專利名稱：一種四倍體不結球白菜的有性多倍化育種方法
技術領域：
本發(fā)明屬農(nóng)作物育種領域，涉及一種四倍體不結球白菜的有性多倍化育種方法， 專用于四倍體不結球白菜的選育。
背景技術：
自然界物種進化過程中有兩條多倍化途徑。一是有性多倍化，二是無性多倍化，前 者是自然界植物多倍體形成的主要途徑，即通過2n配子的形成，然后參與有性交配。2n配 子的有性多倍化比無性多倍化具有更多的生物學優(yōu)點，更高的發(fā)生頻率，更高的雜合度。從 來自近緣二倍體的基因滲入，創(chuàng)造遺傳多樣性及得到基因雜合的多倍群體。用2n配子進行 多倍體育種，能使不同的基因型在提高了的倍性水平上相結合，為從低倍性親本向高倍性 子代傳遞雜合性和有利基因組合提供了可能性，增大了雜種優(yōu)勢潛力，且新類型可由多倍 體遺傳保存；此外，在結實性提高方面效果明顯。人為操作的有性多倍化已成為植物種質(zhì)創(chuàng) 新的重要手段。不結球白菜(Brassica campestris ssp. chinensis Makino)俗稱小白菜、白菜、 青菜，我國北方稱“油菜”，原產(chǎn)中國。是我國南方最大眾化的蔬菜，在蔬菜周年供應中占有 舉足輕重的地位。其天然種及各栽培種都是二倍體，即2n = 2x = 20。現(xiàn)有技術中有本 發(fā)明人在國內(nèi)外首次人工誘變四倍體不結球白菜“南農(nóng)矮腳黃”新品種(南京農(nóng)業(yè)大學學 報，1990，13(2) :P.33 40)；利用二個四倍體自交不親和系雜交育成四倍體雜交種“暑優(yōu) 1號”(發(fā)明專利ZL01137325.3)；創(chuàng)制四倍體不結球白菜雄性不育系及保持系(發(fā)明專利 ZL03113283. 9)；利用四倍體不結球白菜雄性不育系和四倍體父本系生產(chǎn)&代雜交種(即 雜種優(yōu)勢最優(yōu)化的雜交制種手段)可使h代雜種率達到100%。但四倍體不結球白菜資源 有限，制約了四倍體雜種優(yōu)勢的利用。2n配子是自然界的普遍現(xiàn)象，有性多倍化是自然界多倍體形成的主要途徑。在馬 鈴薯中研究最為深入，馬鈴薯2n配子自然發(fā)生頻率為1. 3% (屈冬玉.1988. 2n配子在馬 鈴薯育種中的應用.馬鈴薯雜志，2(2) :102-105.)，在十字花科植物中黑芥2n配子自然發(fā) 生頻率為0.05% 2. 17% (孟金陵.1997.植物生殖遺傳學.北京科學出版社，83-84.)， 大白菜2n配子自然發(fā)生頻率為9. 17% 20. 06% (張成合，申書興，尚愛芹，王子欣，任 清.2007.大白菜2n配子發(fā)生的遺傳分析.園藝學報，27 (4) :295_296.)。關于利用秋水 仙素誘導2n配子獲得多倍體的研究已有報道(趙雁，劉武林，鄭思鄉(xiāng)，肖亞瓊.2006.秋水 仙素誘導郁金香有性多倍化研究.北方園藝，(6) 135-136.王世敏，鄭思鄉(xiāng)，趙雁.2008. 月季配子誘變及雜交后代種子萌發(fā)研究初報.云南農(nóng)業(yè)大學學報，23 (3) =426-430.楊曉 伶，程舟，李珊，北島宣，長谷川耕二郎.2006.秋水仙堿誘導文旦柚2n配子獲得自交三倍 體.園藝學報，33 (5) =1045-1047.)。目前國內(nèi)外現(xiàn)有技術中還沒有利用秋水仙素誘導二倍 體不結球白菜產(chǎn)生2n雄配子，再與四倍體不結球白菜胞質(zhì)雄性不育系雜交，獲得新四倍體 的有性多倍化育種技術。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的上述不足，提供一種四倍體不結球白菜的有性多 倍化育種方法。本發(fā)明的另一目的是提供該方法選育新型四倍體不結球白菜品種。