專利名稱：一種香蕉吸芽莖尖接種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及香蕉外植體接種并獲得無菌材料的 方法，即香蕉吸芽莖尖接種的方法。
背景技術(shù)：
廣義的香蕉包括了香蕉(Banana)和大蕉(Plantain)兩大類，同屬于芭蕉科 (Musaceae)芭蕉屬(Musa)。香蕉栽培種(Musa sp.)屬于單性三倍體(AAA，AAB，ABB)，具 有高度不育性。香蕉是世界重要的水果，也是我國嶺南四大佳果之一。由于香蕉沒有種子，所以傳 統(tǒng)的繁殖方法是靠挖取吸芽種植，而吸芽種植會帶來許多問題，如容易造成病害傳播、種質(zhì) 退化、生產(chǎn)管理困難等等。在二十世紀(jì)八十年代初，我國就開始了香蕉組織培養(yǎng)技術(shù)研究， 優(yōu)質(zhì)試管苗得到了極大的推廣種植。到目前為止，香蕉主栽區(qū)基本全部都采用香蕉試管苗 種植，主要種植品種有巴西、威廉斯、廣東2號、廣粉1號、順德中巴大蕉、新北蕉等。香蕉組織培養(yǎng)外植體主要有吸芽莖尖、花序軸和雄花分生組織等。以花序軸和雄 花分生組織作為外植體的培養(yǎng)方法通過誘導(dǎo)愈傷組織途徑產(chǎn)生叢生芽，然后進(jìn)行增殖培 養(yǎng)。這兩種方法都經(jīng)過植物組織細(xì)胞“脫分化——再分化”的過程，在此過程中容易引起基 因變化而產(chǎn)生較高的變異率。因此通過誘導(dǎo)愈傷組織途徑產(chǎn)生叢生芽的方法不適宜用來繁 殖香蕉等經(jīng)濟(jì)作物種苗。而誘導(dǎo)吸芽莖尖直接產(chǎn)生不定叢芽的方法不經(jīng)過“脫分化——再 分化”過程，對基因不會產(chǎn)生太大影響，在較低濃度6-BA濃度(2 2. Omg/L)下，繼代次數(shù) 控制在12代以內(nèi)的條件下，生產(chǎn)出來的試管苗變異率較低。因此目前香蕉試管苗工廠化生 產(chǎn)基本上都是采用吸芽莖尖直接誘導(dǎo)不定叢芽的方法。在香蕉吸芽莖尖接種方法上，傳統(tǒng)的做法是先將選取的香蕉吸芽切成約5厘 米X3厘米X3厘米大小，然后在超凈工作臺上再小心地將莖尖切成1 2厘米大小，大約 用0. 1 %升汞溶液浸泡，進(jìn)行表面消毒15 20分鐘，再用無菌水沖洗3次，經(jīng)削去消毒過的 表面組織，最后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。該方法存在幾個缺點(diǎn)(1)不夠環(huán)保一般采用的外植體表面消毒劑為升汞，是一 種劇毒物質(zhì)，消毒完后的廢棄液會造成環(huán)境污染。同時，殘留有消毒劑會影響莖尖誘導(dǎo)培 養(yǎng)。(2)較繁瑣、耗時在進(jìn)行表面消毒前，需要將莖尖組織進(jìn)行嚴(yán)格的切割，要切得表面十 分光滑，切割過程中必須要經(jīng)常換消毒過的刀和鑷子，操作繁瑣，因此也十分的耗時。據(jù)觀 察，比較熟練的人員一天也只能接種50 60個香蕉吸芽。(3)不夠簡易，很難獲得較高的 接種成功率。該方法表面上看似乎很簡單，但實(shí)際操作起來很難熟練掌握。采用該方法接 種香蕉外植體，一般人員的接種成功率50 60%，甚至更低，熟練人員能獲得80 85%的 接種成功率已是非常不錯。

發(fā)明內(nèi)容
為克服上述技術(shù)缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種香蕉吸芽莖尖接種的方法，該方
