專利名稱：一種復(fù)合微生態(tài)制劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種復(fù)合微生態(tài)制劑，具體地說是涉及包含多種益生菌的復(fù)合微生態(tài) 制劑及其應(yīng)用，屬于微生態(tài)制劑技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前，對動物疾病的預(yù)防和治療藥物基本仍采用抗生素，但由于長期、大量使用抗 生素，耐藥性、菌群失調(diào)、免疫力下降、疾病復(fù)發(fā)率高、藥物殘留等種種弊端日益嚴(yán)重，同時 也嚴(yán)重危害動物機(jī)體及人類健康。當(dāng)前，世界各國對抗生素各自采取了禁用或限制使用的 措施，如歐盟從2006年全面禁止使用抗生素；世界衛(wèi)生組織(WTO)提出了“在食用動物中 減少抗生素使用的全球原則”；我國已啟動“飼料安全工程”，并禁用了一批毒性和殘留較大 的藥物。在此形式下，改變養(yǎng)殖觀念、預(yù)防重于治療，并開發(fā)應(yīng)用無毒、無藥殘的新型綠色飼 料添加劑是必然趨勢。微生態(tài)制劑是目前常用和研究較多的一種綠色、安全的飼料添加劑，此類制劑是 由動物有益菌經(jīng)工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)得到的，包含有很多有益微生物及其代謝產(chǎn)物構(gòu)成的活菌 制劑，可以直接飼喂動物。微生態(tài)制劑通過維持腸道內(nèi)微生態(tài)的平衡而發(fā)揮作用，具有防 病、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、促進(jìn)生長、增加體重等多種功能，且無污染，無殘留，不產(chǎn)生抗藥性，是 一種綠色、安全的飼料添加劑。目前，市場上的微生態(tài)制劑存在以下幾個方面的主要質(zhì)量問題(1)活菌含量低， 而研究表明，如果一種菌在盲腸內(nèi)容物中的濃度低少107個/g，則該菌產(chǎn)生的酶及代謝產(chǎn) 物不足以影響宿主，難以滿足治療需要；(2)水分含量偏高，這是影響微生態(tài)制劑質(zhì)量的重 要因素之一；(3)不耐抗生素；(4)對胃酸和膽鹽不穩(wěn)定，致使只有少數(shù)菌株進(jìn)入腸道后仍 具有活性，達(dá)不到發(fā)揮作用所需的活菌數(shù)量。由于微生態(tài)制劑存在的這些質(zhì)量問題，從而影 響了其在動物上的應(yīng)用效果，限制了微生態(tài)制劑的廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種活菌含量高、水分含量低、包含具有耐胃酸、耐膽鹽、 耐高溫及耐受常用抗生素等抗逆性能和產(chǎn)酸、產(chǎn)酶及抑制病原菌等益生功能的多種益生菌 的微生態(tài)制劑。本發(fā)明的另一目的在于提供該微生態(tài)制劑的用途。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供一種復(fù)合微生態(tài)制劑，該制劑包含地衣芽孢桿菌 (Bacilluslicheniformis)CGMCC No. 2383菌粉、枯草芽孢桿菌菌粉、糞腸球菌 (Enterococcus faecium) CGMCC No. 2386 菌粉、嗜酸乳桿菌菌粉、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC No. 2388菌粉中的任三種或四種。其中，所述的地衣芽孢桿菌、糞腸球菌、釀酒酵母具有良好的耐胃酸、耐膽鹽、耐高 溫、耐受常用抗生素等抗逆性能和產(chǎn)酸、產(chǎn)酶、抑制病原菌等益生功能，為申請人從健康動物腸道或糞便中分離、選育得到，經(jīng)中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心鑒定，并于2008年3 月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏(簡稱CGMCC)，保藏號 分別為CGMCC No. 2383、CGMCC No. 2386、CGMCC No. 2388。嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌可以按常規(guī)方法分離得到，也可從市場上購買得到，本 發(fā)明為從市場上購買得到。本發(fā)明的復(fù)合微生態(tài)制劑包含嗜酸乳桿菌菌粉、糞腸球菌菌粉、地衣芽孢桿菌菌 粉、釀酒酵母菌粉，上述各成分的重量配比為1 0.8 1.2 0.8 2. 5 1. 5 2. 5。本發(fā)明的復(fù)合微生態(tài)制劑包含地衣芽孢桿菌菌粉、枯草芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母 菌粉，上述各成分的重量配比為1 3. 5 0.8 3. 5 0.8 3. 5。本發(fā)明的復(fù)合微生態(tài)制劑包含糞腸球菌菌粉、地衣芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌粉， 上述各成分的重量配比為1 0.8 1.2 1.5 2. 5。本發(fā)明的復(fù)合微生態(tài)制劑包含嗜酸乳桿菌菌粉、地衣芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌 粉，上述各成分的重量配比為1 1.5 2 2. 5 2 2. 5。本發(fā)明的復(fù)合微生態(tài)制劑還可進(jìn)一步包含載體，載體為石粉、葡萄糖、硫酸鉀鋁、 玉米芯粉中的任一種或兩種。本發(fā)明的另一目的在于提供該復(fù)合微生態(tài)制劑在畜禽飼料添加劑中的應(yīng)用。該復(fù) 合微生態(tài)制劑可以根據(jù)畜禽及其所處生長階段不同確定包含的益生菌種類、載體種類及其 比例，以更有針對性的制成各畜禽通用型或?qū)Ｓ眯偷奈⑸鷳B(tài)制劑，從而更好的發(fā)揮微生態(tài) 制劑的功能，如本發(fā)明的復(fù)合微生態(tài)制劑包含嗜酸乳桿菌菌粉、糞腸球菌菌粉、地衣芽孢 桿菌菌粉、釀酒酵母菌粉，載體為石粉，上述各成分的重量配比為1 0.8 1.2 1.5 2.5 1.5 2. 5 3. 5 4. 5，即可制成豬通用型復(fù)合微生態(tài)制劑，總有益菌數(shù)達(dá)2 5X109cfu/g ；復(fù)合微生態(tài)制劑包含嗜酸乳桿菌菌粉、糞腸球菌菌粉、地衣芽孢桿菌菌粉、 釀酒酵母菌粉和葡萄糖，上述各成分的重量配比為1 0.8 1.2 0.8 1.2 1.5 2.5 15 20，即制成仔豬專用型復(fù)合微生態(tài)制劑，總有益菌含量5 9X108cfu/g;復(fù)合 微生態(tài)制劑包含地衣芽孢桿菌菌粉、枯草芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌粉、硫酸鉀鋁和石粉， 上述各成分的重量配比為1 0.8 1.2 0.8 1.2 4. 5 5. 5 1. 5 2. 5，即制成 母豬專用型復(fù)合微生態(tài)制劑，總有益菌含量2 5X 109cfu/g ；復(fù)合微生態(tài)制劑包含枯草 芽孢桿菌菌粉、地衣芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌僂和玉米芯粉，上述各成分的重量配比為 3 3. 5 3 3. 5 2. 5 3. 5 0. 5 1. 5，即制成飼料廠豬產(chǎn)品專用型復(fù)合微生態(tài)制 劑，益生菌總菌含量可達(dá)2 5X101(lCfU/g ；復(fù)合微生態(tài)制劑包含糞腸球菌菌粉、地衣芽 孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌粉和葡萄糖，上述各成分的重量配比為1 0.8 1.2 1.5 2.5 15 20，即制成雛禽專用型復(fù)合微生態(tài)制劑，總有益菌含量5 9X108cfu/g;復(fù)合 微生態(tài)制劑包含嗜酸乳桿菌菌粉、地衣芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌粉和石粉，上述各成分 的重量配比為1 1.5 2 2. 5 2 2. 5 5 5. 