專利名稱：利用甘蔗汁促進(jìn)甘蔗壯苗的組培方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種甘蔗組織培養(yǎng)的方法，具體涉及一種利用甘蔗汁促進(jìn)甘蔗壯苗的 組培方法。
背景技術(shù)：
妨MXSaccharum Complex)是我國最主要的糖料作物，甘蔗糖產(chǎn)量占我國食糖總 產(chǎn)量的90%以上。種苗質(zhì)量直接影響甘蔗產(chǎn)量和品質(zhì)。甘蔗由于育種周期長達(dá)10年以上， 常規(guī)以營養(yǎng)體蔗莖留種繁殖，使得甘蔗花葉病毒、黃葉病毒、宿根矮化病菌、黑穗病菌和梢 腐病菌等多種病原在蔗莖中長期累積，導(dǎo)致甘蔗品種種性退化，因而，單位面積蔗莖產(chǎn)量、 蔗糖分和宿根性下降。脫毒健康種苗由于去除了這些病原，養(yǎng)分和水分從甘蔗維管束等輸 導(dǎo)組織輸送暢通，蔗莖產(chǎn)量普遍增產(chǎn)15%以上，蔗糖分提高0.5個百分點(diǎn)左右，可見單位土 地面積的增產(chǎn)效果非常顯著。早在20世紀(jì)70年代末，巴西等國就開始對甘蔗健康種苗進(jìn)行 研究，80年代中期，健康種苗生產(chǎn)已獲成功，并在甘蔗生產(chǎn)上推廣使用。國內(nèi)的許莉萍等在 90年代初期已開始通過組織培養(yǎng)和莖尖培養(yǎng)的方法培育甘蔗健康種苗，以去除甘蔗花葉病 毒，提高產(chǎn)量。目前健康種苗在巴西、古巴、美國、澳大利亞等國家得到了廣泛利用，其中巴 西、古巴等國90%蔗區(qū)實(shí)現(xiàn)甘蔗用種健康、無毒化。同時，巴西已通過政府立法，在全國建立 甘蔗脫毒健康種苗生產(chǎn)繁殖體系，種植者不得自留甘蔗種莖，通過糖廠提供健康種苗。2008 年，國際糧農(nóng)組織亞太生物技術(shù)合作組織也極力推薦亞太地區(qū)國家采用健康種苗。我國也 計劃在甘蔗主要蔗區(qū)大面積示范推廣甘蔗健康種苗技術(shù)。利用腋芽或莖尖為外植體進(jìn)行離 體組織培養(yǎng)，生產(chǎn)脫毒組培苗是生產(chǎn)甘蔗健康種苗最重要的環(huán)節(jié)。眾所周知，甘蔗組培苗 (瓶苗)是在營養(yǎng)物質(zhì)豐富，光照、溫度、濕度等條件在嚴(yán)格的人工控制下培養(yǎng)出來的，幼苗 較瘦弱，根系吸收能力較差，抗逆性不強(qiáng)，在定植大田前需要經(jīng)過2個月左右的苗圃(苗 床)假植，假植成活率直接關(guān)系生產(chǎn)效率和效益。目前，一般假植成活率只有70%左右，有 時甚至低于50%，大多都是因?yàn)槠棵缣?，假植后不能適應(yīng)外界環(huán)境而死亡。目前，這就要 求組培瓶苗在定植大田之前，必須經(jīng)過2個月左右的苗圃假植，提高組培苗的假植苗成活 率已成為甘蔗健康種苗生產(chǎn)過程中的一個關(guān)鍵步驟。另一方面，隨著分子生物學(xué)和基因工 程技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因改良將成為甘蔗育種的重要手段，該技術(shù)手段同樣也涉及離體培養(yǎng) 的轉(zhuǎn)基因小苗的移栽成活問題。雖然假植苗成活率受各種因素影響，但瓶苗的健壯程度對 其至關(guān)重要。因此，要提高假植苗成活率，首先要培育健壯的瓶苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中存在甘蔗假植苗成活率低的問題，提供一種利用 甘蔗汁促進(jìn)甘蔗壯苗的組培方法，培養(yǎng)出健壯的甘蔗瓶苗。所述甘蔗瓶苗指增殖階段的甘 蔗組培苗。
本發(fā)明的目的是通過以下方法實(shí)現(xiàn)的
一種利用甘蔗汁促進(jìn)甘蔗壯苗的組培方法，包括材料選擇、誘導(dǎo)培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、分化培養(yǎng)和壯苗培養(yǎng)，其特征在于所述壯苗培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L BA+0.5 mg/L KT + 5 % 15 %體積甘蔗汁+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂粉；所述MS培養(yǎng)基為1962年，Murashige 和Skoog公開的MS培養(yǎng)基；所述5% 15%體積甘蔗汁，指成熟期的果蔗Badila汁，一 20°C 冷凍保存，保質(zhì)期半年，解凍后使用，使用量為壯苗培養(yǎng)基總體積的5% 15% ；所述BA，指 6 一芐胺基嘌吟；所述KT，指6 —糠胺基嘌吟。具體實(shí)施步驟
