專利名稱：中砧1號(hào)組織培養(yǎng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，特別涉及中砧1號(hào)組織培養(yǎng)的方法。
背景技術(shù)：
蘋果是世界上列柑橘、香蕉、葡萄之后的第四大水果，也是我國(guó)栽培面積最大、產(chǎn) 量最多的水果。我國(guó)蘋果生產(chǎn)具有悠久的栽培歷史，有較豐富的管理經(jīng)驗(yàn)，已形成了種苗繁 育、生產(chǎn)栽培、采后加工儲(chǔ)藏和深加工的產(chǎn)業(yè)鏈。但從總體來講，目前我國(guó)的蘋果生產(chǎn)和發(fā) 達(dá)國(guó)家相比，樹種品種結(jié)構(gòu)不合理，大多數(shù)還存在經(jīng)營(yíng)粗放、栽培管理水平不高、果品質(zhì)量 較差、效益不高的現(xiàn)象。要轉(zhuǎn)變這種廣種薄收、高投入低產(chǎn)出的現(xiàn)狀，加強(qiáng)對(duì)現(xiàn)有低產(chǎn)園的 改造，提高單產(chǎn)和果品品質(zhì)，矮化密植是主要的發(fā)展趨勢(shì)，選用矮化砧木是實(shí)現(xiàn)矮化密植栽 培的前提與途徑(朱樹華，郁松林，權(quán)俊萍，石河子大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2003 (4))。我國(guó)育成的蘋果矮化砧木，在正常條件下扦插壓條都不易發(fā)根，無性繁殖困難，只 能采用中間砧方式利用。而實(shí)生砧苗壓條繁殖雖容易生根，可進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)繁殖，擴(kuò)大繁殖系 數(shù)，但是基礎(chǔ)材料不足限制推廣速度。小金海棠(Malusxiaojinensis Cheng et Jiang)是蘋果屬的四倍體(2n = 4x = 68)野生種質(zhì)資源，作蘋果砧木利用，其綜合性狀優(yōu)良，是很有希望的蘋果半矮化砧木(成 明昊，楊曉紅，曾繼光，1984，西南農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，3 :38 43)。中砧1號(hào)是中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)歷時(shí) 25年從中選出的耐缺鐵優(yōu)良種質(zhì)，具有耐鹽堿、耐熱、耐旱、耐澇、抗寒(_45°C )、抗白粉病、 固地性好等特性，對(duì)潛隱病毒也有較強(qiáng)的抗性，嫁接紅富士、紅星、金冠、國(guó)光、北斗、王林等 蘋果品種也表現(xiàn)嫁接親和性好。去雄套袋后花朵坐果率為86. 7%，具有無融合生殖特性，實(shí) 生苗整齊一致，也可用實(shí)生苗壓條擴(kuò)大繁殖系數(shù)。但中砧1號(hào)果實(shí)出種率很低，平均每果飽 滿種子數(shù)僅0. 9粒，約需200斤果實(shí)出一斤種子，所以實(shí)生繁殖遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)要求。組織培養(yǎng)作為生物工程的一項(xiàng)重要技術(shù)，近年來已在生物科學(xué)領(lǐng)域獲得了長(zhǎng)足發(fā)展， 尤其是園藝植物的應(yīng)用上取得了豐碩成果。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前通過組織培養(yǎng)繁殖的果樹包括多 個(gè)科的多個(gè)種，外植體類型從莖尖、葉片、花藥、胚乳、葉肉原生質(zhì)體等均再生出植株，其中以莖尖 培養(yǎng)的研究較多、進(jìn)展快，在一些果樹種類上已進(jìn)入實(shí)用階段(張慶田，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007)。木本植物組培苗生根普遍困難，關(guān)于這一問題的解釋已趨向一致除了基因型的 差別外，年齡時(shí)期起了主要作用。在排除了基因型和年齡時(shí)期對(duì)生根的影響外，外源生長(zhǎng)素 對(duì)組培苗生根的誘導(dǎo)作用得到了廣泛的認(rèn)可；而且在生長(zhǎng)素完成了誘導(dǎo)作用后，它們?cè)谂?養(yǎng)基中的存在對(duì)新根的發(fā)生有抑制作用。中砧1號(hào)屬于木本植物，其在組織培養(yǎng)是發(fā)生褐變的問題很嚴(yán)重，隨著苗齡增大 褐變程度也有所增加，從而給這一類植物的組織培養(yǎng)快速繁殖帶來了很大的困難。目前尚未有對(duì)中砧1號(hào)建立高效組培快繁技術(shù)體系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種生產(chǎn)中砧1號(hào)再生苗的方法。