5，即制成肉禽專用型復(fù)合微生態(tài) 制劑，總有益菌數(shù)達(dá)2X 109cfu/g ；復(fù)合微生態(tài)制劑包含地衣芽孢桿菌菌粉、枯草芽胞桿菌 菌粉、釀酒酵母菌粉和石粉，上述各成分的重量配比為1 1 1.2 1 1.2 7 8， 即制成蛋禽專用型復(fù)合微生態(tài)制劑，總有益菌數(shù)達(dá)2 5X 109cfu/g ；復(fù)合微生態(tài)制劑包含 枯草芽孢桿菌菌粉、地衣芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌粉和玉米芯粉，上述各成分的重量配比 為3 3 3. 5 3 3. 5 0. 5 1. 5，即制成飼料廠雞產(chǎn)品專用型復(fù)合微生態(tài)制劑，益生菌總菌含量可達(dá)2 5X 101Qcfu/g。本發(fā)明中所選育的地衣芽孢桿菌、糞腸球菌、釀酒酵母與枯草芽孢桿菌和嗜酸乳 桿菌在制備中采用液體深層高密度發(fā)酵技術(shù)和噴干或者凍干一系列的后處理加工工藝技 術(shù)制成菌粉，制劑中的活菌含量高、水分含量低，具有耐胃酸、耐膽鹽、耐高溫及耐受常用抗 生素等抗逆性能和產(chǎn)酸、產(chǎn)酶及抑制病原菌等益生功能。本發(fā)明的復(fù)合微生態(tài)制劑能提高飼料利用效率，增加肉蛋奶等產(chǎn)量，促進(jìn)動物生 長，提高免疫力和抗病力，替代抗生素，從而改善動物產(chǎn)品品質(zhì)。本發(fā)明的地衣芽孢桿菌(Bacillus 1 icheniformis)CGMCC No. 2383、糞腸球菌 (Enterococcus faecium) CGMCC No. 2386 菌粉、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) CGMCC No. 2388菌種的分離、選育及其菌粉的制備過程如下1、增菌培養(yǎng)將健康動物(豬或者家禽)的新鮮糞便或腸道內(nèi)容物樣品接種于增 殖液體培養(yǎng)基中，在30 37°C恒溫培養(yǎng)增殖；2、分離純化對步驟1增菌培養(yǎng)物在增殖培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，從中挑取 各個具有特征形態(tài)的菌落再劃線培養(yǎng)和分離，直至為純菌落為止，革蘭氏染色鏡檢，將分離 的疑似純菌落接種試管斜面中增殖，然后將斜面菌種保藏于4°C冰箱中，待用；其中所述增殖培養(yǎng)基為BPY培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、98號培養(yǎng)基中的一種；3、抗逆性強(qiáng)的優(yōu)良菌種的選育對步驟2所分離、純化的菌株進(jìn)行抗逆性篩選，可 以對所分離、純化的菌種直接進(jìn)行抗逆性能測定，從中篩選出抗逆性強(qiáng)的天然優(yōu)良菌種；或 通過梯度培養(yǎng)逐漸增加溶液的酸性(至PH為1.5左右)及膽汁鹽濃度，選出具有耐酸及耐 膽汁特性的菌株；或通過傳統(tǒng)的物理、化學(xué)誘變方法、現(xiàn)代基因工程技術(shù)，定向選育出抗逆 性強(qiáng)的菌種；再做菌種鑒定及生物學(xué)性能測定1)耐酸性測定將斜面菌種接種到種子培養(yǎng)基中活化，30 37°C靜置培養(yǎng)8 20h，按5 10%接種量分別接種于pH值2. 0,3. 0,4. O的人工模擬胃液中，Oh計(jì)數(shù)作對照， 2h、6h取樣用磷酸緩沖液按10倍系列稀釋，進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率；其中所述種子培養(yǎng)基為BPY培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、98號培養(yǎng)基中的一種；2)耐膽鹽測定將斜面菌種接種于培養(yǎng)基中，30 37°C靜置培養(yǎng)8_24h活化，按 5 10%接種量分別接種于0. 03%,0. 1%,0. 2%,0. 