專利名稱：用晶體ibe和晶體if(cry1be和cry1f)蛋白的組合進(jìn)行的昆蟲抗性管理的制作方法
用晶體丨BE和晶體IF (CRY1BE和CRY1F)蛋白的組合進(jìn)行的昆蟲抗性管理
背景技術(shù)：
人類種植玉米以用于食物和能量的供應(yīng)。昆蟲吃并損害植物從而破壞這些人類的努力。目前已經(jīng)通過植物表達(dá)編碼來自蘇云金芽孢桿菌的CrylFa蛋白的晶體(Cry) 6內(nèi)毒素基因而實(shí)現(xiàn)了這些害蟲的植物內(nèi)轉(zhuǎn)基因控制。CrylFa是目前Dow AgroSciences的 Herculex 品牌下的轉(zhuǎn)基因玉米種子(Herculex, Herculex-Extra,和 Herculex-RW)中的毒素蛋白，其對(duì)秋粘蟲(FAW, Spodoptera frugiperda)和歐洲玉米螟(ECB, Ostrinianubilalis)昆蟲害蟲有抗性。該蛋白通過結(jié)合至位于昆蟲中腸內(nèi)的特定受體并在腸細(xì)胞上 形成孔而起作用。這些孔的形成阻止昆蟲調(diào)節(jié)滲透壓平衡并導(dǎo)致其死亡。然而，存在ー些情況，即昆蟲可能能夠通過其腸道中結(jié)合CrylFa的受體的遺傳改變而發(fā)展對(duì)CrylFa活性的抗性。產(chǎn)生具有降低的結(jié)合CrylFa能力的受體的昆蟲會(huì)對(duì)CrylFa的活性有抗性，從而在表達(dá)該蛋白的植物中存活。當(dāng)植物在生長(zhǎng)狀態(tài)期間持續(xù)表達(dá)單ー的Cry毒素時(shí)，有這種情況，即昆蟲可以通過昆蟲腸道內(nèi)的結(jié)合CrylFa毒素的受體的遺傳改變而發(fā)展對(duì)該蛋白的活性的抗性。由受體的這些改變而引起的毒素結(jié)合的降低會(huì)導(dǎo)致CrylFa毒性的降低，并可能導(dǎo)致最終作物中表達(dá)的蛋白的效カ降低。參見例如US20090313717，其涉及Cry2蛋白加Vip3Aa，CrylF或 CrylA 以控制玉米夜蛾(Helicoverpa zea)或棉鈴蟲(armigera)。WO 2009132850 涉及CrylF 或 CrylA 和 Vip3Aa 以控制草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)。US 20080311096涉及CrylAb以控制CrylF-抗性的ECB。其它Cry毒素列在官方B. t.命名委員會(huì)的網(wǎng)站上(Crickmore et al. ；lifesci.sussex. ac. uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。參見所附的附錄A。目前有近60種主要的組的“Cry”毒素(Cryl-Cry59)，和其它Cyt毒素和VIP毒素等等。各個(gè)數(shù)字組的很多具有大寫字母的亞組，而大寫字母亞組具有小寫字母的亞-亞組。(例如,Cryl具有A-L,而CrylA具有a-i)。參考文獻(xiàn)van Frankenhuyzen(2009) (J. Invert. Pathol. 101:1-16),例如，闡述了由很多靶標(biāo)害蟲和大量毒素，可以潛在的選擇來控制靶標(biāo)害蟲。參見例如vanFrankenhuyzen的圖3。可以作為靶標(biāo)的(很多種之中的)ー種害蟲可以包含歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis),對(duì)于該昆蟲，van Frankenhuyzen 的圖 3 顯不了對(duì)ECB 活性的 17 種毒素，和ー種可能有活性。沒有這些選項(xiàng)的完全列表。van Frankenhuyzen的圖3也闡明了姆種Cry蛋白具有獨(dú)特的活性譜-其對(duì)一
