專利名稱：玉米事件dp-004114-3及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的實(shí)施方式涉及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，本發(fā)明的實(shí)施方式具體地涉及用于向植物賦予昆蟲抗性的DNA構(gòu)建體。本發(fā)明的實(shí)施方式更具體地涉及抗昆蟲性玉米植物事件DP-004114-3并且涉及用于檢測樣品及其組合物中玉米事件DP-004114-3的存在的測定法。
背景技術(shù)：
本發(fā)明的實(shí)施方式涉及抗昆蟲性玉米(玉蜀黍(Zea mays))植物DP-004114-3,也稱作“玉米系DP-004114-3”、“玉米事件DP-004114-3”和“4114玉米”，并且涉及玉米植物DP-004114-3的DNA植物表達(dá)構(gòu)建體和在玉米植物DP-004114-3及其子代中檢測轉(zhuǎn)基因/·側(cè)翼插入?yún)^(qū)域。玉米是一種重要作物并且是世界許多地區(qū)的主要食物來源。盡管采用了諸如化學(xué)殺蟲劑之類的保護(hù)性措施，然而由害蟲造成的損害仍是世界范圍玉米作物損耗的主要因素。有鑒于此，已經(jīng)將抗昆蟲性基因工程化至作物如玉米中，以控制昆蟲損害并降低對傳統(tǒng)化學(xué)殺蟲劑的需要。已經(jīng)用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因抗昆蟲性作物的一組基因是來自蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis) (Bt)的δ-內(nèi)毒素類。δ -內(nèi)毒素已經(jīng)成功地表達(dá)于農(nóng)作植物如棉屬植物、馬鈴薯、稻、向日葵以及玉米中，并且已經(jīng)證明提供了優(yōu)異的病害昆蟲控制作用。(Perlak, F. J 等人，(1990) Bio/Technology 8 :939-943 ；Perlak, F. J.等人，(1993)Plant Mol. Biol. 22 :313-321 ；Fujimoto,H.等人，(1993) Bio/Technology 11 :1151-1155 ；Tu 等人，(2000) Nature Biotechnology 18 :1101-1104 ;PCT 公開 WO 01/13731 ;和 Bing，J. ff.等人，(2000) Efficacy of Cry IF Transgenic Maize, 14th Biennial InternationalPlant Resistance to Insects Workshop, Fort Collins, CO)。已知外來基因在植物中的表達(dá)受它們在植物基因組中的位置影響，這可能歸因于染色質(zhì)結(jié)構(gòu)(例如，異染色質(zhì))或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件(例如，增強(qiáng)子)密切接近于整合位點(diǎn)(Weising等人，(1988) Ann. Rev. Genet. 22 :421-477)。與此同時，轉(zhuǎn)基因在基因組中不同位置處的存在將以不同方式影響植物的總體表型。出于這個原因，經(jīng)常需要篩選大量事件，以鑒定出以導(dǎo)入的相關(guān)基因的最佳表達(dá)為特征的事件。例如，已經(jīng)在植物及在其他生物體中觀察到，在事件之間可能存在導(dǎo)入基因的表達(dá)水平的巨大差異。在表達(dá)的空間或時刻模式方面也可以存在差異，例如，轉(zhuǎn)基因在多種植物組織中相對表達(dá)方面的差異，這可能不對應(yīng)于從存在于導(dǎo)入的基因構(gòu)建體中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件所預(yù)期的模式。出于這個原因，常見的是產(chǎn)生數(shù)百至數(shù)千個不同事件，并從這些事件中篩選出具有合乎需要的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和用于商業(yè)目的模式的單一事件。利用常規(guī)育種方法，具有合乎需要的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平或模式的事件可用于將轉(zhuǎn)基因通過有性遠(yuǎn)交漸摻至其他遺傳背景中。此類雜交的子代維持原始轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)基因表達(dá)特征。使用這種策略以在充分適應(yīng)于局部生長條件的眾多品種中確?？煽康幕虮磉_(dá)。如能夠檢測特定事件的存在以確定有性雜交體的子代是否含相關(guān)的轉(zhuǎn)基因，將是有利的。此外，用于檢測特定事件的方法將有助于例如符合要求銷售前批準(zhǔn)和標(biāo)注源自重組作物植物的食品的法規(guī)，或用于環(huán)境監(jiān)測、在田間監(jiān)測作物的性狀、或監(jiān)測源自作物收獲物的產(chǎn)品、以及用于確保各方主體遵守法規(guī)條款或合同條款?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何核酸檢測方法，包括、但不限于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或使用核酸探針的DNA雜交法，來檢測轉(zhuǎn)基因的存在。這些檢測方法通常集中于頻繁使用的遺傳元件，如啟動子、終止子、標(biāo)記基因等，因?yàn)閷τ谠S多DNA構(gòu)建體而言，編碼區(qū)是可互換的。因此，此類方法可能無法用于區(qū)分不同的事件，尤其是使用相同DNA構(gòu)建體或十分相似的構(gòu)建體所產(chǎn)生的那些事件，除非已知與插入的異源DNA相鄰的側(cè)翼DNA的DNA序列。例如，美國專利No 6，395，485中描述了一種用于檢測原種事件GAT-ZMl的事件特異性PCR測定法。因此，期望擁有一種用于鑒定事件DP-004114-3的簡單而又有甄別性的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的實(shí)施方式涉及用于產(chǎn)生和選擇抗昆蟲性單子葉農(nóng)作植物的方法。更具體 地，提供了一種在植物細(xì)胞和植物中表達(dá)時賦予抗昆蟲性的DNA構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種能夠?qū)胨拗骷?xì)胞中并且在其中復(fù)制的DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體在植物細(xì)胞和植物中表達(dá)時賦予所述植物細(xì)胞和植物抗昆蟲性。玉米事件DP-004114-3由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的質(zhì)粒PHP27118轉(zhuǎn)化產(chǎn)生。該事件含有crylF，cry34Abl、cry35Abl和pat基因盒，它們賦予針對某些鱗翅目(Iepidopteran)和鞘翅目(coleopteran)害蟲的抵抗性以及對膦絲菌素耐受性。具體而言，第一盒含有截短形式的來自蘇云金芽孢桿菌鲇澤變種(Bacillusthuringiensis var. aizawai)的crylF基因。crylF基因的插入賦予針對鱗翅目害蟲損害的抗性。CrylF蛋白(SEQ ID NO I)由605個氨基酸組成并且具有大約68kDa的分子量。crylF基因的表達(dá)受玉米多聚遍在蛋白啟動子控制(Christensen等人，(1992)Plant Mol.Biol. 118(4) :675-89),從而提供CrylF蛋白在玉米中的組成型表達(dá)。該區(qū)域還包括與天然多聚遍在蛋白啟動子相連的5'非翻譯區(qū)(UTR)和內(nèi)含子。crylF基因的終止子是來自根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) Ti 質(zhì)粒 pTil5955 的開放讀框 25 (0RF 25)的聚(A)添加信號(Barker 等人，(1983)Plant Mol. Biol. 2 :335-350)。第二盒含有從蘇云金芽孢桿菌菌株P(guān)S149BS149B1分離的cry34Abl基因(美國專利 No. 6，127，180 ；No. 6，624，145 和 No. 6，340，593)。Cry34Abl 蛋白(SEQ ID NO 2)的長度是123個氨基酸并且具有大約14kDa的分子量。cry34Ab I基因的表達(dá)受帶有5' UTR和內(nèi)含子的玉米多聚遍在蛋白啟動子的第二副本控制(Christensen等人，1992,上文)。cry34Abl基因的終止子是 PinII 終止子(Keil 等人，(1986)Nucleic Acids Res. 14 :5641-5650 ;An等人，(1989)Plant Cell I :115-22)。第三基因盒含有cry35Abl基因，其也從蘇云金芽孢桿菌菌株P(guān)S149BS149B1分離而得(美國專利 No. 6，083，499 ；No. 6，548，291 和 No. 6，340，593)。Cry35Abl 蛋白(SEQ IDNO 3)具有383個氨基酸的長度和大約44kDa的分子量。Cry34Abl和Cry35Abl蛋白在植物中的同時表達(dá)賦予對鞘翅目昆蟲的抗性。cry35Abl基因的表達(dá)受普通小麥(Triticumaestivum)(小麥)過氧化物酶啟動子和前導(dǎo)序列控制(Hertig等人，(1991)Plant Mol.Biol. 16 :171-174)。cry35Abl基因的終止子是pinll終止子的第二副本(Keil等人，1986，上文；An等人，1989，上文)。第四也是最后的基因盒含有來自綠色產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesviridochromogenes)的膦絲菌素乙?；D(zhuǎn)移酶基因(pat)的已經(jīng)為玉米中表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化的形式。pat基因表達(dá)賦予膦絲菌素耐受性的膦絲菌素乙?；D(zhuǎn)移酶(PAT)。PAT蛋白(SEQ ID N04)的長度是183個氨基酸并且具有大約21kDa的分子量。pat基因的表達(dá)受來自CaMV 35S轉(zhuǎn)錄物的啟動子區(qū)和終止子區(qū)控制(Franck等人，(1980)Cell 21:285-294 ;0dell 等人，(1985)Nature 313 :810-812 ;Pietrzak 等人，(1986)Nucleic AcidsRes. 14(14) :5857-5868)。還提供了含有所述DNA構(gòu)建體的植物。根據(jù)本發(fā)明的另一個實(shí)施方式，提供了用于鑒定命名為DP-004114-3的新玉米植物的組合物和方法。所述方法基于特異性識別DP-004114-3的Y和/或:V側(cè)翼序列的引物或探針。提供了包含以下引物序列的DNA分子，其中在PCR反應(yīng)中使用時，所述引物序列將產(chǎn)生對轉(zhuǎn)基因事件DP-004114-3為獨(dú)特的擴(kuò)增子。包含這些分子的玉米植物和種子是 本發(fā)明的一個實(shí)施方式。另外，提供了使用這些引物序列以鑒定DP-004114-3事件的試劑盒。本發(fā)明的另外一個實(shí)施方式涉及本文所述的DP-004114-3的特定側(cè)翼序列，所述特定側(cè)翼序列可以用來開發(fā)針對生物學(xué)樣品中DP-004114-3的特異性鑒定方法。更具體地，本發(fā)明涉及可以用于開發(fā)特異性引物和探針的DP-004114-3的5'和/或3'側(cè)翼區(qū)。本發(fā)明的又一個實(shí)施方式涉及用于基于使用此類特異性引物或探針鑒定生物學(xué)樣品中DP-004114-3的存在的方法。根據(jù)本發(fā)明的另一個實(shí)施方式，提供了檢測樣品中對應(yīng)玉米事件DP-004114-3的DNA的存在的方法。此類方法包括(a)使包含DNA的樣品與DNA引物組接觸，當(dāng)用于具有從玉米事件DP-004114-3提取的基因組DNA的核酸擴(kuò)增反應(yīng)中時，所述DNA引物組產(chǎn)生判定玉米事件DP-004114-3的擴(kuò)增子；(b)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生所述擴(kuò)增子；以及(c)檢測所述擴(kuò)增子。根據(jù)本發(fā)明的另一個實(shí)施方式，提供了檢測樣品中對應(yīng)DP-004114-3事件的DNA分子的存在的方法，此類方法包括(a)使包含從玉米植物提取的DNA的樣品與DNA探針分子接觸，所述DNA探針分子在嚴(yán)格雜交條件下與從玉米事件DP-004114-3提取的DNA雜交并且在所述嚴(yán)格雜交條件下不與對照玉米植物DNA雜交；(b)使樣品和探針經(jīng)歷嚴(yán)格雜交條件；和(c)檢測所述探針與所述DNA的雜交。更具體地，提供了檢測樣品中對應(yīng)DP-004114-3事件的DNA分子的存在的方法，此類方法包括(a)使包含從玉米植物提取的DNA的樣品與DNA探針分子接觸，所述DNA探針分子由對于該事件為獨(dú)特的序列(例如連接序列)組成，其中所述DNA探針分子在嚴(yán)格雜交條件下與從玉米事件DP-004114-3提取的DNA雜交并且在所述嚴(yán)格雜交條件下不與對照玉米植物DNA雜交；(b)使樣品和探針經(jīng)歷嚴(yán)格雜交條件；以及(c)檢測所述探針與所述DNA的雜交。此外，提供了用于鑒定生物學(xué)樣品中的事件DP-004114-3的試劑盒和方法，其檢出DP-004114-3的特異性區(qū)域提供了包含DP-004114-3的至少一個連接序列的DNA分子；其中連接序列跨越插入基因組中的異源DNA與來自玉米細(xì)胞的分布在插入位點(diǎn)側(cè)翼的DNA (即側(cè)翼DNA)之間的接點(diǎn)并且用于判定DP-004114-3事件。
根據(jù)本發(fā)明的另一個實(shí)施方式，提供了產(chǎn)生抗昆蟲性玉米植物的方法，所述方法包括以下步驟(a)將包含賦予抗昆蟲性的本發(fā)明表達(dá)盒的第一親本玉米系和缺少抗昆蟲性的第二親本玉米系有性雜交，從而產(chǎn)生多個子代植物；以及(b)選擇抗昆蟲的子代植物。此類方法可以任選地包括又一步驟將所述子代植物與第二親本玉米系回交以產(chǎn)生抗昆蟲的純種玉米植物。本發(fā)明的又一個實(shí)施方式提供了產(chǎn)生抵抗昆蟲的玉米植物的方法，所述方法包括用DNA構(gòu)建體PHP27118轉(zhuǎn)化玉米細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化的玉米細(xì)胞培育成玉米植物，選擇顯示抗昆蟲性的玉米植物，以及進(jìn)一步將所述玉米植物培育成能育玉米植物。所述能育玉米植物可以自我授粉或與相容性玉米品種雜交以產(chǎn)生抗昆蟲性子代。本發(fā)明的另一個實(shí)施方式還涉及用于鑒定生物學(xué)樣品中玉米事件DP-004114-3的DNA檢測試劑盒。該試劑盒包括用于PCR鑒定方案中的第一引物和第二引物，所述第一引物特異性識別DP-004114-3的Y或:V側(cè)翼區(qū)，所述第二引物特異性識別在DP-004114-3的外來DNA內(nèi)部或在所述側(cè)翼DNA內(nèi)部的序列。本發(fā)明的又一個實(shí)施方式涉及用于鑒定生 物學(xué)樣品中事件DP-004114-3的試劑盒，所述試劑盒包括具有對應(yīng)下述序列或與下述序列互補(bǔ)的序列的特異性探針，所述序列與事件DP-004114-3的特定區(qū)域具有80%至100%的序列同一性。該探針的序列對應(yīng)包含事件DP-004114-3的部分5'或3'側(cè)翼區(qū)的特定區(qū)域。由本發(fā)明實(shí)施方式涵蓋的方法和試劑盒可以用于不同目的，如，但不限于以下目的鑒定植物、植物材料中或產(chǎn)品(如但不限于包含或源自植物材料的(新鮮或加工)食品或飼料產(chǎn)品)中的事件DP-004114-3 ;額外地或備選地，出于分離轉(zhuǎn)基因材料和非轉(zhuǎn)基因材料的目的，所述方法和試劑盒可以用來鑒定轉(zhuǎn)基因植物材料；額外地或備選地，所述方法和試劑盒可以用來確定包含玉米事件DP-004114-3的植物材料的品質(zhì)。所述試劑盒也可以含有為執(zhí)行該檢測方法所必需的試劑和材料。本發(fā)明的又一個實(shí)施方式涉及DP-004114-3玉米植物或其部分，包括、但不限于玉米植物DP-004114-3及源自其的子代的花粉、胚珠、營養(yǎng)細(xì)胞、花粉細(xì)胞的核和卵細(xì)胞的核。DNA引物分子從中產(chǎn)生特定擴(kuò)增子產(chǎn)物的DP-004114-3玉米植物和種子是本發(fā)明的一個實(shí)施方式。本發(fā)明的前述和其他方面將會因以下詳細(xì)描述和附圖變得更顯而易見。


