專利名稱：酪氨酸酶多肽抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酪氨酸酶抑制劑，特別是涉及一種含有多肽的酪氨酸酶抑制劑。
技術(shù)背景
1.黑色素的來源及功能
在胚胎發(fā)育時，由神經(jīng)嵴(neuralcrest)分化出的黑色素細胞(melanocytes)，會分布在皮膚(表皮基底層)、眼睛-視網(wǎng)膜色素上皮、葡萄膜(uvealtract)、毛囊基質(zhì)、耳朵-血管紋(striavascularis)、黏膜和中樞神經(jīng)系統(tǒng)-軟腦膜(Ieptomeninges) 0在黑色素細胞中有一膜結(jié)合(membrane-bound)胞器稱為黑色素體(melanosomes)會合成黑色素(melanin)，當(dāng)黑色素合成出來后，會由黑色素細胞的樹枝狀突起移動至鄰近的角質(zhì)細胞 (keratinocytes)，進而呈現(xiàn)出皮膚的顏色，而皮膚顏色的不同主要是因為黑色素的產(chǎn)生和分布不同。黑色素的主要功能是吸收陽光中的紫外光(UV)，保護皮膚避免受到紫外光的傷害，并且能移除活性氧(reactive oxygen species，R0S)，以減少自由基對正常細胞的傷害。
2.黑色素的生合成路徑
酪氨酸(tyrosine)是黑色素生合成中重要的受質(zhì)。在反應(yīng)中，酪氨酸先被羥基化(hydroxylation):經(jīng)由酪氨酸酶(tyrosinase)的催化，在羥基(hydroxyl group) 的鄰位碳加上一個羥基，形成多巴(L-3，4-dihydroxyphenylalanine，L-dopa)，接著再將多巴轉(zhuǎn)換成多巴醌(dopaquinone)。然后多巴醌會走兩個途徑，第一個途徑，會經(jīng)由酪氨酸酶相關(guān)蛋白的催化形成帶棕、黑色的真黑色素(eumelanin)；另一個途徑，多巴醌經(jīng)由谷胱甘肽(glutathione)或半胱氨酸(cysteine)的作用，生成帶黃、紅色的深黑色素 (pheomelanin),如圖 1 所示。
3.酪氨酸酶的催化機制
酪氨酸酶(EC 1. 14. 18. 1)在黑色素的生合成中扮演很重要的角色。它是一種多功能、具醣基化的含銅穿膜蛋白，存在于黑色素細胞中，在哺乳類中分子量大小約為60-70kD， 且通常專一表現(xiàn)在黑色素細胞中，屬于第三型含銅蛋白質(zhì)(Type Scopperprotein)，在進行催化反應(yīng)時，銅離子是很重要的輔助因子。在催化過程中，活化位的結(jié)構(gòu)有三個不同形式，各自扮演不同的角色分別為氧化態(tài)(Oxy-form)、還原態(tài)(Deoxy-form)、靜止態(tài) (Met-form)。還原態(tài)酪氨酸酶不具活性，其活化位的銅離子帶正一價且不含氧離子，在催化反應(yīng)中，還原態(tài)酪氨酸酶需經(jīng)氧化作用，失去2個電子形成氧化態(tài)酪氨酸酶，此時活化位中具有帶正二價銅離子及帶負一價氧離子，氧化態(tài)酪氨酸酶可接受2種受質(zhì)，分別為酪氨酸和多巴，當(dāng)和酪氨酸結(jié)合時，會生成靜止態(tài)酪氨酸酶-多巴復(fù)合體(Met-E-Dopa)，在釋放出多巴醌后，酪氨酸酶又變成還原態(tài)繼續(xù)循環(huán)；另一方面當(dāng)與多巴結(jié)合時，除了生成多巴醌外，同時酪氨酸酶也由氧化態(tài)變成靜止態(tài)，此形式的酪氨酸酶如果和多巴作用會生成多巴醌，如果和酪氨酸結(jié)合，會形成不具催化作用的復(fù)合體而不會繼續(xù)黑色素生成途徑。由此可知，在催化過程中，氧化態(tài)酪氨酸酶扮演著重要的角色，如圖2所示。
4.酪氨酸酶的影響
酪氨酸酶是造成水果和蔬菜在貯存或加工時產(chǎn)生酵素性褐變的原因，褐變對某些產(chǎn)品的制造，可以賦予產(chǎn)品特殊的色澤及風(fēng)味，例如紅茶、葡萄干，但對大部分生鮮蔬果而言，酪氨酸酶是使得蔬菜水果的顏色和氣味改變、組織軟化、降低其消化性、抑制蛋白水解和糖分解的酵素，酪氨酸酶在催化過程中所產(chǎn)生的非營養(yǎng)及有毒化合物可能進一步使營養(yǎng)價值喪失，甚至影響食品的安全。在2003年Dr. Asanuma(參考文獻Neurotox Res 5， pl65_76，2003)則指出酪氨酸酶可能和帕金森氏癥(Parkinson's disease)以及其它的神經(jīng)退化性疾病有關(guān)。