4
本發(fā)明提供生產(chǎn)中砧1號(hào)再生苗的方法是將中砧1號(hào)種子經(jīng)無菌預(yù)培養(yǎng)，得到無 菌苗，然后將所述無菌苗的莖尖進(jìn)行初代培養(yǎng)，得到再生苗。上述無菌預(yù)培養(yǎng)是所述中砧1號(hào)種子接種到預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；所述預(yù)培養(yǎng) 的培養(yǎng)基是在水中添加碳源和凝膠劑得到的固體培養(yǎng)基；所述凝膠劑是瓊脂或卡拉膠，優(yōu)選是瓊脂，所述瓊脂在所述預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的 終濃度優(yōu)選是7g/L ；所述碳源是蔗糖或麥芽糖，優(yōu)選是蔗糖，所述蔗糖在所述預(yù)培養(yǎng)的培 養(yǎng)基中的終濃度優(yōu)選是30g/L。上述初代培養(yǎng)是將所述無菌苗的莖尖接種到初代培養(yǎng)基上培養(yǎng)，所述初代培養(yǎng)基 是在MS基本培養(yǎng)液中添加6-BA、NAA、碳源和凝膠劑得到的固體培養(yǎng)基；其中所述6-BA的 終濃度為0. 5-2. 0mg/L,NAA的終濃度為0. 01-0. 10mg/L ；所述6-BA的終濃度優(yōu)選為1. Omg/ L ；NAA的終濃度為0. 05mg/L ；所述MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表1所示。表1. MS基本培養(yǎng)液的溶質(zhì)(mg/L)
CuS04-5H20L ‘ ■ 0.025有機(jī)物肌醇100鹽酸硫胺素VBl0.4鹽酸吡哆醇VB60.5煙酸0.5甘氨酸2鐵鹽乙二胺四乙酸鈉鐵421.1
上述初代培養(yǎng)基中的凝膠劑是瓊脂、卡拉膠或Gelrite，優(yōu)選是瓊脂；所述凝膠劑 在所述初代培養(yǎng)基中的終濃度是7g/L ；上述初代培養(yǎng)基中的碳源是葡萄糖、麥芽糖或蔗糖，優(yōu)選為蔗糖；所述碳源在所述 初代培養(yǎng)基中的終濃度是30g/L。本發(fā)明的另一目的在于提供一種生產(chǎn)中砧1號(hào)再生植株的方法。本發(fā)明提供的生產(chǎn)中砧1號(hào)再生植株的方法包括以下步驟1)根據(jù)任一上述的方法制備得到再生苗；2)將步驟1)中得到再生苗進(jìn)行生根培養(yǎng)，得到完整的再生植株。步驟2)中，所述生根培養(yǎng)包括以下步驟將所述再生苗在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)；所 述生根培養(yǎng)基是在1/2MS基本培養(yǎng)液中添加如下物質(zhì)得到的固體培養(yǎng)基IBA、碳源和凝膠 劑；所述生根培養(yǎng)基中IBA的終濃度是0. 01-2. 00mg/L，優(yōu)選是0. 50mg/L ；所述1/2MS基本 培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)是將表1所示的溶質(zhì)中的大量元素減半，微量元素、有機(jī)物和鐵鹽 濃度不變得到的溶質(zhì)。上述生根培養(yǎng)基中的凝膠劑是瓊脂、卡拉膠或Gelrite，優(yōu)選是瓊脂；所述凝膠劑 在所述生根培養(yǎng)基中的終濃度是7g/L ；所述生根培養(yǎng)基中的碳源是葡萄糖、麥芽糖或蔗糖，優(yōu)選為蔗糖；所述碳源在所述 生根培養(yǎng)基中的終濃度是30g/L。上述生根培養(yǎng)的步驟中，所述再生苗在進(jìn)入生根培養(yǎng)基之前還經(jīng)過預(yù)生根的步 驟；所述預(yù)生根是將所述再生苗置于預(yù)生根培養(yǎng)基中進(jìn)行；所述預(yù)生根培養(yǎng)基是在MS基本 培養(yǎng)液中添加6-BA、NAA、碳源和凝膠劑得到的固體培養(yǎng)基；所述預(yù)生根培養(yǎng)基，所述6-BA 的終濃度為0. 