些昆蟲有活性而不是其它的。Cry蛋白典型地結(jié)合昆蟲腸中細(xì)胞的的受體，并且這是影響活性譜的ー個(gè)因素。ー種Cry蛋白的受體可以在ー些昆蟲中找到而不是其它的；一種給定的昆蟲可能具有一或多種Cry蛋白而不是其它Cry蛋白的受體。已知有很多可能的靶標(biāo)昆蟲，并且有針對(duì)任意給定昆蟲的活性的很多可能的Cry蛋白，單獨(dú)的數(shù)字證明了抗性控制問題的復(fù)雜性?？紤]到van Frankenhuyzen鑒別出僅18種蛋白對(duì)ECB有或可能有活性，這將使得數(shù)百種可能的毒素對(duì)以測(cè)試其組合。另外，競(jìng)爭(zhēng)性/非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析不是ー個(gè)容易的任務(wù)。這會(huì)涉及放射性標(biāo)記和放射性標(biāo)記的蛋白的取代的分析。這本身是ー種復(fù)雜的技術(shù)。嘗試直接使用抗性昆蟲也是很復(fù)雜的。昆蟲的抗性株必須經(jīng)發(fā)展針對(duì)給定蛋白的抗性。Siqueira (June 2004 ； J. Econ. Entomol. , 97 (3) : 1049-1057)陳述了(在摘要中)“不同毒素之間的交叉抗性的測(cè)試受限于缺乏抗性克隆”。這表明了獲得用于分析蛋白的抗性管理潛力的抗性昆蟲株的困難性。當(dāng)涉及蛋白對(duì)時(shí)，可以使用任一蛋白以嘗試篩選抗性昆蟲的發(fā)展。Siqueira等也在摘要中陳述了 CrylAb篩選(即，發(fā)展對(duì)CrylAb抗性的ECB克隆)“…導(dǎo)致多種其它毒素的敏感性的降低…”。這表明了交叉抗性的現(xiàn)象。CrylAb抗性ECB對(duì)“多種其它毒素”有交叉抗性。
從而，選擇對(duì)同一種(非抗性)昆蟲有活性的兩種蛋白僅僅是解決問題的起始點(diǎn)，如果致カ于抗性主題。對(duì)非抗性昆蟲的活性水平是另ー個(gè)因素。vanFrankenhuyzen的


圖11顯示即使在選擇用于測(cè)試針對(duì)ECB(非抗性)的12種毒素的組之間，甚它LCry蛋白(例如CrylAc，CrylBbJP Cry2Aa)會(huì)比現(xiàn)在聲明控制ECB的這些更査適性。發(fā)明概述本發(fā)明部分地涉及疊加CrylBe蛋白和CrylFa蛋白以使得植物更持久并更少的傾向于昆蟲通過蛋白自身而發(fā)展對(duì)這任意ー種蛋白的抗性。這些疊加可以特別用于靶標(biāo)歐洲玉米螟(ECB)。如本文中更詳細(xì)的討論，提供的蛋白對(duì)是特別有利的組合，因?yàn)闆]有已知的其它蛋白對(duì)能提供對(duì)秋粘蟲(Spodoptera frugiperda, FAff)和歐洲玉米螟(Ostrinianubilalis, ECB)害蟲兩者的高水平的控制並非交叉抗性。這種雙重的非交叉抗性也是有利的，因?yàn)檫@能減少多種非交叉抗性蛋白靶向這些昆蟲時(shí)所需要的蛋白/基因的數(shù)量。這能減少或消除避難所面積的需要。從而，本發(fā)明也通常地涉及使用四種基因以提供三種蛋白的對(duì)FAW的非交叉抗性控制和三種蛋白的對(duì)ECB的非交叉抗性。發(fā)明詳述本發(fā)明包括CrylBe蛋白和CrylFa蛋白成對(duì)的應(yīng)用。本發(fā)明也部分地涉及三倍疊加或三種(或更多)毒素的“金字塔”，以CrylFa和CrylBe蛋白作為基礎(chǔ)對(duì)。本發(fā)明的蛋白的基礎(chǔ)對(duì)提供了兩種蛋白，其提供對(duì)兩種昆蟲的非交叉抗性活性——秋粘蟲(FAW ；Spodoptera frugiperda)和歐洲玉米螟(ECB ;0strinia nubilalis)。這使得該蛋白基礎(chǔ)對(duì)稱為尤其有利的組合，因?yàn)闆]有已知的其它蛋白對(duì)能提供對(duì)這兩種昆蟲的高水平的控制姐非交叉抗性。在一些優(yōu)選的金字塔實(shí)施方式里，可以向該基礎(chǔ)對(duì)加入另ー個(gè)蛋白以提供具有針對(duì)ECB的活性的第三種蛋白。這些優(yōu)選的金字塔組合的ー些是CrylFa蛋白加CrylBe蛋白加另ー種選自CrylAb, Cry2Aa, CrylI,和DIG-3蛋白的蛋白毒素/基因。在一些優(yōu)選的金字塔實(shí)施方式里，可以向該基礎(chǔ)對(duì)加入另ー個(gè)蛋白以提供具有針對(duì)FAW的活性的第三種蛋白。這些優(yōu)選的金字塔組合的ー些是CrylFa蛋白加CrylBe蛋白加另ー種選自Vip3A, CrylC, CrylD,CrylE的蛋白毒素/基因。