圖I.帶有所示遺傳元件和Hind III限制性酶位點(diǎn)的質(zhì)粒PHP27118的示意圖。質(zhì)粒大小是549IObp (堿基對)。圖2.顯示crylF、cry34Abl、cry35Abl和pat基因(箭頭)連同它們的相應(yīng)調(diào)節(jié)元件的T-DNA的示意圖。顯示了 T-DNA內(nèi)部的Hind III限制性酶位點(diǎn)。T-DNA的大小是11978bp。圖3. DP-004114-3的轉(zhuǎn)化和發(fā)育的示意圖。圖4.在相同遺傳背景(DP-004114-3玉米，等位基因系作為陰性對照)下，在使用玉米雜種籽苗的亞致死性籽苗測定法中，西方玉米根蟲(WCRW)幼蟲發(fā)育作用。結(jié)果基于三次重復(fù)。各直方圖顯示在卵孵化17日處于三個齡期中每一齡期的幼蟲的百分?jǐn)?shù)。向齡期3偏移表示功效下降。圖5. 4114玉米中經(jīng)測序的插入?yún)^(qū)和基因組邊界區(qū)的示意圖。該圖顯示從4114玉米基因組DNA產(chǎn)生的經(jīng)克隆和測序的PCR片段片段A至F。垂直的虛線代表基因組邊界/插入接點(diǎn)。片段G和H分別代表5'和3'基因組邊界區(qū)。圖未按比例繪制。發(fā)明詳沭提供以下定義和方法以更好地限定本發(fā)明并引導(dǎo)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。除非另外說明，否則術(shù)語將根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員的常規(guī)用法進(jìn)行理解。分子生物學(xué)中常見術(shù)語的定義也可以在Rieger等人，Glossary of Genetics Classicaland Molecular,第 5 版，Springer-Verlag ；New York,1991 ；和 Lewin, Genes V, OxfordUniversity Press New York, 1994 中找到。使用如在 37CFR § I, 822 處所述的 DNA 喊基命名。下表描述本文件通篇范圍內(nèi)和尤其是實(shí)施例部分中所用的縮寫?！たs寫表

4114玉米I含有事件DP-004114-3的玉米
bp__石對_
Bi—蘇云金芽孢桿菌—
CaMV—花椰菜花葉病毒
cryW__來自蘇云金芽孢桿菌鉆譯變種的CTylF基因_
CrylF__來自ctjIF基因的蛋白質(zhì)_
cr_y34Abl一來自蘇云金芽孢桿菌菌株P(guān)S149B1的crj34Abl基因
Cry34Abl來自cr_y34Abl的蛋白質(zhì)
cry35Ab\來自蘇云金芽孢桿菌菌株P(guān)SI49BS149B1的c y35Abl基因
Cry35Abl—來自cp^Abl基因的蛋白質(zhì)—
kb__千石對_
kDa千道爾頓
LB左T-DNA邊界
pat—膦絲菌素乙醜基轉(zhuǎn)移酶基因
PAT來自膦絲菌素乙耽基轉(zhuǎn)移酶基因的蛋白質(zhì)
PCR—聚合酶鏈反應(yīng)
pinll來自馬資IiSolanum的蛋白質(zhì)酶氺P制劑II基因_
RB右T-DNA邊界
T-DNA在左邊界和右邊界之間預(yù)期轉(zhuǎn)移至植物基因組的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化質(zhì)
__粒的轉(zhuǎn)移DNA部分_
UTR非翻譯區(qū)~~
ECB歐洲玉米4占心蟲{Ostrinia nubilalis)_
FAW秋夜蛾(草地夜蛾(辦frngiperda) )_
WCRW西方玉米根蟲(玉米根螢葉甲virgifera virgifera))本公開的組合物包括以專利保藏號PTA-11506保藏的種子及源自其中的植物、植物細(xì)胞和種子。申請人已經(jīng)在2010年11月24日于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，Manassas, VA 20110-2209USA保藏了玉米事件DP-004114-3的至少2500粒種子，并且保藏物獲得ATCC保藏號PTA-11506。這些保藏物將在國際承認(rèn)用于專利程序目的的微生物保存布達(dá)佩斯條約的條款下維持。這些保藏物僅為便利于本領(lǐng)域技術(shù)人員而保存，并非承認(rèn)保藏物是在35U. S. C. §112下所要求的。2010年11月24保藏于ATCC的種子取自 Pioneer Hi-Bred International, Inc. , 7250 NW 62nd Avenue, Johnston, Iowa50131-1000所維護(hù)的保藏物。在本申請待決期間，專利商標(biāo)局首長和當(dāng)請求時由該首長決定授權(quán)的人可以取得這種保藏物。一旦本申請中的任何權(quán)利要求得到許可，根據(jù)37C.F.R. § 1.808，申請人將使公眾可獲得保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 的至少 2500 粒雜交玉米種子的保藏物樣品。玉米事件DP-004114-3的種子的這種保藏物將在作為一家公共保藏單位的ATCC保藏單位維持30年時間，或在最近請求后5年，或持續(xù)至本專利的有效期限(這將是更長時間)，并且如果在這個時間期間它變得無活力的話將予以更換。另外，申請人已經(jīng)滿足37C.F. R. § § 1，801-1，809的全部要求,包括提供該樣品在保藏時有活力的指示。申請人沒有權(quán)力放棄法律對生物材料轉(zhuǎn)移或其商業(yè)運(yùn)輸所規(guī)定的任何限制。申請人不豁免對本專利下所授予的權(quán)利或在植物品種保護(hù)法(7 USC 2321 et seq.)下適用于事件DP-004114_3的權(quán)利的任何侵犯。禁止未授權(quán)的種子繁殖。種子可以接受管理。 如本文所用，術(shù)語“包含”意指“包括但不限于”。如本文所用，術(shù)語“玉米”意指玉蜀黍或玉米(maize)，包括可以與玉米交配的全部植物品種，包括野生玉米物種。如本文所用，術(shù)語“DP-004114-3特異性”指適于區(qū)別性鑒定植物、植物材料中或產(chǎn)品(如但不限于包含或源自植物材料的(新鮮或加工)食品或飼料產(chǎn)品)中事件DP-004114-3的核苷酸序列。如本文所用，術(shù)語“抗昆蟲性”和“影響病害昆蟲”指在任何發(fā)育階段引起在昆蟲采食、生長、和/或行為方面的變化，包括但不限于殺死昆蟲；遲滯生長；阻礙繁殖能力；抑制米食；等。如本文所用，術(shù)語“殺蟲活性”和“殺昆蟲活性”同義地用來指某生物體或物質(zhì)(例如蛋白質(zhì))的可以通過眾多參數(shù)進(jìn)行測量的活性，所述參數(shù)包括、但不限于害蟲死亡率、害蟲重量減輕、害蟲吸引、害蟲排斥性和害蟲在采食和/或暴露于該生物體或物質(zhì)持續(xù)適宜的時間長度后的其他行為和身體變化。例如，“殺蟲蛋白”是本身或與其他蛋白質(zhì)組合表現(xiàn)殺蟲活性的蛋白質(zhì)?！熬幋a序列”指編碼特定氨基酸序列的核苷酸序列。如本文所用，在指定核酸的語境中使用時，術(shù)語“編碼”或“編碼的”意指所述核酸包含了指導(dǎo)核苷酸序列翻譯成所指定蛋白質(zhì)的必要信息。據(jù)以編碼蛋白質(zhì)的信息是通過使用密碼子來確定的。編碼蛋白質(zhì)的核酸可以包含在該核酸的翻譯區(qū)內(nèi)的非翻譯序列(例如內(nèi)含子)或可以缺少這種居間的非翻譯序列(例如,如在cDNA中)?！盎颉敝副磉_(dá)特定蛋白質(zhì)的核酸片段，包括位于編碼序列之前(5'非編碼序列)和之后(3'非編碼序列)的調(diào)節(jié)序列。“天然基因”指如自然界中找到那樣具有其自身調(diào)節(jié)序列的基因?！扒逗匣颉敝覆皇翘烊换?、且包含在自然界中不在一起的調(diào)節(jié)序列和編碼序列的任何基因。因此，嵌合基因可以包含源自不同來源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，或者源自相同來源、但是以不同于自然界中存在的方式排列的調(diào)節(jié)序列和編碼序列?！皟?nèi)源基因”指在生物體基因組中其天然位置內(nèi)的天然基因?！巴鈦怼敝竿ǔ２淮嬖谟谀康奈恢脙?nèi)的材料。因而“外來DNA”可以包括植物的重組DNA以及新導(dǎo)入的重排DNA。“外來”基因指通常不存在于宿主生物體中、但通過基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)入該宿主生物體中的基因。外來基因可以包括插入非天然生物體中的天然基因或嵌合基因?！稗D(zhuǎn)基因”是已經(jīng)通過轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入基因組中的基因。植物基因組中已經(jīng)插入重組DNA的位點(diǎn)可以稱作“插入位點(diǎn)”或“靶位點(diǎn)”。如本文所用，“插入DNA”指在用來轉(zhuǎn)化植物材料的表達(dá)盒內(nèi)部的異源DNA，而“側(cè)翼DNA”可以作為生物體如植物中天然存在的基因組DNA或經(jīng)轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入的相對原始插入DNA分子為外源的外來(異源)DNA(例如，與轉(zhuǎn)化事件相關(guān)的片段)而存在。如本文所用的“側(cè)翼區(qū)”或“側(cè)翼序列”指至少20bp、優(yōu)選地至少50bp和至多到5000bp的序列，其緊鄰原始外來插入DNA分子上游存在并與其保持連續(xù)或緊鄰原始外來插入DNA分子下游存在并與其保持連續(xù)。導(dǎo)致外來DNA隨機(jī)整合的轉(zhuǎn)化方法將產(chǎn)生這樣的轉(zhuǎn)化體，它們含有作為每種轉(zhuǎn)化體的特征并且為其獨(dú)有的不同側(cè)翼區(qū)。當(dāng)重組DNA經(jīng)傳統(tǒng)雜交導(dǎo)入植物時，其側(cè)翼區(qū)通常將不改變。轉(zhuǎn)化體還將在一片異源插入DNA和基因組DNA或兩片(2)基因組DNA或兩片⑵異源DNA之間含有獨(dú)特接點(diǎn)?！敖狱c(diǎn)”是兩個⑵特定DNA片段接合的點(diǎn)。例如，插入DNA接合側(cè)翼DNA之處存在的接點(diǎn)。接點(diǎn)也存在于其中兩個(2) DNA片段以不同于天然生物體中存在的方式接合在一起的轉(zhuǎn)化生物體中?！敖狱c(diǎn)DNA”指包含接點(diǎn)的DNA。本公開中所述的兩個連接序列是在玉米基因組DNA和插入物的5'末端之間的如SEQ ID NO:27中所述的接點(diǎn)和在該插入物的3'末端和玉米基因組DNA之間的如SEQ ID NO :28中所述的接點(diǎn)。如本文所用，針對核酸的“異源”為起源于外來物種的核酸，或者，如果起源于相同物種的話，則為通過蓄意的人為干預(yù)對其天然形式在組成和/或基因組基因座方面進(jìn)行了 實(shí)質(zhì)性修飾的核酸。例如，與異源核苷酸序列可操作地連接的啟動子所來自的物種可以不同于衍生該核苷酸序列的物種，或，如果來自相同物種，則該啟動子不天然地與該核苷酸序列可操作地連接。異源蛋白質(zhì)可以源自外來物種，或如果源自相同物種，則為通過蓄意的人為干預(yù)對其原始形式進(jìn)行了實(shí)質(zhì)性修飾。“調(diào)節(jié)序列”指位于編碼序列上游(5'非編碼序列)、內(nèi)部或下游(3'非編碼序列)并且影響所連接編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性、或翻譯的核苷酸序列。調(diào)節(jié)序列可以包括啟動子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、和多腺苷化作用識別序列?！皢幼印敝改軌蚩刂凭幋a序列或功能性RNA的表達(dá)的核苷酸序列。通常，編碼序列位于啟動子序列的3'。啟動子序列由近端上游元件和更遠(yuǎn)的上游元件組成，后一類元件經(jīng)常稱作增強(qiáng)子。因此，“增強(qiáng)子”是這樣的核苷酸序列，所述核苷酸序列可以刺激啟動子活性并且可以是啟動子的固有元件或經(jīng)插入以增強(qiáng)啟動子的水平或組織特異性的異源元件。啟動子可以完全源自天然基因，或由源自自然界中存在的不同啟動子的不同元件組成，或甚至包含合成性核苷酸區(qū)段。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，不同的啟動子可以引導(dǎo)基因在不同組織或細(xì)胞類型中或在不同的發(fā)育階段或應(yīng)答于不同的環(huán)境條件時表達(dá)。引起核酸片段在大部分細(xì)胞類型中在大多數(shù)時間表達(dá)的啟動子常稱作“組成型啟動子”。不斷發(fā)現(xiàn)可用于植物細(xì)胞中的多種類型的新啟動子；眾多實(shí)例可以在Okamuro和Goldberg(1989)Biochemistry of Plants 15 :1-82的匯編中找到。還認(rèn)識到，由于在大多數(shù)情況下調(diào)節(jié)序列的確切界限仍未徹底限定，因此不同長度的核酸片段可以具有相同的啟動子活性。
“翻譯前導(dǎo)序列”指位于基因啟動子序列和編碼序列之間的核苷酸序列。翻譯前導(dǎo)序列存在于翻譯起始序列上游的充分加工的mRNA中。翻譯前導(dǎo)序列可以影響眾多參數(shù)，包括初級轉(zhuǎn)錄物至mRNA的加工、mRNA穩(wěn)定性和/或翻譯效率。已經(jīng)描述了翻譯前導(dǎo)序列的實(shí)例(Turner 和 Foster (1995)Mol. Biotechnol. 3 :225-236)?！?'非編碼序列”指位于編碼序列下游和包括多腺苷化作用識別序列和編碼調(diào)節(jié)信號的其他序列的核苷酸序列，其中所述調(diào)節(jié)信號能夠影響mRNA加工或基因表達(dá)。多腺苷酸化信號通常以影響添加多腺苷酸串至mRNA前體3'末端為特征。不同的3'非編碼序列的用途由 Ingelbrecht 等人,(1989)Plant Cell I :671-680 例舉。“蛋白質(zhì)”或“多肽”是以編碼多肽的多核苷酸中編碼序列所決定的特定順序排列的氨基酸鏈。