25mg/L, NAA的終濃度為0. 05mg/L ；所述MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如 表1所示。進(jìn)一步，上述方法還包括步驟1)和步驟2)之間的繼代培養(yǎng)，所述繼代培養(yǎng)是將步 驟1)得到的再生苗轉(zhuǎn)接到擴(kuò)繁培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到增殖的再生苗；所述擴(kuò)繁培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)液中添加6-BA、NAA、碳源和凝膠劑得到的固體 培養(yǎng)基；其中6-BA的終濃度為0. 05-1. 00mg/L,NAA的終濃度為0. 05-1. OOmg/1 ；所述6-BA 的終濃度優(yōu)選是0. 5mg/L, NAA的終濃度優(yōu)選是0. 5mg/L ；所述MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、 溶質(zhì)如表1所示。上述預(yù)生根培養(yǎng)基和擴(kuò)繁培養(yǎng)基中，所述凝膠劑均是瓊脂、卡拉膠或Gelrited^ 優(yōu)選是瓊脂；所述凝膠劑在預(yù)生根培養(yǎng)基和擴(kuò)繁培養(yǎng)基中的終濃度均是7g/L ；上述預(yù)生根培養(yǎng)基和擴(kuò)繁培養(yǎng)基的碳源均是葡萄糖、麥芽糖或蔗糖，均優(yōu)選為蔗 糖；所述碳源在所述預(yù)生根培養(yǎng)基和擴(kuò)繁培養(yǎng)基中的終濃度均是30g/L。實(shí)驗(yàn)證明在生產(chǎn)中砧1號(hào)再生苗之前先經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的話，預(yù)培養(yǎng)苗的莖尖分化 率達(dá)87. 77%，并且初代接種6-7天后，即啟動(dòng)開始生長(zhǎng)，特別是帶子葉的莖尖，啟動(dòng)生長(zhǎng)更 快(約5天)；而普通營(yíng)養(yǎng)土培養(yǎng)小苗的莖尖的分化率僅為21. 07%，并且生長(zhǎng)在營(yíng)養(yǎng)土上 的中砧1號(hào)的莖尖，接種后，啟動(dòng)很慢。將再生苗進(jìn)行生根之前優(yōu)選是先經(jīng)過預(yù)生根培養(yǎng)， 經(jīng)生根預(yù)培養(yǎng)后，分化新梢數(shù)減少，節(jié)間伸長(zhǎng)，葉片伸展，葉色變深，葉面積明顯大于未經(jīng)生 根預(yù)培養(yǎng)苗；其株高、莖粗度、生根率、平均單株數(shù)和單株長(zhǎng)度皆顯著地大于未經(jīng)生根預(yù)培 養(yǎng)苗(表5)。
本發(fā)明以種子為外植體材料，以無菌苗進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)的方式，保證了優(yōu)良性狀的遺 傳穩(wěn)定性；本發(fā)明還完善了殺菌處理方法；同時(shí)篩選出了適合防褐化物質(zhì)和激素種類，及 各物質(zhì)的濃度，解決了目前研究中存在的污染和褐化問題，成功建立了中砧1號(hào)的無菌培 養(yǎng)體系。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中砧1號(hào)在擴(kuò)繁培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況。圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中砧1號(hào)的生根情況。圖3為本發(fā)明實(shí)施例1移栽的中砧1號(hào)再生植株。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。下述實(shí)施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。以下實(shí)施例中6-卞氨基嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)均購(gòu)自亞太恒信生物科技(北 京)有限公司。