本發(fā)明的目的通過如下技術方案實現(xiàn)一種四倍體不結球白菜的育種方法在二倍體不結球白菜抽薹期使用秋水仙素溶 液處理花蕾誘導產(chǎn)生2n雄配子；以四倍體雄性不育系為母本，以所述的秋水仙素誘導得到 的含2n雄配子的二倍體為父本在花期進行人工有性多倍化雜交育種，獲得Fi代四倍體白 菜即為所述的四倍體不結球白菜。所述的育種方法優(yōu)選包含如下步驟l)2n雄配子的誘導誘變二倍體不結球白菜產(chǎn)生2n花粉的秋水仙素溶液濃度為 0. 05 % (g/ml，下文同)、0. 10 %和0. 20 %，在二倍體不結球白菜抽薹期處理花蕾，每天兩 次，花蕾大小2. 5 3. 5mm,采用微量注射法，每個花蕾注射5 10 y L，每隔6h處理一次， 每個濃度處理2次，以未處理植株為對照，然后套袋隔離，2n花粉特征為廣橢圓形，平均長 度為165. 27微米，平均寬度為103. 72微米，染色體數(shù)為2x = 20 (而未處理的二倍體植株 產(chǎn)生的n花粉為橢圓形，長149. 70微米，寬76. 58微米，染色體數(shù)為x = 10)；2)人工有性多倍化雜交以四倍體雄性不育系為母本，以秋水仙素誘導含2n配子 的二倍體材料為父本，及未處理的為父本對照在花期分別進行人工蕾期授粉雜交，共配30 株，第3天重復授粉1次。夏初收獲&四倍體種子。其中，所述的秋水仙素溶液處理花蕾的時間為春天二倍體不結球白菜抽薹期早晨 8:00-9:00和下午2:00-3:00，處理溫度分別為20°C _25°C，和不低于18°C。所述的經(jīng)秋水仙素誘變2n花粉及有性多倍化雜交獲得的四倍體不結球白菜&為 四月白春化型，株型直立束腰，株高28 31厘米，開展度28 34厘米，葉片近圓形，黃綠 色、葉柄白色、扁平，單株重0. 5 0. 6千克，與二倍體對照父本相比表現(xiàn)出巨大性，植 株生長勢強，葉片近圓形，葉片皺縮，葉脈清晰，菜頭粗、單株質(zhì)量、株高、開展度、葉片數(shù)、 葉片寬、十片葉總質(zhì)量、葉片長、葉柄質(zhì)量、葉柄長、葉柄寬、十片葉總厚度和葉柄厚比二倍 體分別增加 33. 81 %U16. 95%,55. 68%,41. 54%,46. 15%、13. 43%,32. 18%、19. 81
15. 91%,87. 24%,27. 55%U29. 79%和97. 72%，花瓣顏色加深，形狀變圓，長和寬分別增 加82. 61 %和103. 28%，氣孔長和寬分別增加93. 95%和71. 07%，角果長、橫寬、和喙長分 別增加45. 33%,63. 33%、和132. 14%，但氣孔密度減少49. 58%,以上形狀差異達極顯著 水平；經(jīng)細胞學鑒定，該有性多倍化四倍體其體細胞染色體數(shù)為2n = 4x = 40，而二倍體父 本體細胞染色體數(shù)為2n = 2x = 20。所述的四倍體雄性不育系優(yōu)選按照中國專利ZL03113283. 9制備的四倍體雄性不育系。所述的二倍體不結球白菜優(yōu)選二倍體不結球白菜“亮白葉”(中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜 花卉研究所主編，中國蔬菜品種志(上卷)，北京2001中國農(nóng)業(yè)出版社，353頁)。一種利用本發(fā)明所述的育種方法獲得的四倍體不結球白菜品種，由該品種的四倍 體不結球白菜為四月白春化型，株型直立束腰，株高28 31厘米，開展度28 34厘米， 葉片近圓形，黃綠色、葉柄白色、扁平，單株重0. 5 0. 6千克，與二倍體對照父本相比表現(xiàn)出巨大性，本發(fā)明四倍體不結球白菜植株生長勢強，葉片近圓形，葉片皺縮，葉脈清晰，菜 頭粗、單株質(zhì)量、株高、開展度、葉片數(shù)、葉片寬、十片葉總質(zhì)量、葉片長、葉柄質(zhì)量、葉柄長、 葉柄寬、十片葉總厚度和葉柄厚比二倍體分別增加33. 81%U16. 95%,55. 68%,41. 54%, 46. 15 %U3. 43 %,32. 18 %U9. 81 %U5. 91 %,87. 24 %,27. 55 % ,129. 79 % 和 97. 