DNA構(gòu)建體是被連接在一起的產(chǎn)生一個或多個表達(dá)盒的DNA分子的裝配物。DNA構(gòu)建體可以是能夠在細(xì)菌細(xì)胞中自我復(fù)制并且含有可用于導(dǎo)入DNA分子的多個核酸內(nèi)切酶限制性位點(diǎn)的質(zhì)粒，所述DNA分子提供功能性遺傳元件即啟動子、內(nèi)含子、前導(dǎo)序列、編碼序列、3'終止區(qū)及其他；或DNA構(gòu)建體可以是DNA分子的線性裝配物，如表達(dá)盒。包含在DNA構(gòu)建體內(nèi)的表達(dá)盒包括提供信使RNA轉(zhuǎn)錄的必需的遺傳元件。可以將表達(dá)盒設(shè)計(jì)成在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中表達(dá)。將本發(fā)明實(shí)施方式的表達(dá)盒設(shè)計(jì)成在植物細(xì)胞中表達(dá)。在用于目的生物體中表達(dá)的表達(dá)盒中提供本發(fā)明實(shí)施方式的DNA分子。該盒將包括與編碼序列可操作地連接的5'和3'調(diào)節(jié)序列?！翱刹僮鞯剡B接”意指連接的核酸序列是連續(xù)的，并且在需要接合兩個蛋白質(zhì)編碼區(qū)的情況下，是連續(xù)并且處于相同的讀框中?！翱刹僮鞯剡B接”意指表示啟動子與第二序列之間的功能性連接，其中所述啟動子序列啟動并且介導(dǎo)與第二序列相對應(yīng)的DNA序列的轉(zhuǎn)錄。該盒可以額外地含有至少一個待共轉(zhuǎn)化入生物體中的額外基因。備選地，可以在多個表達(dá)盒上提供額外的基因或多個DNA構(gòu)建體。該表達(dá)盒將在5'至3'轉(zhuǎn)錄方向上包括在充當(dāng)宿主的生物體中有功能的轉(zhuǎn)錄及翻譯起始區(qū)域、編碼區(qū)和轉(zhuǎn)錄及翻譯終止區(qū)。轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域(即，啟動子)可以是天然的或類似的，或相對于宿主生物體是外來或異源的。另外，啟動子可以是天然序列或備選地是合成序列。表達(dá)盒可以在表達(dá)盒構(gòu)建體中額外含有5'前導(dǎo)序列。此類前導(dǎo)序列可起到增強(qiáng)翻譯的作用。應(yīng)當(dāng)理解，如本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因的”包括任何細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、植物部分、或植物，其基因型已經(jīng)因異源核酸的存而改變，包括最初如此改變的那些轉(zhuǎn)基因以及通過有性雜交或無性繁殖從初始轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的那些轉(zhuǎn)基因。本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”不涵蓋通過常規(guī)植物育種方法或通過自然發(fā)生的事件(如隨機(jī)異花受精、非重組病毒感染、非重組細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或自發(fā)突變)進(jìn)行的基因組(染色體或染色體外)變更。通過以下方式產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因“事件”:用異源DNA構(gòu)建體(包括包含目的轉(zhuǎn)基因的核酸表達(dá)盒)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，由于該轉(zhuǎn)基因插入到該植物的基因組中而再生出一批植株，以及選擇以插入到特定基因組位置中為特征的特定植物。事件通過該轉(zhuǎn)基因的表達(dá)在表型上(phenotypically)得以表征。在基因?qū)哟紊峡?，事件是植物的基因?gòu)成(genetic makeup)的一部分。術(shù)語“事件”還指通過轉(zhuǎn)化體和包含異源DNA的另一個品種之間有性遠(yuǎn)交所產(chǎn)生的子代。甚至與輪回親本反復(fù)回交后，插入的DNA和來自轉(zhuǎn)化親本的側(cè)翼DNA存在于雜交子代中相同的染色體位置處。術(shù)語“事件”也指來自原始轉(zhuǎn)化體的包含所插入DNA和與插入DNA緊鄰的側(cè)翼序列的DNA，其中預(yù)期所述的DNA轉(zhuǎn)移至子代，所述子代因包括該插入DNA的一個親本系(例如，原始轉(zhuǎn)化體和因自交產(chǎn)生的子代)與不含所述插入DNA的親本系的有性雜交而接受包含目的轉(zhuǎn)基因的插入DNA?？梢酝ㄟ^以下方式繁育抗昆蟲性DP-004114-3玉米植物首先將由培育自轉(zhuǎn)基因DP-004114-3玉米植物及其子代的玉米植物組成的第一親本玉米植物與缺少抗昆蟲性的第二親本玉米植物有性雜交，從而產(chǎn)生多個第一子代植物，其中所述轉(zhuǎn)基因DP-004114-3玉米植物及其子代源自用賦予抗昆蟲性的本發(fā)明實(shí)施方式的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化；隨后選擇抵抗昆蟲的第一子代植物；將第一子代植物自交，從而產(chǎn)生多個第二子代植物；以及隨后從第二子代植物選擇抗昆蟲性植物。這些步驟可以進(jìn)一步包括將第一抗昆蟲性子代植物或第二抗昆蟲性子代植物與第二親本玉米植物或第三親本玉米植物回交，從而產(chǎn)生抵抗昆蟲的玉米植物。如本文所用，術(shù)語“植物”包括指稱完整植物、植物器官(例如，葉、莖、根等)、種子、植物細(xì)胞及其子代。應(yīng)理解為處于本發(fā)明范圍內(nèi)的轉(zhuǎn)基因植物的部分包括，例如起源于 先前用本發(fā)明DNA分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物或其子代并且因此至少部分地由轉(zhuǎn)基因細(xì)胞組成的植物細(xì)胞、原生質(zhì)體、組織、愈傷組織、胚以及花、莖、果實(shí)、葉子、和根，它們也是本發(fā)明的實(shí)施方式。本文所用的術(shù)語“植物細(xì)胞”包括但不限于種子、懸浮培養(yǎng)物、胚、分生組織區(qū)、愈傷組織、葉、根、芽苗、配子體、孢子體、花粉、和小孢子?？捎糜诒景l(fā)明方法的植物的類別通常與適于轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等植物的類別一樣寬泛，包括單子葉植物和雙子葉植物在內(nèi)?！稗D(zhuǎn)化”指核酸片段轉(zhuǎn)移至宿主生物體的基因組中，從而得到遺傳上穩(wěn)定的遺傳性。含有轉(zhuǎn)化的核酸片段的宿主生物體稱作“轉(zhuǎn)基因”生物體。植物轉(zhuǎn)化方法的實(shí)例包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法(De Blaere等人，(1987)Meth. Enzymol. 143 :277)和粒子加速或“基因槍”轉(zhuǎn)化技術(shù)(Klein 等人，(1987) Nature (London) 327 :70-73 ;美國專利 No. 4，945，050，所述文獻(xiàn)通過引用方式并入本文)。下文公開其它轉(zhuǎn)化方法。因而，可以將本發(fā)明分離出的多核苷酸并入能夠?qū)胨拗骷?xì)胞中并在其中復(fù)制的重組構(gòu)建體，一般是DNA構(gòu)建體。這種構(gòu)建體可以是載體，其包括能夠在給定宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯編碼多肽的序列的復(fù)制系統(tǒng)和序列。適用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞或適用于建立轉(zhuǎn)基因植物的眾多載體已經(jīng)在例如Pouwels等人，(1985 ；Supp. 1987)Cloning Vectors A Laboratory Manual, Weissbach 和 Weissbach(1989)Methods for Plant MolecularBiology, (Academic Press, New York);和 Flevin 等人，(1990) Plant Molecular BiologyManual, (Kluwer Academic Publishers)中描述。一般，植物表達(dá)載體包括例如一個或多個在5'和3'調(diào)節(jié)序列的轉(zhuǎn)錄性控制下的克隆的植物基因和顯性可選擇標(biāo)記。此類植物表達(dá)載體還可以含有啟動子調(diào)節(jié)區(qū)(例如，控制誘導(dǎo)型表達(dá)或組成型表達(dá)、環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)型表達(dá)、或者細(xì)胞或組織特異性表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū))、轉(zhuǎn)錄引發(fā)起始位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、RNA加工信號、轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)和/或多腺苷酸化信號。還應(yīng)該理解，也可以將兩株不同的轉(zhuǎn)基因植株交配以產(chǎn)生含有兩個獨(dú)立分離、添加的外源基因的子代。合適子代的自交可產(chǎn)生針對該兩個所加入的外源基因而言均是純合的植物。還設(shè)想與親本植株的回交和與非轉(zhuǎn)基因植株的遠(yuǎn)交，還有無性繁殖。有關(guān)常用于不同性狀和作物的其他育種方法的描述，可在幾個參考文獻(xiàn)之一中找到，例如Fehr，在Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcos J.編著，American Society ofAgronomy, Madison ffis. (1987)中?！疤结槨笔桥c常規(guī)的可檢測標(biāo)記或報道分子(如放射性同位素、配體、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、或酶)連接的分離的核酸。這種探針與靶核酸的鏈互補(bǔ)，在本發(fā)明的情況下，與來自玉米事件DP-004114-3的分離出來的DNA的鏈互補(bǔ)，無論其是來自玉米植物還是來自包括來自該事件的DNA的樣品。根據(jù)本發(fā)明的探針包含與靶DNA序列特異性結(jié)合并且可以用來檢測這種靶DNA序列存在的脫氧核糖核酸或核糖核酸和聚酰胺及其他探針材料?！耙铩笔欠蛛x的核酸，其通過核酸雜交與互補(bǔ)性靶DNA鏈退火以形成引物和靶DNA鏈之間的雜交體，隨后由聚合酶(如DNA聚合酶)沿靶DNA鏈延伸。本發(fā)明的引物對指它們用于擴(kuò)增靶核酸序列的用途，例如，通過PCR或其他常規(guī)的核酸擴(kuò)增方法?！癙CR”或“聚合酶鏈反應(yīng)”是用于擴(kuò)增特定DNA區(qū)段的技術(shù)(見，美國專利No. 4，683，195和No. 4，800, 159 ；所述專利通過引用方式并入本文)。
探針和引物要有足夠的核苷酸長度，以在操作員確定的雜交條件或反應(yīng)條件下與靶DNA序列特異性地相結(jié)合。該長度可以是任何長度，其是在選擇的檢測方法中有用的足夠長度。通常，使用11個或更多個核苷酸的長度、18個或更多個核苷酸的長度、和22個或更多個核苷酸的長度。此類探針和引物在高嚴(yán)格性雜交條件下與靶序列特異性雜交。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的探針和引物可以與靶序列具有完全的連續(xù)核苷酸DNA序列相似性，不過可以通過常規(guī)方法設(shè)計(jì)與靶DNA序列不同并保持與靶DNA序列雜交的能力的探針。探針可以作為引物使用，不過通常設(shè)計(jì)成與靶DNA或RNA結(jié)合并且不用于擴(kuò)增過程中。特異性引物可以用來擴(kuò)增整合片段以產(chǎn)生可以作為鑒定生物學(xué)樣品中事件DP-004114-3的“特異性探針”使用的擴(kuò)增子。當(dāng)探針與生物學(xué)樣品的核酸在允許探針與該樣品結(jié)合的條件下雜交時，這種結(jié)合可以被檢測到并因而允許指示事件DP-004114-3在生物學(xué)樣品中存在。已經(jīng)在本領(lǐng)域中描述了對結(jié)合的探針的這種鑒定。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，所述特異性探針是這樣的序列，該序列在優(yōu)化條件下與所述事件的5,或3,側(cè)翼區(qū)內(nèi)部的區(qū)域特異性雜交并且還包含與該區(qū)域連續(xù)的外來DNA的部分。特異性探針可以包含與該事件的特定區(qū)域至少80 %、80 %至85 %、85 %至90 %、90 %至95 %、和95 %至100 %相同(或互補(bǔ))的序列。用于制備和使用探針和引物的方法例如在Sambrook等人，Molecular Cloning A Laboratory Manual,第 2 版，第 1-3 卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, N. Y. 1989 (下文為 “Sambrook 等人，1989”) ；Ausubel 等人編著，CurrentProtocola in Molecular Biology, Greene Publishing 和 Wiley-Interscience, NewYork, 1995 (定期更新)(下文為 “Ausubel 等人，1995” );和 Innis 等人，PCR Protocols AGuide to Methods and Applications, Academic Press :San Diego, 1990 中描述。PCR 引物對可以從已知的序列衍生，例如，通過使用意圖用于此目的的計(jì)算機(jī)程序如Vector NTI版本 6 中的 PCR 引物分析工具(Informax Inc. , Bethesda MD) ；PrimerSelect (DNASTARInc. , Madison, WI);和 Primer (版本 0· 5 , 1991, Whitehead Institute for BiomedicalResearch, Cambridge, Mass.)。另外,還可以目視地掃描序列，并可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的指南手工地確定引物。如本文中所用的“試劑盒”指一組試劑，它們意在實(shí)施本發(fā)明的方法實(shí)施方式，更具體地是鑒定生物學(xué)樣品中的事件DP-004114-3。本發(fā)明的試劑盒可以用于以下目的，并且其組分可以為以下目的而專門調(diào)整質(zhì)量控制(例如，種子批的純度)、檢測植物材料或包含或源自植物材料的材料(如但不限于食品或飼料產(chǎn)品)中的事件DP-004114-3。如本文中所用，“植物材料”指從植物獲得或衍生的材料。通過常規(guī)方法例如通過將此類序列再克隆和測序，基于本文中公開的側(cè)翼DNA和插入物序列的引物和探針可以用來證實(shí)(并且，根據(jù)需要，校正)公開的序列。本發(fā)明的核酸探針和引物在嚴(yán)格條件下與靶DNA序列雜交。可以用任何常規(guī)的核酸雜交或擴(kuò)增方法來鑒定樣品中來自轉(zhuǎn)基因事件的DNA的存在。核酸分子或其片段能夠在某些環(huán)境下與其他核酸分子特異性地雜交。如本文所用，如果兩個核酸分子能夠形成反平行雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，則稱這兩個分子能夠彼此特異性雜交。如果兩個核酸分子顯示出完全互補(bǔ)性，則稱其中一個核酸分子是另一個核酸分子的“互補(bǔ)物”。如本文所用，當(dāng)某分子的每一個核苷酸均與另一個分子的核苷酸互補(bǔ)時，則稱該分子顯示出“完全互補(bǔ)性”。如果兩個分子可以在至少常規(guī)“低嚴(yán)格性”條件下以足夠穩(wěn)定性彼此雜交，并它們?nèi)詾闊o內(nèi)應(yīng)力(退火)的，則稱這兩個分子是“最小互補(bǔ)的”。類·似地，如果兩個分子可以以允許它們在常規(guī)“高嚴(yán)格性”條件下保持彼此無內(nèi)應(yīng)力且足夠穩(wěn)定地彼此雜交，則稱這兩個分子是“互補(bǔ)的”。常規(guī)的嚴(yán)格性條件由Sambrook等人，1989并且由 Haymes 等人，在Nucleic Acid Hybridization, a Practical Approach, IRL Press,Washington,D. C. (1985)中描述，偏離完全互補(bǔ)性因此是允許的，只要此類偏離沒有徹底地排除分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)的能力。