升汞購(gòu)自上海開通化工有限公司。瓊脂、蔗糖、封口膜、75%乙醇、硝酸銨、硝酸鈣、硫酸鉀、氯化鈣、磷酸二氫鉀、硫酸 鎂、鉬酸鈉、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸銅、硼酸、乙二胺四乙酸鈉鐵、甘氨酸、肌醇、Ph試紙、鹽酸 硫胺素、鹽酸吡哆醇、核黃素均購(gòu)自北京廣達(dá)恒益科技有限公司。實(shí)施例1、制備中砧1號(hào)再生植株及其觀察統(tǒng)計(jì)與分析1、外植體的獲得1)預(yù)培養(yǎng)得到預(yù)培養(yǎng)苗將中砧1號(hào)(該材料已經(jīng)于2009年12月30.日由北京市林木品種審定委員會(huì) 審定為林木良種，良種編號(hào)為京S-SV-MX-015-2009，此信息可從2010年1月16日發(fā)布的 《2009年北京市林木品種審定公告》上查詢，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得)的種子進(jìn)行層積 處理，待種子開始發(fā)芽至胚根長(zhǎng)到2cm以上時(shí)，將其小心地插入預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中，放入光照 培養(yǎng)箱中，溫度控制在23°C，光照強(qiáng)度為2000-2500LX，光周期(光照/黑暗)16h/8h條件 下培養(yǎng)，待種皮脫掉后得到預(yù)培養(yǎng)苗。上述預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基是在水中添加蔗糖和瓊脂得到的固體培養(yǎng)基，瓊脂在培養(yǎng)基中 的終濃度為7g/L。蔗糖在培養(yǎng)基中的終濃度為30g/L。2)非預(yù)培養(yǎng)獲得外植體將中砧1號(hào)的種子進(jìn)行層積處理，待種子開始發(fā)芽，將其播種于營(yíng)養(yǎng)土中，出土生 長(zhǎng)為小苗。2、外植體的預(yù)處理1)預(yù)培養(yǎng)苗的預(yù)處理將上述步驟1中步驟1)得到的預(yù)培養(yǎng)苗的莖尖(包括帶子葉的莖尖)切下，在超 凈工作臺(tái)上消毒，即用質(zhì)量濃度為0. 的HgCl2滅菌5分鐘后，再用無菌水沖洗3遍。2)非預(yù)培養(yǎng)(營(yíng)養(yǎng)土培養(yǎng))的外植體的預(yù)處理切取上述步驟1中步驟2)得到的小苗的莖尖(可帶子葉)用蒸餾水沖去泥土，在超凈工作臺(tái)上分別用以下①_⑦的消毒方案進(jìn)行消毒(設(shè)7個(gè)處理，每個(gè)處理16-37個(gè)莖 尖)，再用無菌水沖洗干凈。消毒方案為①先用2%新潔爾滅消毒2分鐘，再用1 1的過氧乙酸水溶液消毒5分鐘，無菌 水洗3遍；②先用75%酒精消毒1分鐘，再用0. 1 %的HgCl2消毒5分鐘，無菌水洗3遍；③先用75%酒精消毒2分鐘，再用0. 的HgCl2消毒5分鐘，不用無菌水沖洗；④先用75%酒精消毒1分鐘，再用0. 01 %的HgCl2消毒8分鐘，無菌水洗3遍；⑤先用2%新潔爾滅消毒10分鐘，再用漂白粉飽和液浸泡20分鐘，無菌水沖洗3 遍；⑥先用洗衣粉液浸泡5分鐘，再用75%酒精消毒1分鐘，然后用漂白粉飽和液浸泡 20分鐘，無菌水沖洗3遍；⑦先用洗衣粉液浸泡5分鐘，再用75%酒精消毒1分鐘，然后0. 的HgCl2消毒 5分鐘，無菌水洗3遍。3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)3、10、17天后，分別統(tǒng)計(jì)預(yù)培養(yǎng)苗的莖尖和營(yíng)養(yǎng)土培養(yǎng)的小苗的莖尖的污染 情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，經(jīng)步驟1)預(yù)培養(yǎng)苗的莖尖污染率為0%。經(jīng)步驟2)非預(yù)培養(yǎng)(營(yíng)養(yǎng) 土培養(yǎng))小苗的污染率實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。表2、營(yíng)養(yǎng)土培養(yǎng)苗的莖尖的芽污染情況(重復(fù)三次)
處理3天后污染率(％) 10天后污染率(％) 17天后污染率(％)
①5515