12%, 花瓣顏色加深，形狀變圓，長和寬分別增加82. 61 %和103. 28 %，氣孔長和寬分別增加 93. 95%和71. 07%，角果長、橫寬、和喙長分別增加45. 33%,63. 33%、和132. 14%，但氣孔 密度減少49. 58%，以上形狀差異達極顯著水平；經(jīng)細胞學鑒定，該四倍體其不結球白菜體 細胞染色體數(shù)為2n = 4x = 40。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明首次采用四倍體不結球白菜雄性不育系作母本，既四倍體不結球白菜雄性 不育系(本身產(chǎn)生2n配子)X 二倍體不結球白菜(誘變產(chǎn)生2n配子)的有性多倍化育種 途徑，獲得四倍體不結球白菜新種質(zhì)。與無性多倍化的同源四倍體相比具有更廣泛的遺傳 多樣性，更高的結實率(結實率低是人工多倍體難以應用的最大障礙)。在國內(nèi)外多倍體研究中，有性多倍化雜交母本無論是二倍體還是四倍體都必須人 工去雄，費工費時，其雜種后代難免有原來母本的自交種子，影響試驗結果。采用雄性不育 系作母本(本身沒有花粉，不能自交)，不用人工去雄，有性雜交后，在雄性不育系上收獲的 種子一定是雜交種。排除了母本自交種或假雜種的干擾。本發(fā)明采用不同濃度秋水仙素誘導二倍體不結球白菜產(chǎn)生2n配子作父本，再與 四倍體不結球白菜雄性不育系作母本雜交。獲得新四倍體的機率大。本發(fā)明新四倍體具有多倍體的巨大性、抗病性、耐寒性，品質(zhì)好，還具有二倍體父 本的性狀，如晚抽薹(長江流域2 3月份，大多數(shù)小白菜都已抽薹開花，該四倍體在4月 初抽薹開花，以補晚春缺菜)，及束腰等商品性好的特點(一般情況下四倍體外形不如二倍 體)。


圖1. n花粉粒，染色體數(shù)x = 10 (未經(jīng)處理的二倍體不結球白菜對照)；圖2. 2n花粉粒2x = 20與n花粉粒(經(jīng)秋水仙素誘導的二倍體不結球白菜內(nèi)的 兩種花粉粒)；圖3.四倍體FJ四倍體雄性不育系與二倍體雜交)根尖有絲分裂中期染色體數(shù) (2n = 4x = 40)；圖4. 二倍體對照的氣孔(X100)；圖5.四倍體的氣孔(X100)；圖6.花器官比較(左為二倍體對照，右為四倍體??；圖7.角果比較(左為二倍體對照，右為四倍體；圖8.葉片比較(左為四倍體雄性不育系母本，中為四倍體&，右為誘導的二倍體 父本)；圖9.植株比較(左為四倍體雄性不育系母本，中為四倍體&，右為誘導的二倍體 父本)；圖10.有性多倍化雜交父、母本及&形態(tài)解剖學比較；
圖11.有性多倍化雜交父、母本及&農(nóng)藝性狀比較。
五具體實施例方式實施例11材料與方法1. 1 材料試驗于2006年10月-2008年11月在南京農(nóng)業(yè)大學園藝實驗站進行。二倍體不 結球白菜“亮白葉”(中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所主編，中國蔬菜品種志(上卷)，北京 2001中國農(nóng)業(yè)出版社，353頁)，四倍體不結球白菜雄性不育系08P76為人工無性多倍化獲 得，獲得方法參見中國專利ZL03113283. 9，以四倍體“南農(nóng)矮腳黃”(中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜 花卉研究所主編，中國蔬菜品種志(上卷)，北京2001中國農(nóng)業(yè)出版社，353頁)為對照， 以上材料均由南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院白菜課題組提供。1.2 2n雄配子的誘導與鑒定在春天不結球白菜抽薹期晴天上午8:00-9:00和下午2:00-3:00 (白天 20°C _25°C，夜間不低于18°C )處理二倍體不結球白菜花蕾，花蕾大小2. 5 3. 5mm(小孢 子母細胞減數(shù)分裂前期I)，秋水仙素處理濃度為0. 