在一些優(yōu)選的金字塔實(shí)施方式里，根據(jù)CrylF和CrylBe兩者針對(duì)ECB和FAW兩者的活性，本發(fā)明允許使用第四種蛋白，其中這四種蛋白的三種提供針對(duì)ECB的非交叉抗性行為，并且這四種蛋白的三種提供針對(duì)FAW的非交叉抗性行為。優(yōu)選的四倍疊加是CrylFa カロ CrylBe 加CrylC, CrylD, CrylE,或 Vip3 (革巴向 FAW),加 CrylAb, Cry2A, CrylI,或 DIG-3(靶向 ECB)。同時(shí)提交的題目為“Vip3Ab用于抗性昆蟲管理的用途”提供的數(shù)據(jù)顯示Vip3Ab可用于與CrylF —起管理FAW抗性的殺蟲蛋白，并且Vip3Ab和CrylF不競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合FAW膜制備物。USSN 61/284，281 (2009 年 12 月 16 日提交)顯示了 CrylC對(duì) CrylF抗性 FAW是有活性的，而USSN 61/284，252 (2009年12月16日提交)顯示了 CrylD對(duì)CrylF抗性FAW是有活性的。這兩個(gè)申請(qǐng)也顯示CrylC不與CrylF競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合FAW膜制備物，并且CrylD不與 CrylF競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合FAW膜制備物。USSN 61/284，278 (2009 年 12 月 16 日提交)顯示了 Cry2A 對(duì) CrylF 抗性 ECB 有活性。CrylAb 在 US 20080311096 中被公開用于控制 CrylF 抗性 ECB。DIG-3 在 US 20100269223 中公開。例如，Vip3毒素，(在ー些優(yōu)選實(shí)施方式里包括Vip3Ab)列在所附的附錄A中。Cry蛋白也被列出。那些GENBANK號(hào)也可以用于獲得本文公開或提及的任何基因和蛋白的序列。本發(fā)明也常規(guī)地涉及三種殺蟲蛋白的用途(在ー些優(yōu)選實(shí)施方式里是Cry蛋白)，所述殺蟲蛋白不引起相互之間針對(duì)単一靶標(biāo)害蟲的交叉抗性。本發(fā)明也常規(guī)地涉及四種殺蟲蛋白的用途(在ー些優(yōu)選實(shí)施方式里是Cry和Vip蛋白)，其組合以提供針對(duì)兩種靶標(biāo)昆蟲的高水平控制和非交叉抗性活性。生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白的組合的植物(和種植該植物的面積)也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。也可以加入其它的毒素/基因，但是優(yōu)選的三倍和四倍(四種蛋白/基因)疊加根據(jù)本發(fā)明可以便利地和令人^(訝地提供針對(duì)FAW和/或ECB非競(jìng)爭(zhēng)性活性的三種蛋白。這會(huì)有助于減少或消除對(duì)避難所面積的需求(即，少于40%，少于20%，少于10%，少于5%，或甚至0%的避難所)。從而種植了超過10英畝的田地也包含在本發(fā)明之內(nèi)。提供的多核苷酸優(yōu)選在遺傳構(gòu)建體中并在非蘇云金芽孢桿菌啟動(dòng)子的控制(可操作地連接/包含)之下。提供的多核苷酸可以包含用于在植物中增強(qiáng)表達(dá)的密碼子。為了阻礙昆蟲發(fā)展針對(duì)CrylFa蛋白的抗性的能力，我們鑒別了不競(jìng)爭(zhēng)性(與CrylFa)結(jié)合至蛋白受體的Cry毒素。CrylFa不取代結(jié)合至位于FAW和ECB幼蟲的昆蟲腸道中的受體的CrylBe。我們發(fā)現(xiàn)CrylBe Cry蛋白或者完全結(jié)合不同受體，或者在其受體結(jié)合相比于CrylFa中僅部分重疊。這些CrylBe毒素對(duì)FAW和ECB幼蟲的能力，盡管不完全結(jié)合于CrylFa相同的受體位點(diǎn)，顯示了其毒性將不會(huì)受到這樣的昆蟲的影響，所述昆蟲發(fā)展了 CrylFa受體的遺傳改變，以作為變得對(duì)CrylFa毒性有抗性的機(jī)制。