3%不同濃度的豬膽鹽溶液中，Oh計(jì)數(shù) 作對照，2h、6h取樣用生理鹽水按10倍系列稀釋計(jì)數(shù)，進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率；3)耐高溫測定將斜面菌種接種于種子培養(yǎng)基中，30 37°C培養(yǎng)16_24h活化，分 別于50°C 80°C水浴處理15 30min，處理前的做對照，計(jì)算存活率；4)耐藥性測定采用藥敏性紙片法；5)產(chǎn)酶測定采用中華人民共和國輕工業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，工業(yè)用α-淀粉酶制劑(QB/ Τ1805. 1-1993)，工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法(QB/T1803-1993)對地衣芽孢桿菌進(jìn)行淀粉酶 活力測定；采用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)工業(yè)用蛋白酶制劑(QB/T1805. 3-1993)，對地衣芽孢桿菌進(jìn)行蛋 白酶活力測定；6)產(chǎn)酸測定采用離子色譜法對糞腸球菌CGMCC No. 2386進(jìn)行有機(jī)酸產(chǎn)量測定；7)抑菌試驗(yàn)采用牛津杯法(又稱管碟法)對常見致病菌進(jìn)行抑菌測定；本發(fā)明所選育的地衣芽孢桿菌CGMCC No. 2383在人工模擬胃液(pH2. 0 4. 0)中 處理6h，存活率在49. 5%以上；在豬膽鹽溶液(濃度0. 3-3g/kg)處理6h，存活率為100%;
550 80°C處理15 30min，存活率為100% ；對青霉素G、阿莫西林、大觀霉素、紅霉素、吉 他霉素、桿菌肽鋅、林可霉素7種抗生素有耐藥性；對大腸桿菌K88、金黃色葡萄球菌、雞白 痢沙門氏菌三種致病菌均有較好的抑制作用，抑菌圈直徑在12 20mm;產(chǎn)蛋白酶活力為 1000u/ml ；產(chǎn)淀粉酶活力為800u/ml。本發(fā)明所選育的糞腸球菌CGMCC No. 2386在人工模擬胃液(pH2. O 4. 0)中處 理6h，存活率在18.0%以上；在豬膽鹽溶液(濃度0. 3-3g/kg)處理6h，存活率為12.6% 以上；50 80°C處理15 30min，存活率為0. 43%；對青霉素G、頭孢噻肟、慶大霉素、大觀 霉素、新霉素、紅霉素、吉他霉素、桿菌肽鋅、林可霉素、諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、復(fù)方 磺胺甲基異惡唑13種抗生素有耐藥性；對大腸桿菌K88、金黃色葡萄球菌、雞白痢沙門氏菌 三種致病菌均有很好的抑制作用，抑菌圈直徑在16 21mm ；乳酸、乙酸、異丁酸總酸產(chǎn)量為 4. 2g/L，乳酸產(chǎn)率達(dá)到89.4%。本發(fā)明所選育的釀酒酵母CGMCC No. 2388在人工模擬胃液(pH2. O 4. 0)中處理 6h，存活率在15. 4%以上；在豬膽鹽溶液(濃度0. 3-3g/kg)處理6h，存活率為11. 5%以上； 50 80°C處理15 30min，存活率為0. 19% ；4、菌粉的制備地衣芽孢桿菌CGMCC No. 2383菌粉的制備方法，包括如下的步驟1)平板培養(yǎng)復(fù)壯將地衣芽孢桿菌菌種接種于BPY平板培養(yǎng)基上，于30_37°C培 養(yǎng)12_24h，使地衣芽孢桿菌復(fù)壯，并形成單菌落，挑取單菌落于接種于斜面培養(yǎng)基上，于 30-37 °C 培養(yǎng) 24-36h ；2) 一級種子的制備將步驟1)培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌菌種轉(zhuǎn)接茄子瓶BPY斜面培 養(yǎng)基上，于30 37°C培養(yǎng)12 16h，使其處于對數(shù)中后期，得一級種子；3) 二級種子的制備將步驟2)制備的一級種子用無菌水制成菌懸液，接種到裝有 1-1. 6M3 BPY種子培養(yǎng)基的2M3種子罐中，溫度30 37°C，轉(zhuǎn)速200 250rpm，罐壓0. 05Mpa, 通風(fēng)比1 0.6 0.8 (14. 4 19. 2M3/h)，培養(yǎng)10 14h，為二級種子液;4)地衣芽孢桿菌發(fā)酵液的制備將步驟3)制備的二級種子液按照3 10%的接 種量接種到裝有12 16M3發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，溫度30 37°C，轉(zhuǎn)速220 300rpm， 罐壓0. 