為了充當(dāng)引物或探針，核酸分子僅需要在序列上足夠互補(bǔ)以能夠在所用的特定溶劑和鹽濃度下形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。在雜交反應(yīng)中，特異性通常決定于雜交后的洗滌，關(guān)鍵因素為最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度。熱解鏈溫度(Tm)是(在限定的離子強(qiáng)度和pH時)50%互補(bǔ)性靶序列與完全匹配的探針雜交的溫度。對于DNA-DNA雜交體，Tm可以從Meinkoth和Wahl (1984) Anal.Biochem. 138 :267-284 的等式近似獲得Tm = 81. 5°C +16. 6 (log Μ) +0. 41(% GC) -O. 61(%form)-500/L ;其中M為單價陽離子的摩爾濃度，％ GC為DNA中鳥嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分?jǐn)?shù)，％ form為雜交溶液中甲酰胺的百分?jǐn)?shù)，L為雜交體的長度(單位為堿基對)。Tffl因每1%錯配下降約1°C ;因此，可以調(diào)節(jié)Tm、雜交、和/或洗滌條件以與具有所需同一性的序列雜交。例如，如果尋求具有>90%同一性的序列，則可將Tm降低10°C。通常，將嚴(yán)格條件選擇為比特定序列及其互補(bǔ)序列在確定的離子強(qiáng)度和PH下的Tm低約5°C。然而，極嚴(yán)格條件可以利用比Tm低1、2、3或4°C的雜交和/或洗滌；中等嚴(yán)格條件可以利用比Tm低6、7、8、9或10°C的雜交和/或洗滌；低嚴(yán)格條件可以利用比Tm低11、12、13、14、15或20°C的雜交和/或洗滌。利用該公式，雜交和洗滌組成以及所需的Tm，普通技術(shù)人員將認(rèn)識到，雜交和/或洗滌溶液的嚴(yán)格性的變化固有地得到了描述。如果所需的錯配程度導(dǎo)致^低于45°C (水溶液)或32°C (甲酰胺溶液)，則優(yōu)選增加SSC濃度以使得可以使用更高的溫度。對核酸雜交的廣泛指導(dǎo)存在于 Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistryand Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes,第 I 部分，第 2 章(Elsevier, New York);和 Ausubel 等人編著(1995)和 Sambrook 等人，(1989)中。如本文所用，基本上同源的序列是這樣的核酸分子，其將在高嚴(yán)格條件下特異性雜交至與其比較的核酸分子互補(bǔ)物。促進(jìn)DNA雜交的適宜嚴(yán)格性條件，例如，約45°C下的6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，隨后50°C下2XSSC洗滌，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，或可以在Ausubel等人，(1995),6. 3. 1-6. 3. 6中找到。通常，嚴(yán)格條件將為其中鹽濃度低于約I. 5M鈉離子，通常為約O. Ol至I. OM鈉離子濃度(或其他鹽)，pH為7. O至8. 3，對短探針(例如，10至50個核苷酸)而言溫度為至少30°C，對長探針(例如超過50個核苷酸)而言溫度為至少約60°C的那些條件。嚴(yán)格條件還可通過添加去穩(wěn)定劑如甲酰胺來實(shí)現(xiàn)。示例性的低嚴(yán)格性條件包括在用30%至35%甲酰胺、IM NaClU % SDS (十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液37°C下雜交，并在IX至2X SSC (20X SSC = 3. OM NaCl/0. 3M檸檬酸三鈉)中在50°C至55°C下洗滌。示例性的中等嚴(yán)格性條件包括在40%至45%甲酰胺、IM NaClU% SDS中在37°C下雜交和在O. 5X至IX SSC中在55°C至60°C下洗滌。示例性的高嚴(yán)格性條件包括在50%甲酰胺、IM NaCl、l% SDS中在37°C下雜交和在O. IX SSC中在60°C至65°C下洗滌。本發(fā)明的核酸可以在中等嚴(yán)格條件下與一個或多個對DP-004114-3事件為獨(dú)特的核酸分子或其互補(bǔ)物、或它們?nèi)我徽叩钠翁禺愋缘仉s交。將序列進(jìn)行比對以作比較的方法是本領(lǐng)域公知的。因此，可以使用計(jì)算機(jī)數(shù)·學(xué)算法完成任意兩個序列之間同一性百分比的確定。此類數(shù)學(xué)算法的非限制性實(shí)例是Myers 和 Miller (1988)CABIOS 4 :11-17 的算法；Smith 等人，(1981)Adv. Appl. Math. 2 482 的局部同源性算法；Needleman 和 Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48 :443-453 的同源性比對算法；Pearson 和 Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85 :2444-2448 的檢索相似性方法；Karlin 和 Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :2264 的算法，如 Karlin 和Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873-5877 中那樣修正后的算法。可利用這些數(shù)學(xué)算法的計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行序列的比較，從而確定序列同一性。此類程序包括、但不限于PC/Gene 程序(從 Intelligenetics, Mountain View, California 可獲得)中的CLUSTAL ；ALIGN程序(2. O版本);ALIGN PLUS程序(版本3. 0，版權(quán)1997);和Wisconsin Genetics 軟件包，版本 10 (從 Accelrys, 9685 Scranton Road, San Diego, CA92121，USA可獲得)中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用這些程序的序列比對可用默認(rèn)參數(shù)來進(jìn)行。CLUSTAL 程序由 Higgins 和 Sharp, Gene 73:237-244(1988) ;Higgins 和 Sharp,CABIOS 5 :151-153(1989) ;Corpet，等人，Nucleic Acids Research 16:10881-90(1988)；Huang,等人，Computer Applications in the Biosciences 8 155-65 (1992)和 Pearson,等人，Methods in Molecular Biology 24 :307-331 (1994)充分描述。ALIGN和 ALIGN PLUS程序基于上文的 Myers 和 Miller (1988)算法。Altschul 等人,(1990) J. Mo I.Biol. 215 403的BLAST程序基于上文的Karlin和Altschul (1990)算法?？捎糜跀?shù)據(jù)庫相似性搜索的BLAST家族程序程序包括BLASTN，用于核苷酸查詢序列針對核苷酸數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行查詢；BLASTX，用于核苷酸查詢序列針對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行查詢；BLASTP，用于蛋白質(zhì)查詢序列針對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行查詢；TBLASTN，用于蛋白質(zhì)查詢序列針對核苷酸數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行查詢jPTBLASTX，用于核苷酸查詢序列針對核苷酸數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行查詢。見，Ausubel，等人，(1995)。比對可以通過視檢法手工地進(jìn)行。為獲得用于比較目的空位比對結(jié)果，空位BLAST(在BLAST 2. O中)可以如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res. 25 :3389中所述那樣使用。或者，可使用PSI-BLAST(在BLAST 2. O中)來進(jìn)行迭代搜索，該搜索可檢測分子之間的遠(yuǎn)源關(guān)系。見上文 Altschul 等人，(1997)。當(dāng)采用 BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST 時，可使用各個程序的默認(rèn)參數(shù)(例如BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白質(zhì))。如本文所用，在兩個核苷酸序列或多肽序列的場合下，“序列同一性”或“同一性”意指在對指定的比較窗口范圍內(nèi)的最大對應(yīng)性進(jìn)行比對時，這兩個序列中殘基的相同程度。當(dāng)把序列同一性百分?jǐn)?shù)運(yùn)用于蛋白質(zhì)時，應(yīng)認(rèn)識到，不相同的殘基位置往往差別僅在于保守氨基酸發(fā)生了置換，其中氨基酸殘基被其他具有相似的化學(xué)性質(zhì)(例如電荷或疏水性)的氨基酸殘基所置換，因此不會改變分子的功能性質(zhì)。當(dāng)序列差別在于保守置換，則可上調(diào)百分比序列同一性，以對此種置換的保守性質(zhì)進(jìn)行校正。將由于此類保守性置換而不同的序列稱作具有“序列相似性”或“相似性”。用于進(jìn)行這種調(diào)整的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。通常，這涉及將保守置換打分為部分錯配而不是完全錯配，從而提高序列同一性百分?jǐn)?shù)。因而，例如，如果相同的氨基酸給予I分，非保守置換給予O分，則保守置換給予O至I之間的分?jǐn)?shù)。保守置換的打分是例如如在程序PC/GENE (Intelligenetics, MountainView, California)中所執(zhí)行那樣進(jìn)行計(jì)算。
本文所用的“序列同一性百分?jǐn)?shù)”意指通過在比較窗口上比較兩個最佳比對的序列所確定的數(shù)值，其中多核苷酸序列在比較窗口中的部分與參考序列(不包含添加或缺失)相比包含添加或缺失(即空位)，以便兩個序列的最佳比對。該百分?jǐn)?shù)是這樣計(jì)算的確定在兩個序列中出現(xiàn)相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)目以得到匹配的位置的數(shù)目，將匹配的位置的數(shù)目除以比較窗口中的位置的總數(shù)目，然后將結(jié)果乘以100以得到序列同一性百分?jǐn)?shù)。就使用特定擴(kuò)增引物擴(kuò)增靶核酸序列(例如，通過PCR)而言，“嚴(yán)格條件”是允許所述引物對僅與靶核酸序列雜交并且優(yōu)選地允許在DNA熱擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生特定擴(kuò)增產(chǎn)物即擴(kuò)增子的條件，其中具有相應(yīng)野生型序列(或其互補(bǔ)序列)的引物將與所述靶核酸序列
彡口口 術(shù)語“對靶序列特異的”表示探針或引物在嚴(yán)格雜交條件下僅與包含括靶序列的樣品中的靶序列雜交。如本文所用，“擴(kuò)增的DNA”或“擴(kuò)增子”指作為核酸模板的部分的靶核酸序列的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物。例如，為確定因有性雜交產(chǎn)生的玉米植物是否含有來自本發(fā)明玉米植物的轉(zhuǎn)基因事件基因組DNA，可以使從玉米植物組織樣品提取的DNA接受使用DNA引物對的核酸擴(kuò)增方法處理，以產(chǎn)生判定所述事件DNA存在的擴(kuò)增子，其中所述DNA引物對包括第一引物和第二引物，所述第一引物源自與插入的異源DNA的插入位點(diǎn)相鄰的側(cè)翼序列，所述第二引物源自插入的異源DNA。備選地，第二引物可以源自側(cè)翼序列。所述擴(kuò)增子具有還可據(jù)以判定所述事件的長度和序列。擴(kuò)增子的長度可以在所述引物對外加一個核苷酸堿基對的聯(lián)合長度至通過DNA擴(kuò)增方案可產(chǎn)生的任何擴(kuò)增子長度的范圍內(nèi)。備選地，引物對可以源自插入的DNA兩側(cè)的側(cè)翼序列，從而產(chǎn)生這樣的擴(kuò)增子，所述擴(kuò)增子包括PHP27118表達(dá)構(gòu)建體的完整插入物核苷酸序列以及在轉(zhuǎn)基因插入物側(cè)翼的序列。源自側(cè)翼序列的引物對的成員可以與插入的DNA序列相隔一段距離存在，這個距離的范圍可以是I個核苷酸堿基對直至擴(kuò)增反應(yīng)的限值，或是約20，OOObp0術(shù)語“擴(kuò)增子”的使用特別地排除了可以在DNA熱擴(kuò)增反應(yīng)中形成的引物二聚體。
核酸擴(kuò)增可以通過本領(lǐng)域已知的多種核酸擴(kuò)增方法(包括PCR)中任一種來完成。多種擴(kuò)增方法是本領(lǐng)域已知的并且尤其在美國專利No. 4，683，195和No. 4，683，202和在上文Innis等人(1990)中描述。已經(jīng)開發(fā)了 PCR擴(kuò)增方法以擴(kuò)增多到22Kb的基因組DNA和多到 42Kb 的噬菌體 DNA (Cheng 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :5695-5699,1994)。這些方法以及本領(lǐng)域已知擴(kuò)增DNA的其他方法可以用于本發(fā)明實(shí)施方式的實(shí)施中。應(yīng)當(dāng)理解特定PCR方案中的眾多參數(shù)可能需要針對具體的實(shí)驗(yàn)室條件進(jìn)行調(diào)整并且可以略作修改并仍允許獲得相似的結(jié)果。這些調(diào)整對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。可以通過多項(xiàng)技術(shù)檢測出由這些方法產(chǎn)生的擴(kuò)增子，所述技術(shù)包括、但不限于遺傳比特分析法(Nikiforov,等人，Nucleic Acid Res. 22 :4167-4175,1994),其中設(shè)計(jì)了與相鄰的側(cè)翼DNA序列和插入的DNA序列均重疊的DNA寡核苷酸。將該寡核苷酸固定于微量多孔平板的孔中。在對擴(kuò)增目的區(qū)進(jìn)行了 PCR反應(yīng)(用一個位于插入序列內(nèi)的引物和一個位于相鄰的側(cè)翼序列內(nèi)的引物)后，單鏈PCR產(chǎn)物可以與固定的寡核苷酸雜交并且充當(dāng)單堿基延伸反應(yīng)的模板，所述單堿基延伸反應(yīng)使用DNA聚合酶和對下一個預(yù)期堿基特異的標(biāo)記的ddNTP。讀出可以是熒光的或基于ELISA的。信號指示出因成功擴(kuò)增、雜交、和單堿基 延伸而存在插入物/側(cè)翼序列。另一個檢測方法是如Winge (2000) Innov. Pharma. Tech. 00 :18_24 描述的焦憐酸測序技術(shù)。在這個方法中，設(shè)計(jì)了與相鄰DNA和插入DNA接點(diǎn)重疊的寡核苷酸。將所述寡核苷酸與來自目的區(qū)域(一個位于插入序列內(nèi)的引物和一個位于側(cè)翼序列內(nèi)的引物)的單鏈PCR產(chǎn)物雜交并且在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、螢光素酶、腺苷三磷酸雙磷酶、腺苷5'磷酸硫酸鹽和螢光素存在下孵育。