從而通過降低腸道受體結(jié)合CrylFa的能力而發(fā)展了對(duì)CrylFa抗性的昆蟲將仍然對(duì)CyrlBe蛋白敏感,后者結(jié)合其它的受體位點(diǎn)。我們獲得了生物化學(xué)數(shù)據(jù)支持這點(diǎn)。從而轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的這些蛋白的組合提供了有用的和有價(jià)值的機(jī)制以減少田地中昆蟲抗性的發(fā)展的可能性，并從而導(dǎo)致對(duì)避難所的需求減少。已經(jīng)研究了這些CrylBe蛋白對(duì)其它主要昆蟲害蟲的活性，包括對(duì)CrylFa敏感的和抗性的(rFAW和rECB)，如表I所示，CrylBe對(duì)抗性和敏感ECB幼蟲均有活性。這些數(shù)據(jù)顯示了 CrylBe毒素相比于CrylFa在昆蟲腸道中與分離的靶標(biāo)位點(diǎn)作用——從而成為優(yōu)秀的疊加成員。具有一或多種額外的Cry基因的表達(dá)疊加的CrylFa的作物，例如表達(dá)CrylBe蛋白毒素的那些，會(huì)導(dǎo)致防止昆蟲發(fā)展對(duì)表達(dá)這些蛋白毒素的轉(zhuǎn)基因植物的活性的耐受性的能力的有效管理策略。由于我們顯示了 CrylBe蛋白相比于CrylFa在不同的位點(diǎn)作用，如果抗性通過結(jié)合至Cry毒素的昆蟲腸受體的親和カ的變化而發(fā)生，該變化必須同時(shí)發(fā)生在至少兩個(gè)不同的受體上以使得昆蟲在表達(dá)多種蛋白的植物上存活。發(fā)生這種情況的可能性是非常小的，從而增加了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的持久性以防止昆蟲能夠發(fā)展對(duì)蛋白的耐受性。我們放射性碘標(biāo)記了 CrylBe蛋白的胰蛋白酶截短形式并用放射性受體結(jié)合分析技術(shù)來測(cè)量其與位于昆蟲腸膜中的推定受體蛋白的結(jié)合作用。腸膜通 過Wolfersberger的方法制備為刷狀緣膜囊(BBMV)。毒素的碘化作用通過來自Pierce Chemicals的碘珠或碘處理的試管來進(jìn)行。放射性標(biāo)記毒素的特定活性為約lliiCi/yg蛋白?；旧贤ㄟ^Liang(1995)的流程進(jìn)行了結(jié)合研究。使用標(biāo)記的CrylFa的其它競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合數(shù)據(jù)也展示在下文的實(shí)施例部分。這些數(shù)據(jù)也顯示出CrylFa和CrylBe對(duì)ECB和FAW兩者的非交叉抗性活性。本文展現(xiàn)的數(shù)據(jù)顯示相比于CrylFa，CrylBe蛋白結(jié)合昆蟲腸中的分離的靶標(biāo)位點(diǎn)。從而，這兩種蛋白會(huì)成為優(yōu)秀的疊加成員。根據(jù)本發(fā)明有用的基因和毒素包括但不僅是公開的全長(zhǎng)序列而且包括這些序列的片段，變體，突變，和融合蛋白，其保留本文特別示例的毒素的特征性殺蟲活性。如本文所用，術(shù)語(yǔ)基因的“變體”或“變異”指這樣的核苷酸序列，其編碼相同的毒素或者編碼具有殺蟲活性的等價(jià)毒素。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“等價(jià)毒素”是指具有與所要求的毒素相同或基本上相同的針對(duì)目標(biāo)害蟲的生物活性的毒素。如本文所用，邊界展現(xiàn)約95% (CrylFa的和IBe的)，78% (CrylF的和CrylB的)，和 45%(Cryl)序列同一性，參考“Revision of the Nomenclature for theBacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins，，，N. Crickmore, D. R. Zeigler,J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D. H. Dean. Microbiologyand Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62:807-813。這些切斷也可以僅提供于核心蛋白(例如，CrylFa和CrylBe核心蛋白)。