05%,0. 10%和0. 20%，采用微量注射 法，每個花蕾注射5 10 y L，每隔6h處理一次，每個濃度處理3次，每個處理1株，每株處 理主枝和第1側枝(80 90個花蕾)，以未處理植株為對照，套袋隔離。待花蕾開花當天每 個處理及對照取兩朵花的花粉分別混合均勻，制成5個涂片，每個涂片隨機觀察10個視野， 每個視野分別測量3個n和2n花粉粒并統(tǒng)計花粉變異情況?？傋儺惵?(總花粉數(shù)_n花 粉數(shù))/總花粉數(shù)；2n配子頻率=2n花粉數(shù)/總花粉數(shù)。1. 3人工有性多倍化雜交及雜交后代的鑒定以四倍體雄性不育系為母本，以秋水仙素誘導含2n雄配子的二倍體材料為父本， 及未處理的為父本對照在花期分別進行人工蕾期雜交，共配30株，第3天重復授粉1次。5 月中旬收獲種子，9月15日播種父、母本及&進行鑒定。形態(tài)學、解剖學鑒定參照張振超的 方法(張振超，張蜀寧，張偉，張紅亮，四倍體不結球白菜的誘導及染色體倍性鑒定，西北植 物學報，2007，27 (1) =0028-0032)，調(diào)查形態(tài)學指標有葉形、葉色、葉厚、植株形狀、花器官、 角果等，解剖學指標有氣孔、花粉粒，所獲數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進行統(tǒng)計。染色體直接鑒定參 照張紅梅的方法(張紅梅，張蜀寧，孔艷娥，張麗麗，利用青花菜幼嫩雌蕊進行染色體核型 分析，園藝學報，2009，36 (5) =727-730) 2結果與分析2. 1秋水仙素誘導2n配子效果按照不同濃度及處理次數(shù)進行統(tǒng)計(表1)表明，0. 05% 0. 20%秋水仙素均可使 花粉總變異頻率(12. 06% 24. 92%)和2n配子頻率(9. 52% 20. 20%)提高，但花成活 率下降(98. 6% 70. 0% )。以濃度0. 20%處理1次的誘導效果最好，花成活率為86. 0%， 總變異頻率為24. 92%, 2n配子頻率達20. 20%，為對照的22倍。表1秋水仙素誘導不結球白菜2n配子效果
權利要求
一種四倍體不結球白菜的育種方法，其特征在于在二倍體不結球白菜抽薹期使用秋水仙素溶液處理花蕾誘導產(chǎn)生2n雄配子；以四倍體雄性不育系為母本，以所述的秋水仙素誘導得到的含2n雄配子的二倍體為父本在花期進行人工有性多倍化雜交育種，獲得F1代四倍體白菜即為所述的四倍體不結球白菜。
2.根據(jù)權利要求1所述的四倍體不結球白菜的育種方法，其特征在于所述的方法具體 包含如下步驟1)2n雄配子的誘導誘變二倍體不結球白菜產(chǎn)生2n花粉的秋水仙素溶液濃度為 0. 05 % (g/ml，下文同)、0. 10 %和0. 20 %，在二倍體不結球白菜抽薹期處理花蕾，每天兩 次，花蕾大小2. 5 3. 5mm,采用微量注射法，每個花蕾注射5 10 y L，每隔6h處理一次， 每個濃度處理2次，以未處理植株為對照，然后套袋隔離，2n花粉特征為廣橢圓形，平均長 度為165. 27微米，平均寬度為103. 72微米，染色體數(shù)為2x = 20 ；2)人工有性多倍化雜交以四倍體雄性不育系為母本，以秋水仙素誘導含2n配子的二 倍體為父本，及未處理的為父本對照在花期分別進行人工蕾期雜交，共配30株，第3天重復 授粉1次，夏初收獲&四倍體種子。
3.根據(jù)權利要求2所述的四倍體不結球白菜的育種方法，其特征在于所述的秋水仙素 溶液處理花蕾的時間為春天二倍體不結球白菜抽薹期早晨8:00-9:00和下午2:00-3:00， 處理溫度分別為20°C -25°C，和不低于18°C。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的四倍體不結球白菜的育種方法，其特征在于所述的經(jīng) 秋水仙素誘變2n花粉及有性多倍化雜交獲得的四倍體不結球白菜&為四月白春化型，株 型直立束腰，株高28 31厘米，開展度28 34厘米，葉片近圓形，黃綠色、葉柄白色、扁 平，單株重0. 