單獨(dú)添加dNTP并且該摻入產(chǎn)生可測量的光信號。光信號指示因成功擴(kuò)增、雜交和單堿基或多堿基延伸而存在轉(zhuǎn)基因插入物/側(cè)翼序列。如Chen等人，(1999)Genome Res. 9 :492-498描述的熒光偏振法也是可以用來檢測本發(fā)明擴(kuò)增子的方法。使用這種方法時，設(shè)計(jì)與側(cè)翼和插入DNA接點(diǎn)重疊的寡核苷酸。將所述寡核苷酸與來自目的區(qū)域(一個位于插入的DNA內(nèi)的引物和一個位于側(cè)翼DNA序列內(nèi)的引物)的單鏈PCR產(chǎn)物雜交并且在DNA聚合酶和熒光標(biāo)記的ddNTP存在下孵育。單堿基延伸導(dǎo)致該ddNTP的摻入。摻入可以使用熒光計(jì)度量為偏振的變化。偏振的變化指示因成功擴(kuò)增、雜交和單堿基延伸而存在轉(zhuǎn)基因插入物/側(cè)翼序列。Taqman (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.)被描述為檢測和量化DNA序列存在的方法并且在制造商提供的說明書中充分解釋。簡而言之，設(shè)計(jì)了與側(cè)翼和插入DNA接點(diǎn)重疊的FRET寡核苷酸探針。FRET探針和PCR引物(一個位于插入DNA序列內(nèi)的引物和一個位于側(cè)翼基因組內(nèi)的引物)在熱穩(wěn)定聚合酶和dNTP存在下循環(huán)。FRET探針的雜交導(dǎo)致切割熒光部分并且使其釋放遠(yuǎn)離FRET探針上的淬滅部分。熒光信號指示因成功擴(kuò)增和雜交而存在側(cè)翼/轉(zhuǎn)基因插入物序列。已經(jīng)描述了用于序列檢測的分子信標(biāo)，如Tyangi等人,(1996) NatureBiotech. 14 =303-308中所述。簡而言之，設(shè)計(jì)了與側(cè)翼和插入DNA接點(diǎn)重疊的FRET寡核苷酸探針。FRET探針的獨(dú)特結(jié)構(gòu)導(dǎo)致它含有使得熒光部分和淬滅部分緊密靠近的二級結(jié)構(gòu)。FRET探針和PCR引物(一個位于插入DNA序列內(nèi)的引物和一個位于側(cè)翼序列內(nèi)的引物)在熱穩(wěn)定聚合酶和dNTP存在下循環(huán)。在成功PCR擴(kuò)增后，F(xiàn)RET探針與靶序列的雜交導(dǎo)致消除探針二級結(jié)構(gòu)以及熒光部分和淬滅部分的空間分隔。熒光信號產(chǎn)生。熒光信號指示因成功擴(kuò)增和雜交而存在側(cè)翼/轉(zhuǎn)基因插入物序列。
使用對擴(kuò)增子內(nèi)部存在的序列特異的探針的雜交反應(yīng)是用來檢測由PCR反應(yīng)產(chǎn)生的擴(kuò)增子的又一個方法。玉米事件DP-004114-3能有效對抗昆蟲害蟲，所述昆蟲害蟲包括選自鞘翅目(Coleoptera)、雙翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鱗翅目(Lepidoptera)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthoptera)、纟嬰翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、風(fēng)目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等的昆蟲，尤其包括選自鞘翅目和鱗翅目的昆蟲。鱗翅目昆包括、但不限于夜蛾科(Noctuidae)中的夜蛾、地老虎、尺蠖、和實(shí)夜蛾小地老虎(Agrotis ipsilon Hufnagel)(黑地老虎);灰地老虎(A. o rthogoniaMorrison)(西部地老虎);黃地老虎(A. segetum Denis & Schiffermiiller)(蔓青蛾)；粒膚地老虎(A. subterranea Fabricius)(粒膚地香)；葉波紋須蛾(Alabama argillaceaHiibner)(棉葉蟲)；黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis Hiibner)(黎豆毛蟲);粗皮夜蛾(Athetis mindara Barnes and McDunnough)(粗皮地香)；棉斑實(shí)蛾(Earias insulanaBoisduval)(多剌螟嶺(spiny bollworm));翠紋金剛鉆(E. vittella Fabricius)(斑點(diǎn)螟嶺(spotted bollworm));柑橘棲夜蛾(Egira (Xylomyges) curialis Grote)(柑橘地老虎)；暗緣地老虎(Euxoa messoria Harris) (darksided cutworm);蕃煎夜蛾(Helicoverpaarmigera Hiibner)(美洲螟嶺(American bollworm));谷實(shí)夜蛾(H. zea Boddie)(美洲棉鈴蟲(corn earworm)或棉鈴蟲(cotton bollworm));煙芽夜蛾(Heliothis virescensFabricius)(煙青蟲(tobacco budworm));苜猜綠葉蛾(Hypena scabra Fabricius) (greencloverworm) ；Hyponeuma taltula Schaus ;稽帶夜蛾(Mamestra configurata Walker)(bertha armyworm);甘藍(lán)夜蛾(Μ· brassicae Linnaeus) (cabbage moth);斑馬紋夜蛾(Melanchra picta Harris) (zebra caterpillar);小毛腔夜蛾(Mocis latipes Guenee)(small mocis moth));普通夜盜蛾(Pseudaletia unipuncta Haworth)(夜蛾);大豆夜蛾(Pseudoplusia includens Walker)(大豆尺蠖)；西部豆類夜盜蟲(Richia albicostaSmith) (Western bean cutworm);草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda JE Smith)(秋夜蛾)；甜菜夜蛾(S. exigua Hiibner) (beet armyworm);斜紋貪夜蛾(S. Iitura Fabricius)(tobacco cutworm，cluster caterpillar);粉紋夜蛾(Trichoplusia ni Hiibner)(卷心菜尺蠖)；來自螟蛾科(Pyralidae)和草螟科(Crambidae)的鉆心蟲、鞘蛾、結(jié)網(wǎng)蟲(webworm)、球果蛾(coneworm)、和雕葉蟲(skeletonizer)，如小錯螟(Achroia grisellaFabricius)(lesser wax moth);胳禮螟蛾(Amyelois transitella Walker)(navalorangeworm);地中海粉螟蛾(Anagasta kuehniella Zeller) (Mediterranean flourmoth);粉斑螟蛾(Cadra cautella Walker) (almond moth);粉紅禾草螟(Chilo partellusSwinhoe)(斑點(diǎn)姓莖蟲(spotted stalk borer)) ;二化螟(C. suppressalis Walker)(條紋蟲主莖蟲/稻鉆心蟲(striped stem/rice borer)) ；C. terrenellus Pagenstecher (甘鹿蟲主莖蟲(sugarcane stem borer));外米綴蛾(Corcyra cephalonica Stainton)(米蛾(rice moth));玉米根草螟(Crambus caliginosellus Clemens) (corn root webworm);早熟禾草螟(C. teterrellus Zincken) (bluegrass webworm);稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocismedinalis Guen6e)(稻卷葉蟲(rice leaf roller));葡萄野螟(Desmia funeralisHiibner)(葡萄卷葉蟲(grape leaffolder));甜瓜絹野螟(Diaphania hyalinataLinnaeus)(melon worm) ；D.nitidalis Stoll (pickleworm) ；Diatraea flavipennellaBox ;西南玉米螟(D. grandiosella Dyar)(西南玉米鉆心蟲(southwestern corn borer))、小鹿螟(D. saccharalis Fabricius)(甘鹿鉆心蟲(surgarcane borer));南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus Zeller)(小玉米莖鉆心蟲(lesser cornstalk borer))；墨西哥稻螟(Eoreuma llftini Dyar) (Mexican rice borer);煙草粉螟(Ephestiaelutella Hiibner)(煙草(cacao)飛蛾)；大錯螟(Galleria mellonella Linnaeus)(greater wax moth);甘鹿卷葉蛾(Hedylepta accepta Butler)(甘鹿卷葉蟲)；水稻切葉野螟(Herpetogramma licarsisalis Walker) (sod webworm);向日葵同斑螟(Homoeosomaelectellum Hulst)(向日葵螟)；草地螟(Loxostege sticticalis Linnaeus) (beetwebworm);紅豆莢螟(Maruca testulalis Geyer) (bean pod borer);荼樹螟(Orthagathyrisalis Walker) (tea tree web moth);玉米螟(Ostrinia nubilalis Hiibner)(歐洲玉米鉆心蟲(European corn borer));印度谷螟(Plodia interpunctella Hiibner)(印 度谷蛾(Indian meal moth));三化螟(Scirpophaga incertulas Walker) (yellow stemborer);序菜網(wǎng)螟(Udea rubigalis Guen6e)(序菜葉蟲(celery leaftier));和卷蛾科(Tortricidae)的卷葉蟲、姆蟲、種實(shí)蟲以及果實(shí)蟲，西部黑頭長翅卷蛾(TortricidaeAcleris gloverana Walsingham) (Western blackheaded budworm);東部黑頭長翅卷蛾(A. variana Fernald) (Eastern blackheaded budworm);棉褐帶卷葉蛾(Adoxophyesorana Fischer von Rosslerstamm) (summer fruit tortrix moth);黃卷蛾屬(Archips)物種，包括果樹黃卷蛾(A. argyrospila Walker)(果樹卷葉蟲(fruit tree leaf roller))和歐洲卷葉蛾(A. rosana Linnaeus) (European leaf roller) ;Argyrotaenia 屬物種；巴西蘋果卷葉蟲(Bonagota salubricola Meyrick) (Brazilian apple leafroller);色卷蛾屬(Choristoneura)物種；條紋向日葵螟(Cochylis hospes Walsingham) (bandedsunflower moth);棒小卷蛾(Cydia latiferreana Walsingham) (filbertworm);蘋果蠹蛾(C. pomonella Linnaeus) (codling moth);萄果實(shí)蟲主蟲(Endopiza viteana Clemens)(grape berry moth);女貞細(xì)卷蛾(Eupoecilia ambiguella Hiibner) (vine moth)；梨小食心蟲(Grapholita molesta Busck) (oriental fruit moth);歐洲葡萄小卷葉蛾(Lobesia botrana Denis)&Schiffermiiller(European grape vine moth);雜色卷葉蛾(Platynota flavedana Clemens) (variegated leafroller);荷蘭石竹小卷蛾(P. stultana Walsingham) (omnivorous leafroller);蘋白小卷蛾(Spilonota ocellanaDenis)&Schiffermiiller(eyespotted bud moth);和向日葵芽蛾(Suleima helianthanaRiley) (sunflower bud moth)。鱗翅目中選擇的其他農(nóng)藝學(xué)害蟲包括\但不限于秋星尺蠖(Alsophila pometariaHarris) (fall cankerworm);桃枝麥蛾(Anarsia lineatella Zeller) (peach twigborer);犀客頁蛾(Anisota senatoria J. E. Smith)(orange striped oakworm)；作香(Antheraeapernyi Guerin-MeneviIle)(Chinese Oak SiIkmoth)；家 ^ (Bombyx moriLinnaeus) (Silkworm);棉潛蛾(Bucculatrix thurberiella Busck) (cotton leafperforator);苜猜黃蝶(Colias eurytheme Boisduval) (alfalfa caterpillar);古月桃黃蝶(Grote & Robinson) (walnut caterpillar);落葉松毛蟲(Dendrolimus sibiricusTschetwerikov) (Siberian silk moth)， 白尺蠖(Ennomos subsignaria Hiibner)(elm spanworm);菩提尺蠖(Erannis tiliaria Harris) (linden looper) ；Erechthiasflavistriata Walsingham(sugarcane bud moth);黃毒蛾(Euproctis chrysorrhoeaLinnaeus)(browntail moth);黑 嶺蛾(Harrisina americana Guerin-MeneviIle)(grapeleaf skeletonizer) ；Heliothis subfIexa Guenee ;牧草天香蛾(Hemileucaoliviae Cockrell) (range caterpillar);美國白蛾(Hyphantria cunea Drury) (fallwebworm);番煎蠹蛾(Keiferia lycopersicella Walsingham) (tomato pinworm) ;二尾蛺蝶(Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst) (Eastern hemlock looper);西部鐵杉尺蠖(L fiscellaria lugubrosa Hulst) (Western hemlock looper);柳毒蛾(Leucomasalicis Linnaeus) (satin moth);舞毒蛾(Lymantria dispar Linnaeus) (gypsy moth)；天幕毛蟲屬(Malacosoma)物種；番煎天蛾(Manduca quinquemaculata Haworth) (fivespotted hawk moth，tomato hornworm);煙草天蛾(M. sexta Haworth) (tomato homworm，tobacco hornworm);冬尺蠖(Operophtera brumata Linnaeus) (winter moth)；古毒蛾屬(Orgyia)物種；春尺蠖(Paleacrita vernata