3法簡便易行、高效、環(huán)保。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下方案挑取無菌的莖尖接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn) 行誘導(dǎo)培養(yǎng)，而所述無菌的莖尖是通過無菌剝離葉鞘操作而獲得的。具體來說，是用經(jīng)高溫 消毒的手術(shù)刀小心地將香蕉吸芽葉鞘沿著其與球莖交界線環(huán)割，力度把握應(yīng)該不使刀尖劃 破該層葉鞘而碰到里面相鄰一層的葉鞘，依次層層環(huán)剝，這樣操作就不會將外面葉鞘的雜 菌帶到里面的葉鞘；最后，把全部包住的葉鞘都剝離開，便可輕易挑取無菌的莖尖接種到誘 導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。以下對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，具體方法步驟如下
1)、香蕉吸芽預(yù)處理。將取回的香蕉吸芽用刀小心切去球莖和假莖外層，切去多少組織要視香蕉吸芽大 小而定，經(jīng)處理后的吸芽大小一般要求為球莖、假莖部分各長6 10厘米，底部直徑大約 2 3厘米的圓柱體；比較小的吸芽經(jīng)處理后為球莖、假莖部分各長2 3厘米，底部直徑 約1厘米的圓柱體。切去吸芽多余部分時要注意幾點(diǎn)①盡量避免將吸芽帶的泥土弄臟切成的圓柱 體。②切的時候應(yīng)該沿著葉鞘垂直向球莖從上往下切，不能向莖尖方向偏切，如果偏切太 深，切口太靠近莖尖，吸芽就不能用了。如果吸芽呈彎曲狀，要把吸芽平放，側(cè)向切去內(nèi)彎部 分球莖，然后用手小心撕去葉鞘。③需要檢測花葉心腐病的香蕉品種，切好的吸芽要做好分組。2)、吸芽莖尖無菌接種。首先用干布(或報紙)抹干切后吸芽球莖部分滲出的汁液，以防在接種操作時滑 手，如果切好的吸芽比較臟，可用75%的酒精擦拭干凈。第二，葉鞘環(huán)割。待接種刀具消毒徹底后，吸芽莖尖無菌接種就可開始。用左手握 住吸芽圓柱體球莖部分(如果吸芽較小，也可用左手拇指、食指和中指抓住)，露出部分球 莖，以手術(shù)刀刀尖從假莖最外層葉鞘包口處下刀，沿著葉鞘與球莖交界線逆時針環(huán)割，環(huán)割 時左手拇指及食指要配合地將吸芽圓柱體順時針轉(zhuǎn)動，讓刀尖劃一圈。環(huán)割時要注意用刀 力度，視葉鞘厚薄及時調(diào)整用力輕重，原則是刀尖既不接觸內(nèi)層葉鞘，又能剛好使環(huán)割后的 葉鞘容易剝離。而且越靠近莖尖葉鞘越薄，環(huán)割力度也要越輕。這需要稍加練習(xí)即可做到。第三，葉鞘剝離。剝離葉鞘時，右手拇指、食指和中指抓住假莖部分，從環(huán)割后的葉 鞘包口開始，順時針方向擰假莖，使整層葉鞘沿著切口擰離球莖后，用力將脫離球莖的葉鞘 拉開，露出里面一層葉鞘，然后依次剝離下一層葉鞘。這一步操作中需要注意①當(dāng)右手?jǐn)Q假莖時不能用力過猛，以防將整個假莖部分 擰斷。②應(yīng)該先將葉鞘外面邊緣擰開一個口子，然后順著這個口子擰，直到將整層葉鞘擰離 球莖。③如果環(huán)割時有些地方劃得太淺，葉鞘就不容易擰離球莖。④如果不小心將全部假 莖擰斷了，操作就會變得復(fù)雜繁瑣。這是需要在環(huán)割后，換大號手術(shù)刀(如23號刀)小心 挑開葉鞘，挑葉鞘時刀尖不能觸及里面葉鞘，更不能碰到外面球莖，如果到外面球莖，必須 更換消毒過的手術(shù)刀接著操作。⑤需要剝離葉鞘層數(shù)的多少，要根據(jù)吸芽大小及預(yù)處理時 切除葉鞘多少而定。如果切除的葉鞘越多，切得越靠近莖尖，則需要剝離的葉鞘層數(shù)可相對 少些，一般需要剝離大約3 5層葉鞘即可。