5 0. 6千克，與二倍體對照父本相比表現(xiàn)出巨大性，F(xiàn)1植株生長勢強，葉片 近圓形，葉片皺縮，葉脈清晰，菜頭粗、單株質(zhì)量、株高、開展度、葉片數(shù)、葉片寬、十片葉總質(zhì) 量、葉片長、葉柄質(zhì)量、葉柄長、葉柄寬、十片葉總厚度和葉柄厚比二倍體分別增加33. 81%, 116. 95 %,55. 68 %Al. 54 % A6. 15 %A3. 43 %,32. 18 %U9. 81 %U5. 91 %,87. 2427. 55 %,129. 79 %和97. 72 %，花瓣顏色加深，形狀變圓，長和寬分別增加82.61 % 和103. 28%，氣孔長和寬分別增加93. 95%和71. 07 %，角果長、橫寬、和喙長分別增加 45. 33%,63. 33%、和132. 14%，但氣孔密度減少49. 58%,以上形狀差異達極顯著水平；經(jīng) 細胞學鑒定，該有性多倍化四倍體其體細胞染色體數(shù)為2n = 4x = 40，而二倍體父本體細胞 染色體數(shù)為2n = 2x = 20。
5.根據(jù)權利要求1或2所述的四倍體不結球白菜的育種方法，其特征在于所述的四倍 體雄性不育系選擇按照中國專利ZL03113283. 9制備的四倍體雄性不育系。
6.根據(jù)權利要求1或2所述的四倍體不結球白菜的育種方法，其特征在于所述的二倍 體不結球白菜選擇二倍體不結球白菜“亮白葉”。
7.一種利用權利要求1所述的育種方法獲得的四倍體不結球白菜品種，其特征在于 由該品種的四倍體不結球白菜為四月白春化型，株型直立束腰，株高28 31厘米，開展 度28 34厘米，葉片近圓形，黃綠色、葉柄白色、扁平，單株重0. 5 0. 6千克，與二倍體 對照父本相比表現(xiàn)出巨大性，本發(fā)明四倍體不結球白菜植株生長勢強，葉片近圓形，葉片 皺縮，葉脈清晰，菜頭粗、單株質(zhì)量、株高、開展度、葉片數(shù)、葉片寬、十片葉總質(zhì)量、葉片長、 葉柄質(zhì)量、葉柄長、葉柄寬、十片葉總厚度和葉柄厚比二倍體分別增加33. 81%U16. 95%, ·55. 68 %Al. 54 % A6. 15 %A3. 43 %,32. 18 %U9. 81 %U5. 91 %,87. 24 %,27. 55 129. 79%和97. 72%，花瓣顏色加深，形狀變圓，長和寬分別增加82. 61%和103. 28%，氣孔 長和寬分別增加93. 95%和71. 07%，角果長、橫寬、和喙長分別增加45. 33%,63. 33%、和 132. 14%，但氣孔密度減少49. 58%，以上形狀差異達極顯著水平；經(jīng)細胞學鑒定，該四倍 體不結球白菜體細胞染色體數(shù)為2n = 4x = 40。
全文摘要
本發(fā)明屬農(nóng)作物育種領域，公開了一種四倍體不結球白菜的有性多倍化育種方法。該育種方法是在二倍體不結球白菜抽薹期使用秋水仙素溶液處理花蕾誘導產(chǎn)生2n雄配子；以四倍體雄性不育系為母本，以所述的秋水仙素誘導得到的含2n雄配子的二倍體為父本在花期進行人工有性多倍化雜交育種，獲得所述的四倍體不結球白菜。本發(fā)明首次采用四倍體不結球白菜雄性不育系×誘變產(chǎn)生2n配子的二倍體不結球白菜的有性多倍化育種途徑，獲得四倍體不結球白菜新種質(zhì)，與無性多倍化的同源四倍體相比具有更廣泛的遺傳多樣性，更高的結實率。本發(fā)明新四倍體具有多倍體的巨大性、抗病性、耐寒性，品質(zhì)好，還具有二倍體父本的性狀。
文檔編號A01H5/00GK101946696SQ20101052985
公開日2011年1月19日 申請日期2010年11月3日 優(yōu)先權日2010年11月3日
發(fā)明者于旭紅, 侯喜林, 劉惠吉, 張蜀寧, 李式軍, 李英, 鐘程 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學