Peck) (spring cankerworm)；大鳳蝶(Papilio cresphontes Cramer) (giant swallowtail, orange dog)；力口州樹蛾(Phryganidia californica Packard) (California oakworm);柑橘潛葉蛾(Phyllocn·istis citrella Stainton) (citrus leafminer);斑幕潛葉蛾(PhyIlonorycterblancardella Fabricius) (spotted tentiform leafminer);大菜粉蝶(Pierisbrassicae Linnaeus) (large white butterfly);小菜粉蝶(P. rapae Linnaeus) (smallwhite butterfly);暗脈菜粉蝶(P. napi Linnaeus) (green veined whitebutterfly);洋薊羽蛾(Platyptilia carduidactyla Riley) (artichoke plume moth);小菜蛾(Plutellaxylostella Linnaeus)(diamondback moth)；棉紅鈴蟲(Pectinophora gossypiellaSaunders) (pink bollworm);南方菜青蟲(Pontia protodice Boisduval & Leconte)(Southern cabbageworm) ；Sabulodes aegrotata Guenee(omnivorous looper)；紅撫天社蛾(Schizura concinna J. E. Smith) (red humped caterpillar);麥蛾(Sitotrogacerealella Olivier)(Angoumois grain moth) ；Telchin licus Drury (giant sugarcaneborer);松異帶蛾(Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller) (pine processionarycaterpillar);結(jié)網(wǎng)衣蛾(Tineola bisselliella Hummel) (webbing clothesmoth);番煎斑潛妮(Tuta aboluta Meyrick) (tomato leafminer)和蘋果巢蛾(Yponomeuta padellaLinnaeus)(ermine moth)。值得關(guān)注的是鞘翅目的幼蟲和成體，其包括來自長角象科(Anthribidae)、豆象科(Bruchidae)和象甲科(Curculionidae)的象鼻蟲，包括、但不限于棉鈴象甲(Anthonomusgrandis Boheman) (boll weevi);向日葵莖象甲(Cylindrocopturus adspersus LeConte)(sunflower stem weevi);鹿根非耳象(Diaprepes abbreviatus Linnaeus) (Diaprepesroot weevi);三葉草葉象(Hypera punctata Fabricius) (clover leaf weevi)；稻水象甲(Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel) (rice water weevi);西印度鹿象甲(Metamasius hemipterus hemipterus Linnaeus) (West Indian cane weevi);絲光鹿象甲(M. hemipterus sericeus Olivier) (silky cane weevi);谷象(Sitophilus granariusLinnaeus) (granary weevi);米象(S. oryzae Linnaeus) (rice weevi);紅色葵花桿象甲(Smicronyx fulvus LeConte) (red sunflower seed weevi);灰色葵花桿象甲(S. sordidusLeConte) (gray sunflower seed weevi);玉米象甲(Sphenophorus maidis Chittenden)(maize billbug) ；S. Iivis Vaurie (sugarcane weevil);新幾內(nèi)亞鹿象甲(Rhabdoscelusobscurus Boisduval)(New Guinea sugarcane weevi);葉甲科(Chrysomelidae)的跳甲、黃瓜葉甲、根蟲、葉甲、馬鈴薯葉甲以及潛葉蟲，包括、但不限于荒地玉米跳甲(Chaetocnema ectypa Horn) (desert corn flea beetle);玉米銅色跳甲(C. pulicariaMelsheimer)(玉米跳甲(corn flea beetle))葡萄肖葉甲(Colaspis brunnea Fabricius)(grape colaspis);巴氏根葉甲(Diabrotica barberi Smith & Lawrence)(北部玉米根蟲(northern corn rootworm));黃瓜十一星葉甲(D. undecimpunctata howardiBarber)(南方玉米根蟲(southern corn rootworm));玉米根螢葉甲(D. virgiferavirgifera LeConte)(西方玉米根蟲(western corn rootworm));科羅拉多州馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsa decemlineata Say) (Colorado potato beetle);黑角負(fù)泥蟲(OuIemamelanopus Linnaeus)(禾谷葉甲(cereal leaf beetle));十字花科跳甲(Phyllotretacruciferae Goeze)(玉米跳甲)；向日葵葉甲(Zygogramma exclamationis Fabricius)(向日葵甲)；來自瓢甲科(Coccinellidae)的甲蟲，包括、但不限于墨西哥豆瓢蟲(Epilachna varivestis Mulsant) (Mexican bean beetle);來自金龜科(Scarabaeidae)·的金龜子和其他甲蟲，包括、但不限于牧草金龜(Antitrogus parvulus Britton)(Childers cane grub);北方圓頭犀金龜(Cyclocephala borealis Arrow) (northernmasked chafer，擠贈);南方圓頭犀金龜(C. immaculata Olivier) (southern maskedchafer，擠贈)；白毛革鱗觸金龜(Dermolepida albohirtum Waterhouse) (Greyback canebeetle);甘鹿犀金龜(Euetheola humilis rugiceps LeConte) (sugarcane beetle)；Lepidiota frenchi Blackburn (French’ s cane grub);古月蘿卜金龜(Tomarus gibbosusDe Geer) (carrot beetle) ；T. subtropicus Blatchley(sugarcane grub) ；Phyllophagacrinita Burmeister (擠贈)；Ρ· latifrons LeConte (June beetle);日本金龜(Popilliajaponica) (Japanese beetle);歐洲金龜(Rhizotrogus majalis Razoumowsky) (Europeanchafer);來自皮蠹科(Dermestidae)的地毬圓皮蠹(carpet beetle);來自叩甲科(Elateridae)的鐵線蟲(wireworm)、偽金針蟲屬(Eleodes)物種、梳爪叩甲屬(Melanotus)物種，包括 M. communis Gyllenhal (鐵線蟲)；單葉叩甲屬(Conoderus)物種；Limonius屬物種；錐尾叩甲屬(Agriotes)物種；Ctenicera屬物種；Aeolus屬物種；來自小蠹科(Scolytidae)的小蠹(bark beetle);來自擬步甲科(Tenebrionidae)的甲蟲；來自天?？?Cerambycidae)科的甲蟲，例如、但不限于 Migdolus fryanus Westwood (longhornbeetle);和來自吉丁蟲科(Buprestidae)的甲蟲，包括、但不限于Aphanisticuscochinchinae seminulum Obenberger(leaf-mining buprestid beetle)。翅目(Diptera)的成體和未成熟體是值得關(guān)注的，包括潛葉蟲美洲黍潛葉M (Agromyza parvicornis Loew)(玉米斑潛葉妮(corn blotch leafminer));搖蚊，包括、但不限于高梁瘦蚊(Contarinia sorghicola Coquillett (高梁搖蚊(sorghummidge));黑森癭蚊(Mayetiola destructor Say)(黑森蠅(Hessian fly));向日葵籽搖蚊(Neolasioptera murtfeldtiana Felt) (sunflower seed midge));麥紅吸衆(zhòng)蟲(Sitodiplosis mosellana G6hin)(小麥搖蚊);果實(shí)蠅(實(shí)蠅科(Tephritidae))、黑麥桿蠅(Oscinella frit Linnaeus)(瑞典桿蠅(frit flies));蛆，包括、但不限于地種妮屬(Delia)物種，包括灰地種妮(Delia platura Meigen) (seedcorn maggot);麥種妮(D. coarctata Fallen) (wheat bulb fly);夏廁也黽(Fannia canicularis Linnaeus)、小舍妮(F. femoral is Stein) (lesser house flies);美洲麥桿妮(Meromyza americanaFitch) (wheat stem maggot)；舍妮(Musca domestica Linnaeus)(家妮類)；廄螫妮(Stomoxys calcitrans Linnaeus)(廄蠅類);秋家蠅、角蠅、麗蠅，金蠅屬(Chrysomya)物種；伏蠅屬(Phormia)物種；和其他蠅類(muscoidfly)害蟲、馬蠅類蛇屬(Tabanus)物種；膚蠅類馬胃蠅屬(Gastrophilus)物種；狂蠅屬(Oestrus)物種；牛蠅類牛皮蠅屬(Hypoderma)物種；鹿蠅類斑蛇屬(Chrysops)物種；綿羊風(fēng)蠅(Melophagus ovinusLinnaeus)(風(fēng)蠅類)；和其他的短角亞目(Brachycera)、蚊類伊蚊屬(Aedes)物種；按蚊屬(Anopheles)物種；庫蚊屬(Culex)物種；黑蠅類原蚋屬(Prosimulium)物種；蚋屬(Simulium)物種；擬蚊蠓、白蛉、眼蕈蚊(sciarid)和其他長角亞目(Nematocera)。作為目的昆蟲，包括半翅目的那些昆蟲，例如、但不限于以下科球蚜科(Adelgidae)、粉風(fēng)科(Aleyrodidae)、蟲牙科(Aphididae)、鏈階科(Asterolecan iidae)、沫蜂科(Cercopidae)、葉蜂科(Cicadellidae)、蜂科(Cicadidae)、菱飛風(fēng)科(Cixiidae)、軟介殼蟲科(Coccidae)、緣鋳科(Coreidae)、胭階科(Dactylopiidae)、飛風(fēng)科(Delphacidae)、盾階科(Diaspididae)、租階科(Eriococcidae)、蛾錯蜂科(Flatidae)、錯蜂科(Fulgoridae)、圓飛風(fēng)科(Issidae)、長鋳科(Lygaeidae)、碩階科(Margarodidae)、角蜂科(Membracidae)、盲鋳科(Miridae)、旌介殼蟲科(Ortheziidae)、鋳科(Pentatomidae)、刺奏介殼蟲科(Phoenicococcidae)、根瘤姆科(Phylloxeridae)、粉階科(Pseudococcidae)、木風(fēng)科(Psyllidae)、紅蟲舂科(Pyrrhocoridae)和網(wǎng)蟲舂科(Tingidae)0來自半翅目的農(nóng)藝學(xué)上重要的成員包括、但不限于喜綠蝽(Acrosternum hilareSay) (green stink bug);豌豆蟲牙(Acyrthisiphon pi sum Harris) (pea aphid);球蟲牙屬(Adelges spp.)物種(球姆類)；苜猜褐盲鋳(Adelphocoris rapidus Say) (rapid plantbug);南瓜緣蟲舂(Anasa tristis De Geer) (squash bug);花生蟲牙(Aphis craccivoraKoch) (cowpea aphid);黑豆蟲牙(A. fabae Scopoli) (black bean aphid);棉蟲牙(A. gossypiiGlover) (cotton aphid，melon aphid);玉米根蟲牙(A. maidiradicis Forbes) (corn rootaphid);蘋果黃蟲牙(A. pomi De Geer) (apple aphid);繡線菊蟲牙(A. spiraecola Patch)(spirea aphid);印尼輪盾介殼蟲(Aulacaspis tegalensis Zehntner) (sugarcanescale);煎溝無網(wǎng)蟲牙(Aulacorthum solani Kaltenbach) (foxglove aphid);煙粉風(fēng)(Bemisia tabaci Gennadius) (tobacco whitefly, sweetpotato whitefly);銀葉粉風(fēng)(B. argentifolii Bellows & Perring) (silverleaf whitefy);美洲谷長蟲舂(Blissusleucopterus leucopterus Say) (chinch bug);負(fù)子鋳科(Blostomatidae)物種；甘藍(lán)短棒蟲牙(Brevicoryne brassicae Linnaeus) (cabbage aphid);梨木風(fēng)(Cacopsylla pyricolaFoerster) (pear psylla);馬鈴墓衣殼蟲舂(Calocoris norvegicus Gmelin) (potato capsidbug);草莓蟲牙(Chaetosiphon fragaefolii Cockerell) (strawberry aphid);臭蟲科(Cimicidae)物種；緣鋳科(Coreidae)物種;方翅網(wǎng)蟲舂(Corythuca gossypii Fabricius)(cotton lace bug);番煎蟲舂(Cyrtopeltis modesta Distant) (tomato bug);煙草小盲蟲舂(C. notatus Distant) (suckfly);沫蜂(Deois flavopicta Stal ) (spittlebug);柑橘粉風(fēng)(Dialeurodes citri Ashmead) (citrus whitef ly);阜莢蟲舂(Diaphnocoris chlorionisSay) (honeylocust plant bug);麥雙尾蟲牙(Diuraphis noxia Kurdjumov/Mordvilko)(俄羅斯小麥姆(Russian wheat aphid));竹禾盾介殼蟲(Duplachionaspis divergensGreen) (armored scale);玫瑰蘋果蟲牙(Dysaphis plantaginea Paaserini) (rosy appleaphid);棉蟲舂(Dysdercus suturellus Herrich- Schaffer) (cotton stainer);甘鹿灰粉階(Dysmicoccus boninsis Kuwana) (gray sugarcane mealybug);香顯微葉蜂(Empoascafabae Harris) (potato