5.酪氨酸酶抑制劑的應(yīng)用
5-1、在農(nóng)業(yè)及食品工業(yè)上
蔬菜水果發(fā)生褐變后，會影響其外觀、氣味以及食用上的味道，這是種植者和食品工業(yè)者所關(guān)心的問題。而酵素性褐變的發(fā)生速率是依據(jù)組織內(nèi)活化酪氨酸酶和酚類化合物的濃度、可利用的氧氣、PH值和溫度等條件來決定。因此，利用不同方法來停止由酪氨酸酶引起的酵素性褐變是必要的。酪氨酸酶抑制劑應(yīng)用在食品工業(yè)上也行之有年，傳統(tǒng)常用的褐變反應(yīng)抑制劑有抗壞血酸(ascorbic acid)、檸檬酸(citric acid)及亞硫酸鹽等，雖然亞硫酸鹽的抑制效果極佳，但卻有嚴重的副作用，因此，尋找天然且無害的酪氨酸酶抑制劑有其必要性。
5-2、在化妝品工業(yè)
酪氨酸酶抑制劑在化妝品工業(yè)上越來越重要是因為其具有美白功能。先前已發(fā)現(xiàn)的天然抑制劑包括熊果素(Arbutin)、曲酸(Kojic acid)、亞麻油酸(Linoleic acid)、對苯二酚(Hydroquinones)等，但僅有少數(shù)被用做皮膚美白劑，主要是因為這些天然的酪氨酸酶抑制劑可能會引發(fā)副作用。
目前衛(wèi)生署核準使用于美白化妝品的八種成分，如維他命C磷酸鎂鹽(Magnesium Ascorbyl Phosphate)、維他命 C 磷酸鈉鹽(Sodium Ascorbyl Phosphate)、維他命 C 醣苷 (Ascorbyl Glucoside)、曲酸(Kojioc Acid)、熊果素(Arbutin)、鞣花酸(Ellagic Acid)、 止血環(huán)酸(Tranexamic acid)和洋甘菊萃取物(Chamomile ET)，其中曲酸和熊果素即為酪氨酸酶抑制劑，可經(jīng)由抑制酪氨酸酶達到美白的功能，亦是美白保養(yǎng)品受歡迎的成分。
熊果素是由越橘科植物熊果葉抽取而得，一些水果中也可以發(fā)現(xiàn)熊果素的蹤跡， 例如西洋梨、小山梨。熊果素的結(jié)構(gòu)與衛(wèi)生署公告列為藥品之對苯二酚相似，經(jīng)皮膚吸收后會被水解成對苯二酚與葡萄糖，因此，其作用機轉(zhuǎn)與對苯二酚雷同，都是透過抑制酪氨酸酶的活性，淡化已形成的黑色素，然而對苯二酚可同時抑制黑色素形成和破壞黑色素細胞，使用初期美白及除斑的效果很好，但卻會對皮膚造成永久性傷害，如產(chǎn)生其它斑點或腐蝕皮膚，由于熊果素的結(jié)構(gòu)比對苯二酚多帶了葡萄糖分子，因此刺激性較低，而得以在保養(yǎng)品中出現(xiàn)，但是因為它還是必須還原成對苯二酚才能作用，因而引起部份人士懷疑，認為仍有機會產(chǎn)生類似對苯二酚的副作用，但至目前為止衛(wèi)生署仍將熊果素公告為核可的美白成分， 且規(guī)定熊果素在保養(yǎng)品中的濃度必須在7%以下，避免高濃度的熊果素使皮膚免疫力下降。
曲酸是從曲菌萃取出的成分，在黑色素形成過程中，銅離子扮演催化角色，而曲酸可以抓住銅離子，抑制黑色素形成，使色素生成細胞代謝正常，抑制黑斑或雀斑，達到美白功效。Dr. Noh在2007年(參考文獻Biopolymers 88，p300_7，2007)指出在曲酸-三肽的羧酸端加上氨基，將有助于提高其抗酸堿能力、耐熱性、存放的穩(wěn)定度以及酪氨酸酶的抑制效果。然而近期日本厚生省懷疑曲酸作為食品添加物有致癌危險，目前已停止使用于食品之中，化妝品類則要求進行臨床測試，以評估曲酸是否禁用。自日本政府公告禁用曲酸食品添加物后，含曲酸的保養(yǎng)品是否安全，各家說法紛紜，直至目前為止并無明確數(shù)據(jù)與研究證實其有危害，臺灣衛(wèi)生署目前仍將曲酸公告為核可的美白成分，并規(guī)定曲酸在保養(yǎng)品中的濃度必須在2%以下。