示例的毒素的保留殺蟲活性的片段或等價(jià)物也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。同樣，由于遺傳密碼子的冗余性，多種不同DNA序列可以編碼本文公開的氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員能建立這些編碼同樣的，或基本上同樣的毒素的可選的DNA序列。這些變體DNA序列在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。如本文所用，涉及“基本上相同”的序列是指具有氨基酸取代、刪除、添加或插入而不從本質(zhì)上影響殺蟲活性的序列。編碼保留殺蟲活性蛋白的基因的片段也包括在該定義之內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的鑒別編碼毒素的基因和基因部分的進(jìn)ー步的方法是通過使用寡核苷酸探針。這些探針是可探測(cè)的核苷酸序列。這些序列可以通過依靠合適的放射性標(biāo)記或可以通過固有的熒光來實(shí)現(xiàn)可探測(cè)性，描述于國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朩093/16094。本領(lǐng)域公知，如果探針分子和核酸樣品通過形成兩個(gè)分子間強(qiáng)烈的堿基配對(duì)鍵而雜交，則可以推定該探針和樣品具有基本的序列同源性。優(yōu)選地，雜交是在嚴(yán)緊條件下通過本領(lǐng)域公知的技術(shù)來進(jìn)行，描述于例如 Keller, G. H. , M. M. Manak(1987)DNA Probes, Stockton Press, New York, N. Y.，pp. 169-170。鹽濃度和溫度組合的一些實(shí)例如下(為了增加嚴(yán)緊度)2X SSPE或SSC在室溫下；1X SSPE 或 SSC 在 42°C ；0. IX SSPE 或 SSC 在 42°C ；0. IX SSPE 或 SSC 在 65°C。探針的檢測(cè)提供了用已知方式確定雜交是否發(fā)生的方法。這樣的探針分析提供了鑒別本發(fā)明的毒素編碼基因的快速方法。根據(jù)本發(fā)明的用作探針的核苷酸片段可以使用DNA合成器和標(biāo)準(zhǔn)過程來合成。這些核苷酸序列也可以用做PCR弓丨物以擴(kuò)增本發(fā)明的基因。本文特別示例了本發(fā)明的某些毒素。由于這些毒素僅僅是本發(fā)明的毒素的示例，很顯然本發(fā)明包含變體或等價(jià)毒素(和編碼等價(jià)毒素的核苷酸序列)，所述等價(jià)毒素具有與示例毒素相同或類似的殺蟲活性。等價(jià)毒素具有與示例毒素的氨基酸同源性。這種氨基酸同源性典型地大于75%，優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于95%。氨基酸序列的同源性在毒素的關(guān)鍵區(qū)域是最高的，所述關(guān)鍵區(qū)域?qū)ι飳W(xué)活性起作用或者涉及三維構(gòu)象的確定，其最終也為生物活性服務(wù)。在這點(diǎn)上，某些氨基酸取代是可接受的并且是被期望的，如果這些取代在對(duì)活性不關(guān)鍵的區(qū)域或者是不影響分子的三維構(gòu)象的保守氨基酸取代。例如，氨基酸可 以位于下列類別中非極性；不帶電極性，堿性，和酸性。保守性取代，即其中ー類的ー個(gè)氨基酸替換為同樣類型的另ー個(gè)氨基酸，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要該取代不本質(zhì)上改變?cè)摶衔锏纳锘钚?。下面是屬于每個(gè)類的氨基酸的實(shí)例的列表。在一些情況下，非保守取代也可以進(jìn)行。ー個(gè)重要事實(shí)是這些取代必須不顯著損害蛋白的生物活性。
權(quán)利要求
1.轉(zhuǎn)基因植物，其包含編碼CrylBe殺蟲蛋白的DNA和編碼CrylFa殺蟲蛋白的DNA。
2.權(quán)利要求I的植物的種子。
3.權(quán)利要求I的植物，其中編碼CrylBe殺蟲蛋白的DNA和編碼CrylFa殺蟲蛋白的DNA被漸滲入所述植物。
4.權(quán)利要求3的植物的種子。.