1、材料選擇取健壯的甘蔗植株，從最高肥厚帶往下30cm處切下，用75%的酒精表 面消毒；
2、誘導(dǎo)培養(yǎng)切取生長點(diǎn)以上10cm內(nèi)的幼嫩心葉，將其切成小于3 mm厚度的圓片，接 種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；培養(yǎng)室溫度為25 °C 28 °C，暗培養(yǎng)；
3、繼代培養(yǎng)愈傷組織形成后轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基上，每15天繼代一次；培養(yǎng)室溫度為 25 28 °C，暗培養(yǎng)；
4、分化培養(yǎng)選取金黃色的愈傷組織，接種到分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)15天即可分化出叢 芽；培養(yǎng)室溫度為25 V 28 °C，光照12h，光照強(qiáng)度為1 200 Ix 1 500 Ix ；
5、壯苗培養(yǎng)壯苗培養(yǎng)基的配方為MS+1.0 mg/L ΒΑ+0. 5 mg/L KT + 5 % 15 %體積 甘蔗汁+20 g/L蔗糖+ 6 g/L瓊脂粉；按上述配方先稱取瓊脂粉、蔗糖，加入占壯苗培養(yǎng) 基總體積1/3的蒸餾水中，煮沸后再加入所述配方中的其余各種原料，用蒸餾水定容至所 要配制的培養(yǎng)基總量后，再用1 mol/L的NaOH或1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值至5. 8 ；然后，分 裝到容器中封口 ；在1. 1 kg/cm2壓力下滅菌20分鐘，冷卻凝固后即為壯苗培養(yǎng)基；將步驟 4分化培養(yǎng)的叢芽切成0. 2 cm2大小，接種到壯苗培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)室溫度為25°C 28°C， 光照12 h，光照強(qiáng)度為1 200 Ix 1 500 Ix的條件下培養(yǎng)15天，叢芽即可長成大苗。在甘蔗的腋芽繁殖，莖尖培養(yǎng)，轉(zhuǎn)基因的愈傷組織分化培養(yǎng)過程中，經(jīng)常出現(xiàn)芽叢 生長旺盛，而能轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)的有效芽苗不多，需要多代的轉(zhuǎn)接才能使芽叢逐漸健壯。為了 探討有效增加甘蔗瓶苗壯苗數(shù)量的的方法，我們將甘蔗汁作為甘蔗組織培養(yǎng)的添加劑，設(shè) 計了壯苗培養(yǎng)基，并作了壯苗培養(yǎng)基中使用0% 30%體積甘蔗汁對甘蔗叢芽壯苗的影響試 驗(yàn)。結(jié)果如表1所示，壯苗培養(yǎng)基中含5% 10%體積的甘蔗汁，可以有效提高甘蔗瓶苗的 壯苗數(shù)量；其中，以含10%體積甘蔗汁的壯苗效果為最好。甘蔗汁中除了糖分本身外，蔗汁 中的一些微量元素和未知的內(nèi)源激素也是促進(jìn)甘蔗瓶苗健壯的主要因素。經(jīng)多次試驗(yàn)和統(tǒng) 計分析，表明甘蔗組織培養(yǎng)分化叢芽后，使用含10%體積甘蔗汁的壯苗培養(yǎng)基，平均每叢提 高壯苗數(shù)3. 5株，提高了 56%，效果顯著。所述壯苗指莖粗>1.5 mm，苗高>2.0 cm的甘蔗瓶
田ο 表1 壯苗培養(yǎng)基中含不同體積甘蔗汁對甘蔗叢芽壯苗的影響
甘蔗汁(％)接種芽叢量(叢)壯苗數(shù)壯苗株數(shù)/叢顯著性長 勢0452806. 2Bb苗淡黃、高、長勢弱5503607. 2Bb苗淺綠、高、長勢中10504809. 6Aa苗綠、高、長勢壯15605108. 5Aa苗綠、高、長勢壯20603666. 1Bb苗綠、高、長勢壯30502925. 8Bb苗綠、高、長勢壯
