，29%, 26%和25%的lwxc, lxom, 2oic和2oid作為結(jié)構(gòu)模板模擬酪氨酸酶的3D 結(jié)構(gòu)。在酪氨酸酶的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)中，我們將結(jié)合部位放大為496 wxc 3，如圖12中黃色區(qū)域所示。酪氨酸酶與TBA的結(jié)合模擬非常成功(AutodoCk4所得結(jié)合能-4. 75 kcal/mol, Dock6結(jié)合能-23. 07 kcal/mol)。采用Autodock4和Dock6，我們?cè)诶野彼崦干纤阉髋cTBA 的結(jié)合殘基，這些殘基在位置上非?？拷Ｓ肁ut0d0Ck4我們發(fā)現(xiàn)酪氨酸酶上與TBA結(jié)合非常重要的殘基是 PHE170, THR175, VAL177, GLY251, PHE261 和 ASP536，而用 Dock6 為 GLU250和ASP536 (圖13中紅框部分)，兩程序中均發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)為ASP536。計(jì)算機(jī)對(duì)接模擬鑒定了酪氨酸酶上TBA的結(jié)合殘基并對(duì)結(jié)合區(qū)域進(jìn)行了定位，為 TBA通過(guò)非競(jìng)爭(zhēng)性抑制方式作用于酪氨酸酶的機(jī)制研究提供證據(jù)。而且，D0CK6模擬結(jié)果與圖5中內(nèi)源熒光測(cè)得結(jié)果一致結(jié)合位點(diǎn)為1個(gè)或者2個(gè)非常相似的位點(diǎn)。實(shí)施例4
采用MTT檢測(cè)TBA對(duì)HaCaT細(xì)胞系的毒性
采用不同濃度TBA培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞后，進(jìn)行MTT測(cè)試。我們應(yīng)用TBA作用于HaCaT細(xì)胞，檢測(cè)TBA對(duì)皮膚細(xì)胞的毒性。結(jié)果表明TBA對(duì)HaCaT角質(zhì)化細(xì)胞沒(méi)有毒性影響。該結(jié)果預(yù)示著TBA作為酪氨酸酶的抑制劑能作為一種有效的增白劑，應(yīng)用于緩解色素合成失調(diào) (如色素沉著過(guò)度)。圖5所示取三次數(shù)據(jù)平均和擬合。酪氨酸酶與不同濃度的TBA混合2小時(shí)后，加入到含有相應(yīng)濃度的TBA測(cè)試體系中。L-DOPA和酶的終濃度分別為2 mM和4 g/ml。圖6所示·λ值代表在492nm波長(zhǎng)處每分鐘吸光值的變化。1至4號(hào)TBA濃度分別為0，5，10禾Π 15 mM。體系中L-D0PA的終濃度為2 mM。
圖7所示體系中TBA濃度為0 10 (+)，20和27 mM。酪氨酸酶終濃度為4 g/ ml ο圖8所示χ軸分別為25 (a)，4 (b)和_20°C (c)體系的存放時(shí)間。體系中L-D0PA 和酪氨酸酶的終濃度分別為2 mM和4 g/ml。圖9所示內(nèi)源熒光變化；圖10是F。/(Ftl-F) vs. Κ Γ1雙倒數(shù)圖。(A)內(nèi)源熒光變化。測(cè)試前，酪氨酸酶和TBA共同孵育3小時(shí)。標(biāo)簽0表示空白狀態(tài)。標(biāo)簽1至6表示TBA濃度分別為0.02，0. 03, 0. 04, 0. 05, 0. 08和0. 1 mM。(B) F0/(F0-F) vs. [Q]-1雙倒數(shù)圖。F。，空白熒光強(qiáng)度峰值。F，試樣熒光強(qiáng)度峰值。Q，猝滅劑TBA。數(shù)據(jù)來(lái)自于(A)。體系中酪氨酸酶的終濃度為4 g/ml。圖11所示測(cè)試前酪氨酸酶中加入ANS (終濃度40 M)并于暗室孵育30分鐘， 用于標(biāo)記疏水表面。體系中酪氨酸酶的終濃度為4 g/ml。圖12所示蘑菇酪氨酸酶3D結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)基于先前的報(bào)道。黃色區(qū)域指示活性部位，紅色框指示假定的TBA結(jié)合部位。淺藍(lán)色部分表示Aut0D0Ck4程序下TBA的結(jié)合，粉色表示Docli6程序下TBA的結(jié)合。
權(quán)利要求
1.硫代巴比妥酸作為酪氨酸酶抑制黑色素生成的應(yīng)用，酪氨酸酶活力的測(cè)定采用分光光度法，我們以L-DOPA作為底物，采用Lineweaver-Burk法測(cè)得酪氨酸酶Km = 0. 51 士 0. 03 mM ,反應(yīng)采用典型的Iml反應(yīng)底物體系加入10 1酶溶液來(lái)測(cè)量酪氨酸酶活性，在本研究中通過(guò)Perkin Elmer Lambda Bio紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)吸收值來(lái)計(jì)算酶活性，即用在492nm處每分鐘吸光值變化來(lái)指示ν值。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述硫代巴比妥酸作為酪氨酸酶抑制黑色素生成的應(yīng)用，其特征在于所述的熒光發(fā)射光譜由Jasco FP750熒光光譜儀用Icm光徑比色皿檢測(cè)。
3.硫代巴比妥酸用于生物殺蟲劑，應(yīng)用TBA作用于HaCaT細(xì)胞，檢測(cè)TBA對(duì)皮膚細(xì)胞的毒性。
全文摘要
硫代巴比妥酸用于抑制黑色素生成及生物殺蟲劑，酪氨酸酶活力的測(cè)定采用分光光度法，我們以L-DOPA作為底物，采用Lineweaver-Burk法測(cè)得酪氨酸酶Km=0.51±0.03mM，反應(yīng)采用典型的1ml反應(yīng)底物體系加入10ml酶溶液來(lái)測(cè)量酪氨酸酶活性，在本研究中通過(guò)PerkinElmerLambdaBio紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)吸收值來(lái)計(jì)算酶活性，即用在492nm處每分鐘吸光值變化來(lái)指示v值；所述硫代巴比妥酸作為酪氨酸酶抑制黑色素生成的應(yīng)用，所述的熒光發(fā)射光譜由JascoFP750熒光光譜儀用1cm光徑比色皿檢測(cè)。
文檔編號(hào)A01N43/54GK102232954SQ20111000272
公開日2011年11月9日 申請(qǐng)日期2011年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月7日
發(fā)明者嚴(yán)莉, 呂志榮, 周海夢(mèng), 樸龍斗 申請(qǐng)人:浙江清華長(zhǎng)三角研究院