②1139.539.5
③51010
④055 181818
⑥696969
⑦033從上面結(jié)果看，處理③、④、⑦污染率較低，處理①、⑤其次，處理⑥污染率最高，說 明在本培養(yǎng)試材的消毒中，HgCl2殺菌效果最好，以下的實(shí)驗(yàn)涉及營(yíng)養(yǎng)土培養(yǎng)的小苗都是采 用第⑦種方法處理的。3、初代培養(yǎng)得到再生苗及觀察統(tǒng)計(jì)與分析1)獲得再生苗分別將上述步驟2中預(yù)處理過的預(yù)培養(yǎng)苗的莖尖和營(yíng)養(yǎng)土培養(yǎng)的小苗的莖尖接 種于初代培養(yǎng)基上，在溫度為23士2°C，相對(duì)濕度為50-60%、光強(qiáng)為2000-2500LX，每天光 照為10小時(shí)的條件下，培養(yǎng)6-7天后，莖尖開始生長(zhǎng)，培養(yǎng)至30天，得到再生苗。上述初代培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)液中添加6-BA、NAA、碳源和凝膠劑得到的固體
8培養(yǎng)基；其中6-BA的終濃度為1. Omg/L, NAA的終濃度為0. 05mg/L，碳源為蔗糖，蔗糖的終 濃度為30g/L，凝膠劑是瓊脂，瓊脂的終濃度為7g/L ；MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表1 所示，培養(yǎng)基的PH為5. 8。2)觀察統(tǒng)計(jì)與分析I、觀察統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)15天后，分別統(tǒng)計(jì)預(yù)培養(yǎng)苗的莖尖和營(yíng)養(yǎng)土培養(yǎng)的小苗的莖尖的芽分化情 況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3和表4所示預(yù)培養(yǎng)苗的莖尖分化率為87. 77%,營(yíng)養(yǎng)土 培養(yǎng)小苗的莖尖的分化率為21. 07%。表3、預(yù)培養(yǎng)苗的莖尖的芽分化情況(重復(fù)三次) 表4、營(yíng)養(yǎng)土培養(yǎng)小苗的莖尖的芽分化情況(J■復(fù)三次)
II、分析對(duì)上述步驟3的步驟1)中的試驗(yàn)進(jìn)行觀察分析①取自無菌苗預(yù)培養(yǎng)方式(即預(yù)培養(yǎng)苗)的莖尖，接種后未發(fā)生褐變問題，這類似 于快速增殖階段繼代培養(yǎng)時(shí)的材料，對(duì)機(jī)械傷害不發(fā)生褐變反應(yīng)。取營(yíng)養(yǎng)土培養(yǎng)小苗的莖尖，接種后會(huì)發(fā)生褐變，且隨著苗齡增大褐變程度有所增 加。②取自無菌苗預(yù)培養(yǎng)方式(即預(yù)培養(yǎng)苗)的莖尖，初代接種6-7天后，即啟動(dòng)開始 生長(zhǎng)，特別是帶子葉的莖尖，啟動(dòng)生長(zhǎng)更快(約5天)，這種特點(diǎn)類似于快速增殖階段的繼代 培養(yǎng)，接種后很快開始生長(zhǎng)。生長(zhǎng)在營(yíng)養(yǎng)土上的中砧1號(hào)的莖尖，接種后，啟動(dòng)很慢，以至于后面培養(yǎng)成功的再 生植株沒有一株是來自于這種方式的。③上述步驟3的步驟1)中預(yù)培養(yǎng)苗消毒后污染率為0%。營(yíng)養(yǎng)土培養(yǎng)小苗的莖尖消毒后采用第7種方法污染率為3%。由此可以分析得知預(yù)培養(yǎng)方法使植物材料一定程度上適應(yīng)了試管內(nèi)的環(huán)境，從 而能夠繼續(xù)生長(zhǎng)。4、繼代培養(yǎng)