05Mpa，通風(fēng)比1 0.6 0.8，培養(yǎng)16 20h，至芽孢形成率90%以上，活菌數(shù)為 1 2Χ101(ι(^ιι/πι1，則中止發(fā)酵，得地衣芽孢桿菌發(fā)酵液；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為麩皮1 2%，豆粕1 2%，氯化鈉0. 2 0. 8%，硫酸鎂 0. 01 0. 05% ；5)地衣芽孢桿菌菌粉的制備在步驟4)制備的發(fā)酵液中加入20 25%的填充 物，混勻，進(jìn)行噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)溫度120 130°C，排風(fēng)溫度40 50°C，霧化器轉(zhuǎn)速15000 ISOOOrpm,得到水分含量< 5%的地衣芽孢桿菌菌粉。所述的填充物為米糠、沸石粉、稻殼粉中的任一種。B、糞腸球菌CGMCC No. 2386菌粉的制備方法，包括如下的步驟1)平板培養(yǎng)復(fù)壯將糞腸球菌菌種接種于MRS平板培養(yǎng)基上，于32 37°C培養(yǎng) 12 24h，使糞腸球菌菌復(fù)壯，并形成單菌落；挑取單菌落接種于斜面培養(yǎng)基上，于32 37°C 培養(yǎng) 24 36h ；2) 一級種子的制備將步驟1)培養(yǎng)的糞腸球菌斜面菌種轉(zhuǎn)接到裝有250ml 300ml MRS培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，于32 37°C培養(yǎng)12 16h，轉(zhuǎn)速100 150rpm，使 其處于對數(shù)中后期，為一級種子；3) 二級種子的制備將步驟2)培養(yǎng)的乳酸桿菌一級種子轉(zhuǎn)接到裝有1. 2 1. 6L MRS培養(yǎng)基的2. OL三角瓶中，于32 37°C靜止培養(yǎng)12 16h，為二級種子液；4)發(fā)酵液的制備將步驟3)制備的二級種子液按照3 6%的接種量接種到裝有 12 16M3發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，溫度35 37°C，轉(zhuǎn)速120 160rpm，罐壓0. 05Mpa，培 養(yǎng)16 20h，至活菌數(shù)為2 5 X 109cfu/ml，中止發(fā)酵；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖1 2 %，大豆蛋白胨1 2 %，硫酸銨0. 5 1. 0 %， 氯化鈉0. 2 0. 8%，硫酸鎂0. 01 0. 05% ；5)糞腸球菌菌粉的制備將步驟4)制備的發(fā)酵液，3500 5000rpm離心，得到菌 泥，加入與菌泥的重量/體積百分比為15 20%的凍干保護(hù)劑，混勻，于-25°C -45°C冷 凍干燥，得到水分含量< 5%的糞腸球菌菌粉。所述的凍干保護(hù)劑為脫脂奶粉、甘油、蔗糖、麥芽糊精和谷氨酸鈉的混合物，按 照脫脂奶粉甘油蔗糖麥芽糊精谷氨酸鈉=2 0. 5 1. 0 0. 5 1. 0 0. 5 1. 5 0. 5 1. 0的比例混合而成。C、釀酒酵母CGMCC No. 2388菌粉的制備方法，包括如下的步驟1)平板培養(yǎng)復(fù)壯將冰箱保藏的釀酒酵母斜面菌種采用劃線接種的方法在98號 平板培養(yǎng)基上劃線接種，于28 32°C培養(yǎng)24 36h，使釀酒酵母復(fù)壯，并形成單菌落；挑取 單菌落于新鮮的98號斜面培養(yǎng)基上，于28 32°C培養(yǎng)24 36h，放置冰箱備用；2) 一級種子的制備將步驟1)培養(yǎng)好的釀酒酵母新鮮斜面菌種轉(zhuǎn)接到裝有 200 250ml 98號培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，于28 32°C培養(yǎng)12 16h，轉(zhuǎn)速100 150rpm，使其處于對數(shù)中后期，為一級種子；3) 二級種子的制備將步驟2)培養(yǎng)好的釀酒酵母種子液轉(zhuǎn)接到裝有1. 0 1. 