5.植物田地，包含非-Bt避難所植物和多個(gè)權(quán)利要求I的植物，其中所述避難所植物包含所述田地中所有作物植物的少于40%。
6.權(quán)利要求5的植物田地，其中所述避難所植物占所述田地中所有作物植物的少于30%。
7.權(quán)利要求5的植物田地，其中所述避難所植物占所述田地中所有作物植物的少于20%。
8.權(quán)利要求5的植物田地，其中所述避難所植物占所述田地中所有作物植物的少于10%。
9.權(quán)利要求5的植物田地，其中所述避難所植物占所述田地中所有作物植物的少于5% o
10.權(quán)利要求5的植物田地，其中所述避難所植物是塊狀或條帶。
11.種子混合物，包含非-Bt避難所植物的避難所種子，和多個(gè)權(quán)利要求4的種子，其中所述避難所種子占混合物中全部種子的少于40%。
12.權(quán)利要求11的種子混合物，其中所述避難所種子占混合物中全部種子的少于30%。
13.權(quán)利要求11的種子混合物，其中所述避難所種子占混合物中全部種子的少于20%。
14.權(quán)利要求11的種子混合物，其中所述避難所種子占混合物中全部種子的少于10%。
15.權(quán)利要求11的種子混合物，其中所述避難所種子占混合物中全部種子的少于5%。
16.管理昆蟲對(duì)Cry毒素形成抗性的方法，所述方法包括種植種子以產(chǎn)生權(quán)利要求5的植物田地。
17.權(quán)利要求I的轉(zhuǎn)基因植物，所述植物進(jìn)ー步包含編碼包含CrylAb核心毒素的蛋白的 DNA。
18.植物田地，包含非-Bt避難所植物和多個(gè)權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述避難所植物占所述田地中所有作物植物的少于約20%。
19.包含多個(gè)權(quán)利要求17的植物的植物田地，其中所述田地包含少于約10%的避難所植物。
20.管理昆蟲對(duì)Cry毒素形成抗性的方法，所述方法包含種植種子以產(chǎn)生權(quán)利要求19的植物田地。
21.ー種控制鱗翅目害蟲的組合物，其包含細(xì)胞，所述細(xì)胞表達(dá)有效量的含CrylF核心毒素的蛋白和含CrylBe核心毒素的蛋白。
22.權(quán)利要求21的組合物，其包含宿主，所述宿主經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達(dá)CrylF蛋白和CrylBe蛋白，其中所述宿主是微生物或植物細(xì)胞。
23.控制鱗翅目害蟲的方法，包括對(duì)所述害蟲或?qū)λ龊οx的環(huán)境提供有效量的權(quán)利要求21的組合物。
24.轉(zhuǎn)基因植物，其生產(chǎn)四種源自蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白，其中所述蛋白中的三種提供針對(duì)第一種昆蟲的非交叉抗性活性，并且所述蛋白中的三種提供對(duì)第ニ種昆蟲的非交叉抗性活性。
25.權(quán)利要求24的植物，其中所述昆蟲是歐洲玉米螟和秋粘蟲。
26.轉(zhuǎn)基因植物，其產(chǎn)生CrylFa蛋白加CrylBe蛋白加第三種蛋白，所述第三種蛋白選自 CrylAb、Cry2Aa 和 CrylI 蛋白。
27.轉(zhuǎn)基因植物，其產(chǎn)生CrylFa蛋白加CrylBe蛋白加第三種蛋白，所述第三種蛋白選自 Vip3A、CrylC、CrylD 和 CrylE 蛋白。
28.轉(zhuǎn)基因植物，其產(chǎn)生CrylFa蛋白加CrylBe蛋白加第三種蛋白加第四種蛋白，所述第三種蛋白選自CrylAb、Cry2Aa和CrylI蛋白，所述第四種蛋白選自Vip3A、CrylC、CrylD和CrylE蛋白。
29.管理昆蟲對(duì)Cry毒素形成抗性的方法，所述方法包含種植種子以產(chǎn)生權(quán)利要求.24-28任意ー項(xiàng)的植物的田地。
30.植物田地，包含非-Bt避難所植物和多個(gè)24-28任意ー項(xiàng)的植物，其中所述避難所植物占所述田地中所有作物植物的少于約10%。