將步驟2中步驟1)得到的再生苗轉(zhuǎn)接到擴(kuò)繁培養(yǎng)基上，在溫度為23士2°C，相對(duì)濕 度為50-60%、光強(qiáng)為2000-2500LX，每天光照為10小時(shí)的條件下培養(yǎng)，每25天繼代一次， 得到數(shù)量增殖的再生苗(如圖1所示)。上述繼代培養(yǎng)的次數(shù)可根據(jù)所需再生苗的數(shù)量決定。上述擴(kuò)繁培養(yǎng)基是在是在MS基本培養(yǎng)液中添加6-BA、NAA、碳源和凝膠劑得到的 固體培養(yǎng)基；其中，碳源為蔗糖，蔗糖的終濃度為30g/L，凝膠劑是瓊脂，瓊脂的終濃度為 7g/L，6-BA的終濃度為0. 5mg/L,NAA的終濃度為0. 5mg/L，MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì) 如表1所示，培養(yǎng)基的PH為5. 8。5、生根培養(yǎng)及統(tǒng)計(jì)觀察1)預(yù)生根培養(yǎng)將上述步驟4中得到的再生苗接種到預(yù)生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件溫度為 23士2°C，相對(duì)濕度為50-60%、光強(qiáng)為2000-2500LX，每天光照為10小時(shí)。所述預(yù)生根培養(yǎng) 基是在MS基本培養(yǎng)液中添加6-BA、NAA、蔗糖和瓊脂得到的固體培養(yǎng)基；所述預(yù)生根培養(yǎng) 基，所述6-BA的終濃度為0. 25mg/L, NAA的終濃度為0. 05mg/L，蔗糖的終濃度為30g/L，瓊 脂的終濃度為7g/L ；所述MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表1所示。2)生根培養(yǎng)獲得再生植株將上述步驟4得到的再生苗以及步驟5的1)預(yù)培養(yǎng)得到的苗接種到生根培養(yǎng)基 中，在溫度為23士2°C，相對(duì)濕度為50-60%，光強(qiáng)為2000-2500LX，每天光照為10小時(shí)條件 下，培養(yǎng)30天，得到中砧1號(hào)再生植株(如圖2所示)。上述生根培養(yǎng)基是在1/2MS基本培養(yǎng)液中添加如下物質(zhì)得到的固體培養(yǎng)基IBA、 碳源和凝膠劑；其中IBA的終濃度是0. 50mg/L，碳源為蔗糖，蔗糖的終濃度為30g/L，凝膠劑 是瓊脂，瓊脂的終濃度為7g/L ；所述1/2MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)是將表1所示的溶 質(zhì)中的大量元素減半以后得到的溶質(zhì)。培養(yǎng)基的PH為5. 8。統(tǒng)計(jì)觀察實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)觀察上述經(jīng)過步驟1)預(yù)生根后的步驟2)中生根培養(yǎng)的生根 情況，并以未進(jìn)行上述步驟1)預(yù)生根直接進(jìn)行步驟2)的生根培養(yǎng)為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下 表5。表5生根預(yù)培養(yǎng)與否對(duì)不定根發(fā)生的影響 注**表示在0.01水平下差異極顯著。觀察中砧1號(hào)試管苗在快速增值階段，分化新梢數(shù)增多，新梢生長(zhǎng)緩苗。這種試 管苗經(jīng)生根預(yù)培養(yǎng)后，分化新梢數(shù)減少，節(jié)間伸長(zhǎng)，葉片伸展，葉色變深，葉面積明顯大于未 經(jīng)生根預(yù)培養(yǎng)苗；其株高、莖粗度、生根率、平均單株數(shù)和單株長(zhǎng)度皆顯著地大于未經(jīng)生根 預(yù)培養(yǎng)苗。由此可以看出，培育優(yōu)質(zhì)健壯的試管苗可以顯著提高生根率。木本植物組培苗生根普遍困難，關(guān)于這一問題的解釋已趨向一致除了基因型的 差別外，年齡時(shí)期起了主要作用，處于成年期狀態(tài)的組培苗生根困難，而處于幼年期狀態(tài)的 和經(jīng)過多代培養(yǎng)從成年期狀態(tài)回轉(zhuǎn)到童年期狀態(tài)的組培苗，生根要容易得多。在排除了基 因型和年齡時(shí)期對(duì)生根的影響外，外源生長(zhǎng)素對(duì)組培苗生根的誘導(dǎo)作用得到了廣泛的認(rèn) 可；而且在生長(zhǎng)素完成了誘導(dǎo)作用后，它們?cè)谂囵B(yǎng)基中的存在對(duì)新根的發(fā)生有抑制作用。含 低濃度生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中生根，效果明顯優(yōu)于含有高濃度生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基。6、煉苗移栽將步驟5中得到的生根良好的再生植株進(jìn)行煉苗，移栽到添加蛭石加草炭土(蛭 石與草炭土的比例為1 1)的基質(zhì)中(如圖3所示)，成活率最高，可達(dá)93.3%，并且移栽 后組培養(yǎng)緩苗時(shí)間短，地上部開始生長(zhǎng)早，根系發(fā)育良好。