2L 98號培養(yǎng)基的2. OL三角瓶中，于28 32°C靜止培養(yǎng)12 16h，為二級種子液；4)發(fā)酵液的制備將步驟3)制備的二級種子按照3 10%的接種量接種到裝有 15 16M3發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，溫度28 32°C，轉(zhuǎn)速150 200rpm，罐壓0. 05Mpa，培 養(yǎng)12 16h中止發(fā)酵，此時活菌數(shù)為1 3X109cfu/ml ；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為紅糖1 2%，大豆蛋白胨1 2%，酵母膏0. 2 0. 5%， 氯化鈉0.5 1.0%，硫酸鎂0.01 0. 05%，磷酸氫二鉀0.2 0.5% ；5)釀酒酵母菌粉的制備將步驟4)制備的發(fā)酵液，2000 3000rpm離心，得到菌 泥，加入與菌泥的重量/體積百分比為10 15%的凍干保護(hù)劑，混勻后于-25°c -45°c冷 凍干燥，得到水分含量< 5%的釀酒酵母菌粉；所述的凍干保護(hù)劑為脫脂奶粉、甘油、麥芽糊精按照2 0.5 1 1 2比例 混合而成。通過下列實(shí)施例將更具體的說明本發(fā)明，但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是為了說明本 發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、優(yōu)良菌種的的分離、篩選、選育及鑒定
1)增菌培養(yǎng)將健康動物(豬或者家禽)的新鮮糞便、腸道內(nèi)容物樣品接種于BPY 液體培養(yǎng)基中，在37°C恒溫培養(yǎng)增殖48h ；2)地衣芽孢桿菌的分離純化對步驟1)增菌培養(yǎng)物100°C水浴5min，然后在BPY 培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，從中挑取各個具有特征形態(tài)的菌落再劃線培養(yǎng)和分離，直至 為純菌落為止，革蘭氏染色鏡檢，將分離的疑似純菌落接種試管斜面中增殖，然后保存于 4°C冰箱中，待用；菌落形態(tài)菌落表面粗糙，不光澤，乳白色不透明，邊緣不整齊，直徑2_3mm，隨著 培養(yǎng)時間的延長，變?yōu)榧t褐色；鏡檢細(xì)胞為桿菌1. 6 3. 8 μ mXO. 6 1. 2 μ m，革蘭氏陽 性，芽孢中生，橢圓形，不膨大，初步確定為地衣芽孢桿菌；3)糞腸球菌的分離純化對步驟1)增菌培養(yǎng)基在MRS培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線培 養(yǎng)，從中挑取各個具有特征形態(tài)的菌落再劃線培養(yǎng)和分離，直至為純菌落為止，革蘭氏染色 鏡檢，將分離的疑似純菌落接種試管斜面中增殖，然后保存于4°C冰箱中，待用；菌落形態(tài)菌落圓整，表面光滑，呈乳白色，大小l_3mm ；細(xì)胞圓形或卵圓形，直徑 0. 5 1. Oum，大多數(shù)成短鏈或?qū)?，革蘭氏染色陽性；4)釀酒酵母的分離純化對步驟1)增菌培養(yǎng)基在98號培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線培 養(yǎng)，從中挑取各個具有特征形態(tài)的菌落再劃線培養(yǎng)和分離，直至為純菌落為止，革蘭氏染色 鏡檢，將分離的疑似純菌落接種試管斜面中增殖，然后保存于4°C冰箱中，待用；菌落形態(tài)菌落為軟而濕潤，乳酪色、有光澤、平坦或稍凸起、邊緣整齊；細(xì)胞為球 形或卵形，直徑5 10um，繁殖方式芽殖；對步驟3)或者4)所分離、純化的糞腸球菌或者釀酒酵母菌株進(jìn)行抗逆性篩選，可 以對所分離、純化的菌種直接進(jìn)行抗逆性能測定，從中篩選出抗逆性強(qiáng)的天然優(yōu)良菌種；或 通過梯度培養(yǎng)逐漸增加溶液的酸性(至PH為1.5左右)及膽汁鹽濃度，選出具有耐酸及耐 膽汁特性的菌株；或通過傳統(tǒng)的物理、化學(xué)誘變方法、現(xiàn)代基因工程技術(shù)，定向選育出抗逆 性強(qiáng)的菌種；并對其進(jìn)行菌種鑒定，最后對選育出的菌株進(jìn)行抗逆性性能測定。