表1采用字母標(biāo)記方法來表示多重比較結(jié)果，按照統(tǒng)計分析平均數(shù)多重比較標(biāo)記字母法規(guī)定，用小寫拉丁字母a、b、c、d......表示差異顯著水平α =0.05，用大寫拉丁字母A、
B、C、D......表示差異顯著水平α =0.01。先將各處理平均數(shù)由大到小排列，最大平均數(shù)
后標(biāo)記a或Α，并將該平均數(shù)與以下各平均數(shù)相比，差異顯著的依次標(biāo)記b或B。依次類推， 不顯著的標(biāo)記同一字母。兩平均數(shù)之間凡有相同字母的即為差異不顯著，否則為差異顯著。使用壯苗培養(yǎng)基與使用椰乳汁替代壯苗培養(yǎng)基中甘蔗汁的對比試驗(yàn)，結(jié)果如表2 所示，以使用壯苗培養(yǎng)基為佳，每叢壯苗數(shù)達(dá)到9. 6株，比使用椰乳汁替代甘蔗汁培養(yǎng)的壯 苗數(shù)提高了 41%，呈顯著性差異。從苗的長勢上看，經(jīng)過甘蔗汁培養(yǎng)的甘蔗苗粗壯，葉片直 立，而使用椰乳汁替代甘蔗汁培養(yǎng)的甘蔗苗細(xì)弱，葉片細(xì)長且下垂。所述椰乳汁為90 %成 熟度的新鮮椰乳汁。表2 壯苗培養(yǎng)基中使用甘蔗汁與使用椰乳汁對比試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
一種利用甘蔗汁促進(jìn)甘蔗壯苗的組培方法，包括材料選擇、誘導(dǎo)培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、分化培養(yǎng)和壯苗培養(yǎng)，其特征在于所述壯苗培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L BA+0.5 mg/L KT＋5 %～15 % 體積甘蔗汁＋20 g/L蔗糖＋6 g/L瓊脂粉；所述MS培養(yǎng)基為1962年，Murashige和Skoog公開的MS培養(yǎng)基；所述5%～15% 體積甘蔗汁，指成熟期的果蔗Badila汁，－20℃冷凍保存，保質(zhì)期半年，解凍后使用，使用量為壯苗培養(yǎng)基總體積的5%～15%；所述BA，指6－芐胺基嘌吟；所述KT，指6－糠胺基嘌吟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用甘蔗汁促進(jìn)甘蔗壯苗的組培方法，其特征在于所述 壯苗培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L BA+0.5 mg/L KT+ 10 %體積甘蔗汁+20 g/L蔗糖+ 6g/L瓊脂粉。
全文摘要
一種利用甘蔗汁促進(jìn)甘蔗壯苗的組培方法，包括材料選擇、誘導(dǎo)培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、分化培養(yǎng)和壯苗培養(yǎng)；其中，壯苗培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS+1.0mg/LBA+0.5mg/LKT＋5%～15%體積甘蔗汁＋20g/L蔗糖＋6g/L瓊脂粉。甘蔗汁中除了糖分本身外，蔗汁中的一些微量元素和未知的內(nèi)源激素也是促進(jìn)甘蔗瓶苗健壯的主要因素。經(jīng)多次試驗(yàn)和統(tǒng)計分析，表明甘蔗組織培養(yǎng)分化叢芽后，使用含10%體積甘蔗汁的壯苗培養(yǎng)基，壯苗數(shù)提高了56%，移苗成活率達(dá)94.5%，效果顯著，而且操作方法簡單，實(shí)用性強(qiáng)，推廣性好。
文檔編號A01H4/00GK101983558SQ20101057886
公開日2011年3月9日 申請日期2010年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月8日
發(fā)明者傅華英, 楊颕颕, 林慶良, 許莉萍, 陳如凱, 高世武, 黃國強(qiáng) 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)