leafhopper);蘋果綿蟲牙(Eriosoma lanigerum Hausmann) (woollyapple aphid) ；Erythroneoura科物種(葡萄斑葉蜂)；港島甘鹿飛風(fēng)(Eumetopinaflavipes Muir) (Island sugarcane planthopper);扁盾鋳屬(Eurygaster)物種；褐臭椿(Euschistus servus Say) (brown stink bug)廣斑臭蟲舂(E. variolarius Palisot deBeauvois) (one-spotted stink bug);長鋳屬(Graptostethus)物種(長鋳系群(complexof seed bugs));和桃大尾姆 Hyalopterus pruni Geoffroy) (mealy plum aphid);吹綿階(Icerya purchasi Maskell) (cottony cushion scale);洋蔥蟲舂(Labopidicola allii Knight) (onion plant bug);灰飛風(fēng)(Laodelphax striatellus Fallen) (smaller brownplanthopper);松葉根蟲舂(Leptoglossus corculus Say) (leaf-footed pine seed bug)；Leptodictya tabida Herrich-Schaeffer(sugarcane lace bug);蘿卜蟲牙(Lipaphiserysimi Kaltenbach) (turnip aphid);長綠盲蟲舂(Lygocoris pabulinus Linnaeus)(common green capsid);牧草盲蟲舂(Lygus lineolaris Palisot de Beauvois) (tarnishedplant bug);豆莢草盲蟲舂(L. Hesperus Knight) (Western tarnished plant bug)；牧草盲蟲舂(L. pratensis Linnaeus) (common meadow bug);長毛草盲蟲舂(L rugulipennisPoppius) (European tarnished plant bug);馬鈴薯長管蟲牙(Macrosiphum euphorbiaeThomas)(potato aphid);翠菊葉蜂(Macrosteles quadrilineatus Forbes)(asterleafhopper);周期蜂(Magicicada septendecim Linnaeus) (periodical cicada);甘鹿沫蜂(Mahanarva fimbriolata Stal) (sugarcane spittlebug);甘鹿小蜂(M. posticata Stal)(little cicada of sugarcane); 高梁蟲牙(Melanaphis sacchari Zehntner)(sugarcane aphid);粉階(Melanaspis glomerata Green) (black scale);麥無網(wǎng)長管蟲牙(Metopolophium dirhodum Walker) (rose grain aphid);煙蟲牙(Myzus persicae Sulzer)(peach-potato aphid，green peach aphid);萬苣蟲牙(Nasonovia ribisnigri Mosley)(lettuce aphid);黑尾葉蜂(Nephotettix cinticeps Uhler) (green leafhopper) ;二條黑尾葉蜂(N. nigropictusSt&I) (rice leafhopper);稻綠鋳(Nezara viridula Linnaeus)(southern green stink bug);褐飛風(fēng)(Nilaparvata lugensStal) (brown planthopper)；擬麥長蟲舂(Nysius ericae Schilling) (false chinch bug)荼黃薊馬(Nysius raphanusHoward)(假麥長鋳)；稻鋳(Oebalus pugnax Fabricius) (rice stink bug);大馬利筋長蟲舂(On copeltus fasciatus Dallas)(large milkweed bug) ；Orthops campestrisLinnaeus ;瘦綿蟲牙屬(Pemphigus)物種(根姆和瘦姆)；玉米飛風(fēng)(Peregrinus maidisAshmead) (corn planthopper);甘鹿扁角飛風(fēng)(Perkinsiella saccharicida Kirkaldy)(sugarcane delphacid);長山核桃根瘤蟲牙(Phylloxera devastatrix Pergande) (pecanphylloxera);桔臀紋粉階(Planococcus citri Risso) (citrus mealybug);蘋盲鋳(Plesiocoris rugicollis Fallen) (apple capsid);四線盲蟲舂(Poecilocapsus lineatusFabricius)(four-lined plant bug);棉盲蟲舂(Pseudatomoscelis seriatus Reuter)(cotton fleahopper);粉階屬(Pseudococcus)物種(其他的粉階系群)；Pulvinariaelongata Newstead(cottony grass scale);鹿短足錯蜂(Pyrilla perpusilla Walker)(sugarcane leafhopper)；紅鋳科(Pyrrhocoridae)物種梨園階(Quadraspidiotusperniciosus Comstock) (San Jose scale);獵鋳科(Reduviidae)物種；玉米纟益管蟲牙(Rhopalosiphum maidis Fitch) (corn leaf aphid);禾谷溢管蟲牙(R. padi Linnaeus)(bird cherry-oat aphid);甘鹿紅粉階(Saccharicoccus sacchari Cockerell) (pinksugarcane mealybug) ；Scaptocoris castanea Perty(brown root stink bug);麥二叉蟲牙(Schizaphis graminum Rondani)(greenbug) ；Sipha flava Forbes(yellow sugarcaneaphid);麥長管蟲牙(Sitobion avenae Fabricius) (English grain aphid);白背飛風(fēng)(Sogatella furcifera Horvath) (white-backed planthopper);稻條背飛風(fēng)(Sogatodesoryzicola Muir) (rice delphacid);白斑盲蟲舂(Spanagonicus albofasciatus Reuter)(whitemarked fleahopper);斑點(diǎn)苜猜蟲牙(Therioaphis maculata Buckton) (spottedalfalfa aphid);谷蛾科(Tinidae)物種；桔二叉姆(Toxoptera aurantii Boyer deFonscolombe)(black citrus aphid);和褐色橘蟲牙(T. citricida Kirkaldy)(brown·citrus aphid);紋翅粉風(fēng)(Trialeurodes abutiloneus) (bandedwinged whitef ly)和溫室白粉風(fēng)(T. vaporariorum Westwood) (greenhouse whitef ly);柿木風(fēng)(Trioza diospyriAshmead) (persimmon psylla);和蘋果白葉蜂(Typhlocyba pomaria McAtee) (whiteapple leafhopper)。另外，包括蜱螨目(Acari)(螨類)的成體和幼蟲，例如小麥瘤癭螨(Aceriatosichella Keifer)(小麥卷葉螨(wheat curl mite))蘋果全爪螨(Panonychus ulmiKoch)(歐洲紅螨(European red mite));麥巖螨(Petrobia latens Miiller)(褐色小麥螨(brown wheat mite));班氏細(xì)蟎[(Steneotarsonemus bancrofti Michael)(甘鹿細(xì)蟎[(sugarcane stalk mite));葉螨科(Tetranychidae)的葉螨和紅螨、Oligonychusgrypus Baker & Pritchard、甘鹿葉螨(O. indicus Hirst) (sugarcane leaf mite)、草地小爪螨(O. pratensis Banks)(Banks grass mite)、0. stickneyi McGregor(sugarcanespider mite) ;二斑葉螨(Tetranychus urticae Koch) (two spotted spider mite);邁葉螨(T. mcdanieli McGregor) (McDaniel mite);朱砂葉螨(T. cinnabarinus Boisduval)(carmine spider mite) ; 土耳其斯坦葉螨(T. turkestani Ugarov & Nikolski)(strawberry spider mite)、細(xì)須螨科(Tenuipalpidae)的扁平螨類、葡萄短須螨(Brevipalpus lewisi McGregor) (citrus flat mite);瘦螨科(Eriophyidae)中的鎊螨和芽癭螨以及其他食葉螨和對人類和動物健康重要的螨，即表皮螨科(Epidermoptidae)的塵螨、螺形螨科(Demodicidae)的毛囊螨、食甜螨科(Glycyphagidae)的谷螨，硬蜱科(Ixodidae)的蜱類。黑腳硬蜱(Ixodes scapularis Say)(鹿蜱(deer tick));全環(huán)硬蜱(I. holocyclus Neumann)(澳洲寄生蜱(Australian paralysis tick));變異革蜱(Dermacentor variabilis Say)(美洲犬蜱(American dog tick));美洲鈍眼蜱(Amblyomma americanum Linnaeus) (lone star tick);以及庫螨科(Psoroptidae)、蒲螨科(Pyemotidae)和擠蝴科(Sarcoptidae)的庫蝴和擠蝴。
纟嬰尾目(Thysanura)的昆蟲害蟲是值得關(guān)注的，例如衣魚(LepismasaccharinaLinnaeus) (silverfish);家衣魚(Thermobia domestica Packard)(小灶衣魚(firebrat))。所涵蓋的其他節(jié)肢害蟲包括蜘蛛目中的蜘蛛，例如棕色遁蛛(Loxoscelesreclusa Gertsch & Mulaik (brown recluse spider);和紅斑寇蛛(Latrodectus mactansFabricius)(黑寡婦蜘蛛(black widow spider));和蚰蜓目(Scutigeromorpha)的多足類例如蚰艇(Scutigera coleoptrata Linnaeus) (house centipede)。此外，等翅目(Isoptera)中的病害昆蟲是值得關(guān)注的，包括白蟻科(termitidae)的那些病害昆蟲，例如、但不限于白蟲義(Cornitermes cumulans Kollar)、Cylindrotermes nordenskioeldiHolmgren 和 Pseudacanthotermes militaris Hagen(甘鹿白蟻)；以及鼻白蟻科(Rhinotermitidae)的那些病害昆蟲，包括、但不限于 Heterotermes tenuis Hagen。綴翅目(Thysanoptera)的昆蟲也是值得關(guān)注的，包括、但不限于薊馬類，例如微直鬃薊馬(Stenchaetothrips minutus van Deventer)(甘鹿薊馬(sugarcane thrip))。 本發(fā)明的實(shí)施方式在以下實(shí)施例中進(jìn)一步界定。應(yīng)當(dāng)理解這些實(shí)施例僅以示例的方式給出。由以上討論和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的核心特征，并在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可對本發(fā)明的實(shí)施方式作出各種變通和修改以使之適應(yīng)各種用途和條件。因此，除了本文顯示和描述的那些實(shí)施方式之外，本發(fā)明實(shí)施方式的各種修改將因前面的描述而對本領(lǐng)域技術(shù)人員變得顯而易見。這類修改也當(dāng)視為落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本文給出的每個參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容以引用方式整體并入本文。
實(shí)施例實(shí)施例I通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化玉米并且再生含有CrylF、Cry34Abl、Cry35Abl (Cry34/35Abl)和Pat基因的轉(zhuǎn)基因棺物4114玉米由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的質(zhì)粒PHP27118轉(zhuǎn)化產(chǎn)生。該事件含有cry IF、cry34Ab I、cry35Abl和pat基因盒，它們賦予針對某些鱗翅類和鞘翅類害蟲的抗性。具體而言，第一盒含有截短形式的來自Bt鲇澤變種的crylF基因。crylF基因的插入賦予針對鱗翅目害蟲(包括ECB和FAW)損害的抗性。CrylF蛋白(SEQ ID NO 1)由605個氨基酸組成并且具有大約68kDa的分子量。crylF基因的表達(dá)受玉米多聚遍在蛋白啟動子控制(Christensen等人1992,上文),從而提供CrylFylF蛋白在玉米中的組成型表達(dá)。該區(qū)域還包括與天然多聚遍在蛋白啟動子相連的5' UTR和內(nèi)含子。crylFylF基因的終止子是來自根癌農(nóng)桿菌(4.加!^€&(^6118)11質(zhì)粒？1115955的開放讀框25(01^ 25)中的聚(A)添加信號(Barker等人，1983，上文)。第二盒含有從Bt菌株P(guān)S149BS149B1分離而得的cry34Abl基因(美國專利No. 6，127，180 ；No. 6，624，145 和 No. 6，340，593)。Cry34Abl 蛋白(SEQID NO 2)的長度是123個氨基酸并且具有大約14kDa的分子量。cry34Abl基因的表達(dá)受帶有5' UTR和內(nèi)含子的玉米多聚遍在蛋白啟動子的第二副本控制(Christensen等人，1992,上文)。cry34Abl基因的終止子是PinII終止子(Keil等人，1986，上文；An等人，1989，上文)。第三基因盒含有cry35Abl基因，其也從Bt菌株P(guān)S149BS149B1分離而來(美國專利 No. 6，083，499 ；No. 6，548，291 和 No. 6，340，593)。Cry35Abl 蛋白(SEQ ID NO :3)具有383個氨基酸的長度和大約44kDa的分子量。Cry34Abl和Cry35Abl蛋白在植物中的同時表達(dá)賦予鞘翅類昆蟲(包括WCRW)抗性。Cry35Abl基因的表達(dá)受普通小麥(小麥)過氧化物酶啟動子和前導(dǎo)序列控制(Hertig等人，上文)。Cry35Abl基因的終止子是pinll終止子的第二副本(Keil等人，1986，上文；An等人，1989，上文)。第四也即最后一個基因盒含有來自綠色產(chǎn)色鏈霉菌的pat的已經(jīng)為玉米中表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化的形式。pat基因表達(dá)PAT，其賦予膦絲菌素(草銨膦-銨)耐受性。PAT蛋白(SEQ ID N04)的長度是183個氨基酸并且具有大約21kDa的分子量。pat基因的表達(dá)受來自CaMV 35S轉(zhuǎn)錄物的啟動子區(qū)和終止子區(qū)控制(Franck等人，1980，上文；0dell等人，1985，上文；Pietrzak，等人，1986，上文)。還提供了含有所述DNA構(gòu)建體的植物。表I中進(jìn)一步描述(SEQ ID NO :5中所述的)PHP27118 T-DNA中的遺傳元件及其來源。表I :質(zhì)粒PHP27118的T-DNA區(qū)域中的某閔元件