實(shí)施例2、3株優(yōu)良菌種的抗逆性和生物學(xué)性能測定3株菌種地衣芽孢桿菌CGMCC No. 2383、糞腸球菌CGMCC No.2386、釀酒酵母 CGMCC No. 2388的生物學(xué)性能和抗逆性能測定1)地衣芽孢桿菌CGMCC No. 2383培養(yǎng)物的制備將冰箱保藏的斜面菌種接種到 BPY種子培養(yǎng)基中活化，37°C、200rpm培養(yǎng)18h，得到芽孢率在95%以上的培養(yǎng)物；2)糞腸球菌CGMCC No. 2386培養(yǎng)物的制備將冰箱保藏的斜面菌種接種到MRS種 子培養(yǎng)基中活化，35°C、IOOrpm培養(yǎng)16h，即得；3)釀酒酵母CGMCC No. 2388培養(yǎng)物的制備將冰箱保藏的斜面菌種接種到98號 種子培養(yǎng)基中活化，30°C、150rpm培養(yǎng)16h，即得；4)耐酸性測定將上述制備的培養(yǎng)物按5%接種量分別接種于pH值2.0、3.0、4.0 的人工模擬胃液中，Oh計(jì)數(shù)作對照，2h、6h取樣用磷酸緩沖液按10倍系列稀釋，進(jìn)行平板活 菌計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率。本發(fā)明選育的3株菌種地衣芽孢桿菌CGMCC No. 2383、糞腸球菌CGMCC No. 2386、 釀酒酵母CGMCC No. 2388在胃酸中存活率結(jié)果見表1。人工模擬胃液的制備量取9. 5% 10. 5%濃鹽酸16. 4毫升，加蒸餾水至1000毫
8升，做基礎(chǔ)人工胃液，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)PH值2. 0、3. 0、4. 0，各取10mL(9mL)，分裝于試管 中，100°C下蒸汽滅菌15分鐘，在無菌條件下，每IOmL液體中加入0. IOOg胃蛋白酶。表13株菌種在人工模擬胃液中的存活率
權(quán)利要求
一種復(fù)合微生態(tài)制劑，其特征在于包含地衣芽孢桿菌CGMCC No.2383菌粉、枯草芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母CGMCC No.2388菌粉，上述各成分的重量配比為1～3.5∶0.8～3.5∶0.8～3.5。
2.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合微生態(tài)制劑，其特征在于進(jìn)一步包含載體，載體為石粉、葡 萄糖、硫酸鉀鋁、玉米芯粉中的任一種或兩種。
3.權(quán)利要求1 2任一項(xiàng)所述的復(fù)合微生態(tài)制劑在制備畜禽飼料添加劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種復(fù)合微生態(tài)制劑及其應(yīng)用，具體地說是涉及包含多種益生菌的復(fù)合微生態(tài)制劑及其應(yīng)用。該制劑包含地衣芽孢桿菌CGMCC No.2383菌粉、枯草芽孢桿菌菌粉、糞腸球菌CGMCC No.2386菌粉、嗜酸乳桿菌菌粉、釀酒酵母CGMCC No.2388菌粉中的任三種或四種，制劑活菌含量高，具有耐胃酸、耐膽鹽、耐高溫及耐受常用抗生素等抗逆性能和產(chǎn)酸、產(chǎn)酶及抑制病原菌等益生功能。該制劑可根據(jù)畜禽及其所處生長階段不同確定包含的益生菌種類、載體種類及其比例。本發(fā)明的復(fù)合微生態(tài)制劑能提高飼料利用效率，增加肉蛋奶等產(chǎn)量，促進(jìn)動物生長，提高免疫力和抗病力，替代抗生素，從而改善動物產(chǎn)品品質(zhì)。
文檔編號A23K1/00GK101978849SQ20101023261
公開日2011年2月23日 申請日期2008年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月14日
發(fā)明者劉宇, 姚琨, 孫占敏, 張玳華, 白玉卿, 莫云, 賈秋英, 趙軍, 趙雁青 申請人:北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司