權(quán)利要求
一種生產(chǎn)中砧1號(hào)再生苗的方法，是將中砧1號(hào)種子經(jīng)無菌預(yù)培養(yǎng)，得到無菌苗，然后將所述無菌苗的莖尖進(jìn)行初代培養(yǎng)，得到再生苗。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述無菌預(yù)培養(yǎng)是所述中砧1號(hào)種子接種 到預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；所述預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基是在水中添加碳源和凝膠劑得到的固體培養(yǎng)基；所述凝膠劑是瓊脂或卡拉膠，優(yōu)選是瓊脂，所述瓊脂在所述預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的終濃 度優(yōu)選是7g/L ；所述碳源是蔗糖或麥芽糖，優(yōu)選是蔗糖，所述蔗糖在所述預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基 中的終濃度優(yōu)選是30g/L。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述初代培養(yǎng)是將所述無菌苗的莖 尖接種到初代培養(yǎng)基上培養(yǎng)，所述初代培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)液中添加6-BA、NAA、碳源 和凝膠劑得到的固體培養(yǎng)基；其中所述6-BA的終濃度為0. 5-2. Omg/L, NAA的終濃度為 0. 01-0. 1 Omg/L ；所述6-BA的終濃度優(yōu)選為1. Omg/L ；NAA的終濃度為0. 05mg/L ；所述MS基 本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表1所示。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述初代培養(yǎng)基中的凝膠劑是瓊脂、卡拉膠 或Gelrite，優(yōu)選是瓊脂；所述凝膠劑在所述初代培養(yǎng)基中的終濃度是7g/L ；所述初代培養(yǎng)基中的碳源是葡萄糖、麥芽糖或蔗糖，優(yōu)選為蔗糖；所述碳源在所述初代 培養(yǎng)基中的終濃度是30g/L。
5.一種生產(chǎn)中砧1號(hào)再生植株的方法，包括以下步驟1)根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法制備得到再生苗；2)將步驟1)中得到再生苗進(jìn)行生根培養(yǎng)，得到完整的再生植株。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟2)中，所述生根培養(yǎng)包括以下步驟將 所述再生苗在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)；所述生根培養(yǎng)基是在1/2MS基本培養(yǎng)液中添加如下物質(zhì) 得到的固體培養(yǎng)基IBA、碳源和凝膠劑；所述生根培養(yǎng)基中IBA的終濃度是0. 01-2. OOmg/ L，優(yōu)選是0. 50mg/L ；所述V2MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)是將表1所示的溶質(zhì)中的大 量元素減半，微量元素、有機(jī)物和鐵鹽濃度不變得到的溶質(zhì)。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述生根培養(yǎng)基中的凝膠劑是瓊脂、卡拉膠 或Gelrite，優(yōu)選是瓊脂；所述凝膠劑在所述生根培養(yǎng)基中的終濃度是7g/L ；所述生根培養(yǎng)基中的碳源是葡萄糖、麥芽糖或蔗糖，優(yōu)選為蔗糖；所述碳源在所述生根 培養(yǎng)基中的終濃度是30g/L。