權(quán)利要求
1.一種DNA構(gòu)建體，其包含第一、第二、第三和第四表達(dá)盒，其中 所述第一表達(dá)盒包括處于可操作地連接的 (a)玉米遍在蛋白啟動子； (b)玉米遍在蛋白基因的5'非翻譯外顯子； (c)玉米遍在蛋白第一內(nèi)含子； (d)編碼CrylF的DNA分子；和 (e)來自O(shè)RF25終止子的多聚(A)添加信號； 所述第二表達(dá)盒包括處于可操作地連接的 (1)玉米遍在蛋白啟動子； (2)玉米遍在蛋白基因的5'非翻譯外顯子； (3)玉米遍在蛋白第一內(nèi)含子； (4)編碼Cry34Abl的DNA分子；和 (5)PinII轉(zhuǎn)錄終止子； 所述第三表達(dá)盒包括處于可操作地連接的 (i)小麥過氧化物酶啟動子； (ii)編碼Cry35Abl的DNA分子；和 (iii)Pinll轉(zhuǎn)錄終止子；并且 所述第四表達(dá)盒包括處于可操作地連接的(a)CaMV 35S 啟動子； (b)編碼pat的DNA分子；和 (c)來自CaMV35S的3'轉(zhuǎn)錄終止子。
2.一種植物,其包含根據(jù)權(quán)利要求I所述的DNA構(gòu)建體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的植物，其中所述植物是玉米植物。
4.一種植物，其包含SEQ ID NO :6中所述的序列。
5.一種玉米植物，其包含玉米事件DP-004114-3的基因型，其中所述基因型包含SEQID NO 27和SEQ ID NO 28中所述的核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的玉米植物，其中所述基因型包含SEQID N0:27中所述的核苷酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的玉米植物，其中所述基因型包含SEQID N0:28中所述的核苷酸序列。
8.一種玉米事件DP-004114-3，其中所述玉米事件的種子的代表性樣品已經(jīng)以登錄號PTA-11506保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的玉米事件的植物部分。
10.包含玉米事件DP-004114-3的種子，其中所述種子包含選自SEQID NO :27和SEQ ID NO :28的DNA分子，其中玉米事件DP-004114-3種子的代表性樣品已經(jīng)以登錄號PTA-11506保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。
11.一種玉米植物或其部分，其從根據(jù)權(quán)利要求10所述的種子培育。
12.—種從根據(jù)權(quán)利要求11所述的玉米植物產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因種子，其包含事件DP-004114-3。
13.一種轉(zhuǎn)基因玉米植物或其部分，其從根據(jù)權(quán)利要求12所述的種子培育。
14.一種分離的核酸分子，其包含選自SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28及其全長互補(bǔ)序列的核苷酸序列。
15.一種擴(kuò)增子，其包含選自SEQ ID NO 27, SEQ ID NO :28及其全長互補(bǔ)序列的核酸序列。
16.一種源自玉米事件DP-004114-3植物、組織或種子的生物學(xué)樣品，其中所述樣品包含核苷酸序列，所述核苷酸序列為選自SEQ ID N0:27和SEQ ID NO :28的序列或與選自SEQID N0:27和SEQ ID NO :28的序列互補(bǔ)，其中所述核苷酸序列是使用核酸擴(kuò)增或核酸雜交方法在所述樣品中可檢測的，其中所述玉米事件DP-004114-3種子的代表性樣品已經(jīng)以登錄號PTA-11506保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的生物學(xué)樣品，其中所述生物學(xué)樣品包括轉(zhuǎn)基因玉米事件DP-004114-3的植物、組織或種子。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的生物學(xué)樣品，其中所述生物學(xué)樣品是從所述轉(zhuǎn)基因玉米植物事件DP-004114-3提取的DNA樣品，并且其中所述DNA樣品包含選自SEQ ID NO :27、SEQID NO 28及其互補(bǔ)序列的核苷酸序列中的一個或多個。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的生物學(xué)樣品，其中所述生物學(xué)樣品選自玉米粉、玉米柏、玉米漿、玉米油、玉米淀粉及經(jīng)完全或部分地加工以含有玉米副產(chǎn)物的麥片。
20.一種提取物，其源自玉米事件DP-004114-3植物、組織或種子并且包含核苷酸序列，所述核苷酸序列為選自SEQ ID NO:27和SEQ ID NO :28的序列或與選自SEQ ID NO 27和SEQ ID NO :28的序列互補(bǔ)，其中所述玉米事件DP-004114-3種子的代表性樣品已經(jīng)以登錄號PTA-11506保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的提取物，其中所述核苷酸序列是使用核酸擴(kuò)增或核酸雜交方法在所述提取物中可檢測的。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的提取物，其中所述提取物包括轉(zhuǎn)基因玉米植物事件DP-004114-3的植物、組織或種子。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的提取物，還包括選自玉米粉、玉米柏、玉米漿、玉米油、玉米淀粉和經(jīng)完全或部分地加工以含有玉米副產(chǎn)物的麥片的組合物，其中所述組合物包含可檢測量的所述核苷酸序列。
24.一種產(chǎn)生雜交玉米種子的方法，所述方法包括 (a)播種第一近交玉米系的種子和第二近交系的種子，所述第一近交玉米系包含選自SEQ ID NO 27, SEQ ID NO :28的核苷酸序列，所述第二近交系具有不同的基因型； (b)栽培因所述播種產(chǎn)生的玉米植物直至開花時間； (c)將所述玉米近交系之一的植物的所述花去勢； (d)將所述兩個不同的近交系彼此有性雜交；以及 (e)收獲由此產(chǎn)生的雜交種子。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述第一近交玉米系的植物是雌性親本。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述第一近交玉米系的植物是雄性親本。
27.一種用于產(chǎn)生抵抗鱗翅類害蟲的玉米植物的方法，所述方法包括 (a)將第一親本玉米植物與第二親本玉米植物有性雜交，其中所述第一或第二親本玉米植物包含事件DP-004114-3DNA，從而產(chǎn)生多個第一代子代植物； (b)選擇抵抗鱗翅類昆蟲侵染的第一代子代植物； (c)將所述第一代子代植物自交，從而產(chǎn)生多個第二代子代植物；以及 (d)從所述第二代子代植物選擇抵抗鱗翅類昆蟲的植物； 其中所述第二代子代植物包含根據(jù)權(quán)利要求I所述的DNA構(gòu)建體。
28.一種產(chǎn)生雜交玉米種子的方法，所述方法包括 (a)播種第一近交玉米系的種子和第二近交系的種子，所述第一近交玉米系包含根據(jù)權(quán)利要求I所述的DNA構(gòu)建體，所述第二近交系具有與所述第一近交玉米系不同的基因型； (b)栽培因所述播種產(chǎn)生的玉米植物直至開花時間； (c)將所述玉米近交系之一的植物的所述花去勢； (d)將所述兩個不同的近交系彼此有性雜交；以及 (e)收獲由此產(chǎn)生的雜交種子。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其還包括以下步驟將步驟(d)的包含玉米事件DP-004114-3DNA的第二代子代植物與缺少所述玉米事件DP-004114-3DNA的親本植物回交，從而產(chǎn)生至少抵抗西方玉米根蟲的回交子代植物。
30.一種用于產(chǎn)生至少抵抗玉米根蟲的玉米植物的方法，所述方法包括 (a)將第一親本玉米植物與第二親本玉米植物有性雜交，其中所述第一或第二親本玉米植物是玉米事件DP-004114-3植物，從而產(chǎn)生多個第一代子代植物； (b)選擇至少抵抗玉米根蟲侵染的第一代子代植物； (c)將步驟(b)的所述第一代子代植物與缺少玉米事件DP-004114-3DNA的親本植物回交，從而產(chǎn)生多個回交子代植物；以及 (d)從所述回交子代植物選擇至少抵抗玉米根蟲侵染的植物； 其中步驟(d)的所選擇回交子代植物包含SEQ ID NO:6。
31.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述第一近交玉米系的植物是雌性親本或雄性親本。
32.由根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法產(chǎn)生的雜交種子。
33.一種確定生物學(xué)樣品中包含玉米事件DP-004114-3的玉米植物的DNA接合性的方法，所述方法包括(a)使所述樣品與選自SEQ ID NO 1USEQ ID NO 13,SEQ ID NO:23 或 SEQ ID NO 24的第一引物和選自 SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO :25 或 SEQ ID NO 26 的第二引物接觸，使得 (1)當(dāng)在包含玉米事件DP-004114-3DNA的核酸擴(kuò)增反應(yīng)中使用時，產(chǎn)生判定玉米事件DP-004114-3的第一擴(kuò)增子，并且 (2)當(dāng)在包含除DP-004114-3DNA之外的玉米基因組DNA的核酸擴(kuò)增反應(yīng)中使用時，產(chǎn)生判定除DP-004114-3DNA之外的玉米基因組DNA的第二擴(kuò)增子； (b)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)；以及 (c)檢測如此產(chǎn)生的所述擴(kuò)增子，其中檢測到兩種擴(kuò)增子的存在指示所述樣品是對玉米事件DP-004114-3DNA雜合的，其中僅檢測到所述第一擴(kuò)增子指示所述樣品是對玉米事件 DP-004114-3DNA 純合的。
34.一種檢測包含玉米核酸的樣品中對事件DP-004114-3為獨(dú)特的核酸分子的存在的方法，所述方法包括 (a)使所述樣品與一對引物接觸，當(dāng)在具有來自事件DP-004114-3的基因組DNA的核酸擴(kuò)增反應(yīng)中使用時，所述一對引物產(chǎn)生判定事件DP-004114-3的擴(kuò)增子； (b)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生所述擴(kuò)增子；以及 (c)檢測所述擴(kuò)增子。
35.一個多核苷酸引物對,其包含第一多核苷酸引物和第二多核苷酸引物,所述多核 苷酸引物在樣品中的事件DP-004114-3DNA模板存在時一起發(fā)揮作用以產(chǎn)生判定事件DP-004114-3的擴(kuò)增子。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的多核苷酸引物對,其中所述第一多核苷酸引物的序列是在異源DNA序列的插入點(diǎn)側(cè)翼的玉米植物基因組序列或與所述玉米植物基因組序列互補(bǔ)，所述異源DNA序列插入事件DP-004114-3的玉米植物基因組中，并且所述第二多核苷酸引物的序列是插入事件DP-004114-3的基因組中的所述異源DNA序列或與所述異源DNA序列互補(bǔ)。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的多核苷酸引物對，其中 (a)所述第一多核苷酸引物包含選自SEQID NO 6的核苷酸1-2422、SEQ ID NO 6的核苷酸14348-16752及其互補(bǔ)物的核苷酸序列的至少10個連續(xù)核苷酸；和 (b)所述第二多核苷酸引物包含來自SEQID NO6的核苷酸2423-14347或其互補(bǔ)物的至少10個連續(xù)核苷酸。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的多核苷酸引物對，其中 (a)所述第一多核苷酸引物包含選自SEQID NO :11、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO 22-SEQ ID NO :26及其互補(bǔ)序列的核苷酸序列；并且 (b)所述第二多核苷酸引物包含選自SEQID NO 12, SEQ ID NO 14-SEQ ID NO 19,SEQ ID NO :21及其互補(bǔ)序列的核苷酸序列。
39.根據(jù)權(quán)利要求37所述的引物對，其中所述第一引物和所述第二引物有至少18個核苷酸。
40.根據(jù)權(quán)利要求37所述的引物對，其中所述第一引物和所述第二引物有至少24個核苷酸。
41.一種檢測樣品中與DP-004114-3事件相對應(yīng)的DNA的存在的方法，所述方法包括 (a)使包含玉米DNA的樣品與多核苷酸探針接觸，所述多核苷酸探針在嚴(yán)格雜交條件下與來自玉米事件DP-004114-3的DNA雜交并且在所述嚴(yán)格雜交條件下不與非DP-004114-3玉米植物DNA雜交； (b)使樣品和探針經(jīng)受嚴(yán)格雜交條件；以及 (c)檢測所述探針與所述DNA的雜交； 其中檢測到雜交指示所述DP-004114-3事件存在。
42.一種用于檢測對事件DP-004114-3為獨(dú)特的核酸的試劑盒，所述試劑盒包括具有足夠長度的連續(xù)多核苷酸的至少一個核酸分子，所述核酸分子作為引物或探針在核酸檢測方法中發(fā)揮作用，并且當(dāng)擴(kuò)增出樣品中的靶核酸序列或與所述靶核酸序列雜交、隨后檢測到擴(kuò)增子或與所述靶序列的雜交時，則所述核酸分子判定對事件DP-004114-3為獨(dú)特的核酸序列在所述樣品中存在。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的試劑盒，其中所述核酸分子包含來自SEQID NO :6的核苷酸序列。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的試劑盒，其中所述核酸分子是選自SEQID NO : II-SEQ IDNO: 26及其互補(bǔ)序列的引物。
全文摘要
本發(fā)明提供了涉及轉(zhuǎn)基因抗昆蟲性玉米植物的DNA組合物。也提供了基于插入玉米基因組中的重組構(gòu)建體的DNA序列和在插入位點(diǎn)側(cè)翼的DNA序列檢測玉米DP-004114-3事件的存在的測定法。提供了在實(shí)施所述測定法中有用的試劑盒和條件。
文檔編號A01H5/10GK102892284SQ201080057507
公開日2013年1月23日 申請日期2010年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月17日
發(fā)明者S·迪恩, A·L·盧, T·M·諾瓦茨基, D·S·努貝爾, J·C·雷吉斯特三世, C·J·塞隆奇, M·A·P·維拉內(nèi)羅, J·K·楊, C·X·仲, E·克羅蓋 申請人:先鋒國際良種公司, 納幕爾杜邦公司