31.權(quán)利要求30的田地，其中所述田地包含少于約5%的避難所植物。
32.管理昆蟲對(duì)Cry毒素形成抗性的方法，所述方法包含種植種子以產(chǎn)生權(quán)利要求30或/和權(quán)利要求31的植物田地。
33.種子混合物，包含來自非-Bt避難所植物的避難所種子，和多個(gè)來自權(quán)利要求24-28任意ー項(xiàng)的植物的種子，其中所述避難所種子占混合物中所有種子的少于10%。
34.權(quán)利要求5，18和30-31中任意ー項(xiàng)的田地，其中所述植物占地超過10英畝。
35.權(quán)利要求1，2，17，24，25，26，和27-28中任意ー項(xiàng)的植物，其中所述植物選自玉米，大豆和棉花。
36.權(quán)利要求1，2，17，24，25，26，和27-28中任意ー項(xiàng)的植物，其中所述植物是玉米植物。
37.權(quán)利要求1，2，17，24，25，26，和27-28中任意ー項(xiàng)的植物的植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞包含編碼所述CrylFa殺蟲蛋白的所述DNA和編碼所述CrylBe殺蟲蛋白的所述DNA,其中所述CrylFa殺蟲蛋白具有與SEQ ID NO: I至少99%的同一性，并且所述CrylBe殺蟲蛋白具有與SEQ ID NO:2至少99%的同一性。
38.權(quán)利要求1，2，17，24，25，26，和27-28中任意ー項(xiàng)的植物，其中所述CrylFa殺蟲蛋白包含SEQ ID NO: 1，并且所述CrylBe殺蟲蛋白包含SEQ ID NO: 2。
39.權(quán)利要求1，2，17，24，25，26，和27-28中任意ー項(xiàng)的植物的植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞包含編碼所述CrylBe殺蟲蛋白的所述DNA和編碼所述CrylFa殺蟲蛋白的所述DNA,其中所述CrylBe殺蟲蛋白具有與SEQ ID NO: 2至少99%的同一性，并且所述CrylFa殺蟲蛋白具有與SEQ ID NO: I至少99%的同一性。
40.權(quán)利要求1，2，17，24，25，26，和27-28中任意ー項(xiàng)的植物，其中所述CrylBe殺蟲蛋白包含SEQ ID NO:2，并且所述CrylFa殺蟲蛋白包含SEQ ID NO: I。
41.控制選自歐洲玉米螟和秋粘蟲的昆蟲的方法，所述方法包含使所述昆蟲接觸CrylBe殺蟲蛋白和CrylFa殺蟲蛋白。
42.產(chǎn)生權(quán)利要求37或權(quán)利要求39的植物細(xì)胞的方法。
全文摘要
本發(fā)明部分地涉及疊加Cry1Be蛋白和Cry1Fa蛋白以防止昆蟲通過自身而發(fā)展針對(duì)任意一種毒素的抗性。如本文中更詳細(xì)的討論，提供的蛋白對(duì)是特別有利的組合，因?yàn)闆]有已知的其它蛋白對(duì)能提供對(duì)秋粘蟲(Spodoptera frugiperda，F(xiàn)AW)和歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis，ECB)害蟲兩者的高水平的控制和非交叉抗性。這種雙重的非交叉抗性也是有利的，因?yàn)檫@能減少多種非交叉抗性蛋白靶向這些昆蟲時(shí)所需要的蛋白/基因的數(shù)量。這能減少或消除避難所面積的需要。從而，本發(fā)明也通常地涉及使用四種基因以提供三種蛋白的對(duì)第一種昆蟲的非交叉抗性控制和三種蛋白的對(duì)第二種昆蟲的非交叉抗性。在優(yōu)選的實(shí)施方式里，靶標(biāo)昆蟲是FAW和ECB。
文檔編號(hào)A01H1/00GK102869244SQ201080064020
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2010年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月16日
發(fā)明者T.米德, K.納瓦, N.P.斯托爾, J.J.希茨, A.T.伍斯利, S.L.伯頓 申請(qǐng)人:陶氏益農(nóng)公司