⑥每剝離一層葉鞘后，重新?lián)Q消毒過的刀。第四，吸芽莖尖挑取和接種。經(jīng)過剝離層層葉鞘后，剩下直徑大約0. 4 0. 8厘米的莖尖(視吸芽大小而定)。用消毒好的手術(shù)刀切去所述假莖，留0.3-0. 7cm長，然后以 刀尖在最后剝離葉鞘內(nèi)側(cè)、莖尖邊緣的地方，斜向逆時針插刀一圈，最后以刀尖將莖尖挑出 來，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加6-芐 氨基嘌呤(6-BA)至其終濃度為4 5mg/L，添加萘乙酸(NAA)至其終濃度為0. 05mg/L，添 加白糖至其終濃度為35g/L。這一步需要注意①插刀時不應(yīng)插太深，約插進(jìn)5毫米深即可。②插刀方向應(yīng)該和 圓柱體中軸線呈40 45°角，不能順著圓柱體中軸線插刀。③挑取莖尖時用力不能太大， 要把全部的球莖組織插離后，輕輕將莖尖挑出。如果用力太大，很容易將莖尖弄掉到臺面 上，結(jié)果前功盡棄。④挑出的莖尖必須帶有球莖組織，否則莖尖就會失去根基，不能成功培養(yǎng)。香蕉莖尖是由許多層葉鞘緊密包圍住，層層疊疊的葉鞘可把莖尖與外界完全隔離 開來，從而起到保護(hù)莖尖的作用。從最外層的葉鞘向內(nèi)層葉鞘，其受雜菌污染的程度越來越 低，莖尖及附近幾層葉鞘是不受雜菌污染的。采用本發(fā)明的方法能直接挑取出葉鞘內(nèi)的莖 尖，不需要經(jīng)過表面消毒就可獲得無菌莖尖了。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的方法主要有以下優(yōu)點(diǎn)(一)不使用消毒劑，不污染環(huán) 境。傳統(tǒng)接種方法采用的消毒劑是0. 的升汞溶液，具有劇毒，用后的廢棄液會對水源等 環(huán)境造成污染。而采用新的接種方法不采用任何消毒劑，不會對環(huán)境產(chǎn)生任何不良影響，而 且莖尖接種后不會因為消毒劑沒沖洗干凈而生長受到影響。(二)操作簡單，易學(xué)易用。該 方法不用準(zhǔn)備消毒器皿、無菌水和消毒劑等，不需要經(jīng)過繁瑣的切割過程，不用記消毒時間 等等在傳統(tǒng)接種方法時需要做的事情，在這里你只要把手術(shù)刀消毒好就可開始接種，且沿 著假莖與球莖交界處，層層環(huán)剝，十分容易。(三)快速高效。新接種方法操作起來十分簡 便快捷，一般熟練人員大約7 8刀就可接種一個吸芽，一天可接種香蕉吸芽100個左右。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這 些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下面舉例說明具體實(shí)施步驟1材料與用具1. 1材料預(yù)處理將選取回來的巴西蕉(香蕉品種)吸芽先切留假莖10 15厘米 長，然后從切口往球莖方向垂直下切，把外層葉鞘連球莖組織一起切除。最后切成假莖、球 莖部分各長6 10厘米，底部直徑為2 3厘米的圓柱體。1. 2用具3把11號手術(shù)刀和1把23號手術(shù)刀，1臺300°C電熱消毒器(也可用酒 精燈)。2操作步驟2. 1葉鞘環(huán)割左手抓住吸芽圓柱體，右手拿手術(shù)刀。以消毒過的手術(shù)刀刀尖從葉鞘 包口處開始下刀，沿著外層葉鞘與球莖交界線逆時針輕劃一圈至起刀的位置。2. 2葉鞘剝離右手抓住假莖部分，向順時針方向擰葉鞘，先擰起葉鞘外邊緣，然后 把整層葉鞘逐步擰離球莖。當(dāng)葉鞘完全與球莖脫離后，右手用力將脫離的葉鞘拉開，或者將 葉鞘一片一片地撕開。按上述方法依次剝離其他葉鞘(約3 5層)。