雖然目前衛(wèi)生署公布核準使用于美白化妝品的成分有八種，但部分種類仍有安全性的疑慮，對美白我們必須抱持正確期待，不應(yīng)有立即見效的想法，為擁有健康且白皙的肌膚，如何做好有效且安全的美白，是目前美白化妝品領(lǐng)域中重要的課題。
為解決目前美白化妝品領(lǐng)域所遇到的問題，美國專利申請案20090099093A1提供一種酪氨酸酶抑制劑，該抑制劑由一多肽組成，該多肽序列包含6至8個氨基酸，相較于現(xiàn)有技術(shù)所使用化合物作為酪氨酸酶抑制劑，該案所使用的多肽更具安全性，效果溫和而易于人體吸收和代謝，然而多肽合成的費用是廠商進行酪氨酸酶抑制劑商品化的一大考慮，多肽合成長度越長費用越高，此外多肽的運送方式亦為考慮重點，2008年Dr. Agarwal S (參考文獻ht J Pharm 359，7_14，2008)提出以適當(dāng)?shù)尼t(yī)藥組合物運送，可提高肽類前驅(qū)物(peptide prodrug)的水溶性、滲透力等，避免肽類前驅(qū)物在過程中受到蛋白酶的分解， 進而維持藥物的濃度。因此，研發(fā)一種既有效、安全且多肽長度更短的酪氨酸酶抑制劑，將是目前急欲解決的問題。發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述發(fā)明背景，研發(fā)一種既有效、安全且多肽長度更短的天然酪氨酸酶抑制劑，是當(dāng)前急欲解決的問題。本發(fā)明依據(jù)酪氨酸酶的結(jié)構(gòu)特性，設(shè)計一系列的酪氨酸酶抑制劑，經(jīng)由體外酪氨酸酶活性實驗測試、安全性測試結(jié)果以及活體動物實驗的黑色素含量分析，證實本發(fā)明所提出的酪氨酸酶抑制劑具有顯著的抑制效果。并且該酪氨酸酶抑制劑較現(xiàn)有技術(shù)所提出的肽序列更為有效、安全且長度更短。
本發(fā)明所引用的氨基酸序列名稱定義對照表
權(quán)利要求
1.一種酪氨酸酶抑制劑，其特征是包括如下多肽序列Rlnl-Xaa-R2n2-Yaa-R3n3其中Xaa或Yaa為酪氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酸或精氨酸中的一種，取代基R1、R2 或R3選自甘氨酸、脂肪性氨基酸、芳香性氨基酸、酸性氨基酸、堿性氨基酸、羥基氨基酸、含硫氨基酸或酰胺氨基酸中的一種或多種，且其中nl、n2或n3為取代基的數(shù)目，nl、n2、n3分別為0或1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酪氨酸酶抑制劑，其特征是所述多肽序列為Rlnl-Tyr-R2n2-Cys-R3n3或Rlnl-Cys-R2n2-Tyr-R3n3,其中取代基Rl、R2或R3選自甘氨酸、脂肪性氨基酸、芳香性氨基酸、酸性氨基酸、堿性氨基酸、羥基氨基酸、含硫氨基酸或酰胺氨基酸中的一種或多種，且其中nl、n2或n3為取代基的數(shù)目，nl、n2、n3分別為0或1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酪氨酸酶抑制劑，其特征是所述多肽序列為Rlnl-Cys-R2n2-Gly-R3n3或Rlnl-Gly-R2n2-Cys-R3n3,其中取代基Rl、R2或R3選自甘氨酸、脂肪性氨基酸、芳香性氨基酸、酸性氨基酸、堿性氨基酸、羥基氨基酸、含硫氨基酸或酰胺氨基酸中的一種或多種，且其中nl、n2或n3為取代基的數(shù)目，nl、n2、n3分別為0或1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酪氨酸酶抑制劑，其特征是所述多肽序列為Rlnl-Glu-R2n2-Cys-R3n3或Rlnl-Cys-R2n2-Glu-R3n3,其中取代基Rl、R2或R3選自甘氨酸、脂肪性氨基酸、芳香性氨基酸、酸性氨基酸、堿性氨基酸、羥基氨基酸、含硫氨基酸或酰胺氨基酸中的一種或多種，且其中nl、n2或n3為取代基的數(shù)目，nl、n2、n3分別為0或1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酪氨酸酶抑制劑，其特征是所述多肽序列為Rlnl-Arg-R2n2-Tyr-R3n3或Rlnl-Tyr-R2n2-Arg-R3n3,其中取代基Rl、R2或R3選自甘氨酸、脂肪性氨基酸、芳香性氨基酸、酸性氨基酸、堿性氨基酸、羥基氨基酸、含硫氨基酸或酰胺氨基酸中的一種或多種，且其中nl、n2或n3為取代基的數(shù)目，nl、n2、n3分別為0或1。