8.如權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述生根培養(yǎng)的步驟中，所述再生苗在 進(jìn)入生根培養(yǎng)基之前還經(jīng)過預(yù)生根的步驟；所述預(yù)生根是將所述再生苗置于預(yù)生根培養(yǎng)基 中進(jìn)行；所述預(yù)生根培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)液中添加6-BA、NAA、碳源和凝膠劑得到的固體 培養(yǎng)基；所述預(yù)生根培養(yǎng)基，所述6-BA的終濃度為0. 25mg/L,NAA的終濃度為0. 05mg/L ；所 述MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表1所示。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8中任一所述的方法，其特征在于所述方法還包括步驟1)和步驟 2)之間的繼代培養(yǎng)，所述繼代培養(yǎng)是將步驟1)得到的再生苗轉(zhuǎn)接到擴(kuò)繁培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得 到增殖的再生苗；所述擴(kuò)繁培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)液中添加6-BA、NAA、碳源和凝膠劑得到的固體培養(yǎng) 基；其中6-BA的終濃度為0. 05-1. 00mg/L,NAA的終濃度為0. 05-1. 00mg/l ；所述6-BA的終濃度優(yōu)選是0. 5mg/L, NAA的終濃度優(yōu)選是0. 5mg/L ；所述MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì) 如表1所示。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于所述預(yù)生根培養(yǎng)基和擴(kuò)繁培養(yǎng)基中， 所述凝膠劑均是瓊脂、卡拉膠或Gelrite，均優(yōu)選是瓊脂；所述凝膠劑在預(yù)生根培養(yǎng)基和擴(kuò) 繁培養(yǎng)基中的終濃度均是7g/L ；所述預(yù)生根培養(yǎng)基和擴(kuò)繁培養(yǎng)基的碳源均是葡萄糖、麥芽糖或蔗糖，均優(yōu)選為蔗糖；所 述碳源在所述預(yù)生根培養(yǎng)基和擴(kuò)繁培養(yǎng)基中的終濃度均是30g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種中砧1號(hào)組織培養(yǎng)的方法。該方法是將中砧1號(hào)種子經(jīng)無菌預(yù)培養(yǎng)，得到無菌苗，然后將所述無菌苗的莖尖進(jìn)行初代培養(yǎng)，得到再生苗。實(shí)驗(yàn)證明在生產(chǎn)中砧1號(hào)再生苗之前先經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的話，預(yù)培養(yǎng)苗的莖尖分化率達(dá)87.77％；而普通營(yíng)養(yǎng)土培養(yǎng)小苗的莖尖的分化率僅為21.07％。本發(fā)明以種子為外植體材料，以無菌苗進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)的方式，保證了優(yōu)良性狀的遺傳穩(wěn)定性；本發(fā)明還完善了殺菌處理方法；同時(shí)篩選出了適合防褐化物質(zhì)和激素種類，及各物質(zhì)的濃度，解決了目前研究中存在的污染和褐化問題，成功建立了中砧1號(hào)的無菌培養(yǎng)體系。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101926287SQ20101027379
公開日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2010年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月6日
發(fā)明者孫揚(yáng)吾, 張新忠, 沈雋, 王憶, 許雪峰, 韓振海 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)