6.一種酪氨酸酶抑制劑，其特征是含有多肽序列選自Tyr-Cys-Cys、Glu-Cys-Val、 Cys—Arg、Cys-Asp-TyrΛ Arg—Tyr—Cys—Arg、Asp—Cys—Gly、Arg—Cys—Tyr—Arg、Cys-Gly-SerΛ Asn-Cys-Tyrλ Phe-Tyr-CysΛ Arg-Cys-Tyr-Val Λ Val—Cys—Gly、Cys-Gly-TyrΛ Tyr-Phe-CysΛ Cys—Val、Arg-Phe-Tyr-CysΛ Gly-Cys-TyrΛ Phe—Tyr—Cys—Arg、Cys—Tyr—Gly、Arg-Cys-TyrΛ Val-Ser-His-Tyr^ Tyr-Phe-Arg 或 Tyr-Asp 的一種或多種。
7.一種酪氨酸酶抑制劑，其特征是含有多肽序列選自Arg-Cys-Tyr、 Val-Ser-His-Tyr> Gly-Cys-Tyr> Tyr-Phe-Arg 或 Tyr-Asp 中的一種或多種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的酪氨酸酶抑制劑，其特征是所述多肽序列中的一個或多個氨基酸經(jīng)過乙酰化、酰胺化、甲酰化、羥基化、脂質(zhì)修飾、甲基化或磷酸化修飾。
9.一種抑制酪氨酸酶活性的醫(yī)藥組合物，其特征是含有如權(quán)利要求1-7任一所述酪氨酸酶抑制劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的醫(yī)藥組合物，其特征是還包括一種醫(yī)藥學(xué)上可接受載體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的醫(yī)藥組合物，其特征是所述載體為賦形劑、稀釋劑、增稠齊U、填充齊 、結(jié)合劑、崩解劑、潤滑劑、油脂或非油脂的基齊 、界面活性齊 、懸浮齊 、膠凝齊 、輔助劑、防腐劑、抗氧化劑、穩(wěn)定劑、著色劑或香料。
12.—種如權(quán)利要求9所述的醫(yī)藥組合物的應(yīng)用，其特征是應(yīng)用于化妝品、農(nóng)產(chǎn)品或美白劑。
13.一種減少哺乳動物皮膚中黑色素含量的方法，其特征是包括將權(quán)利要求1-7任一所述的酪氨酸酶抑制劑傳輸至哺乳動物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征是所述酪氨酸酶抑制劑為通過口服、經(jīng)皮吸收、注射或吸入的方式進行傳輸。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征是所述的酪氨酸酶抑制劑還包含一種醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征是所述的哺乳動物為人類。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種酪氨酸酶抑制劑，該抑制劑系由多肽組成。該多肽中一個或多個氨基酸進一步經(jīng)過乙?；?、酰胺化、甲?；?、羥基化、脂質(zhì)修飾、甲基化或磷酸化修飾。本發(fā)明的酪氨酸酶抑制劑可做為醫(yī)藥組合物，其包含上述多肽，更包含一種醫(yī)藥可接受載劑。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物，其通過酪氨酸酶活性抑制進而抑制黑色素的生成，并可應(yīng)用于化妝品，例如作為美白劑。
文檔編號A01N43/50GK102492018SQ201010237729
公開日2012年6月13日 申請日期2010年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月27日
發(fā)明者蕭乃文, 蔡耿彰 申請人:蕭乃文