2. 3莖尖挑取用消毒過的手術(shù)刀切去假莖，僅留約0. 5cm長，然后以刀尖在最后剝 離的葉鞘內(nèi)側(cè)、莖尖邊緣的地方，與莖尖成45°夾角逆時針插刀一圈，輕輕地將帶有部分球 莖組織的莖尖挑離球莖。 2. 4莖尖接種將莖尖接種到添加有6-芐氨基嘌呤(6-BA) 4 5mg/L、萘乙酸 (NAA)O. 05mg/L、白糖35g/L的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基，接種深度以剛好插入球莖組織為宜。2. 5莖尖轉(zhuǎn)接培養(yǎng)20 25天后，將莖尖切口處形成的愈傷組織切去，然后將莖尖 切成4等份，接種在上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。3接種結(jié)果 莖尖接種10天后觀察，平均成功率在85%以上，莖尖開始膨大。再轉(zhuǎn)接1次培養(yǎng) 20天后開始誘導(dǎo)出叢生芽。
權(quán)利要求
一種香蕉吸芽莖尖接種的方法，所述方法為挑取無菌的莖尖接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，其特征在于，所述無菌的莖尖是通過無菌剝離葉鞘操作而獲得的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種香蕉吸芽莖尖接種的方法，其特征在于，所述無菌剝離 葉鞘操作是用經(jīng)高溫消毒的手術(shù)刀將香蕉吸芽葉鞘沿著其與球莖交界處層層環(huán)割，直至全 部包住的葉鞘都剝離開。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的香蕉吸芽莖尖接種的方法，其特征在于，所述無菌剝離葉鞘 操作包括如下步驟1)香蕉吸芽預(yù)處理用經(jīng)高溫消毒的手術(shù)刀切去香蕉吸芽的球莖和假莖外層，處理后 的吸芽為圓柱體；2)葉鞘環(huán)割；3)葉鞘剝離；4)吸芽莖尖挑??；以上操作都在超凈工作臺上進(jìn)行。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的香蕉吸芽莖尖接種的方法，其特征在于，所述步驟2操作如 下握住所述吸芽圓柱體球莖部分，露出所述葉鞘及所述球莖交界位置，以刀尖從葉鞘包口 處下刀，沿著所述葉鞘與所述球莖交界線逆時針環(huán)割。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的香蕉吸芽莖尖接種的方法，其特征在于，所述步驟3操作如 下抓住所述假莖部分，向順時針方向擰所述假莖，先擰起所述葉鞘外邊緣，然后把整層葉 鞘擰離球莖；當(dāng)所述葉鞘完全與所述球莖脫離后，用力將脫離的葉鞘拉開，或者將葉鞘一片 一片地撕開；按上述方法依次剝離其他葉鞘，每剝離一層葉鞘需要重新?lián)Q消毒過的手術(shù)刀。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的香蕉吸芽莖尖接種的方法，其特征在于，所述步驟4操作如 下用消毒過的手術(shù)刀切去所述假莖，留0. 3-0. 7cm長，然后以刀尖在最后剝離的葉鞘內(nèi) 側(cè)、莖尖邊緣的地方，逆時針插刀一圈，將帶有部分球莖組織的莖尖挑離球莖。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香蕉吸芽莖尖接種的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)包括 如下步驟1)莖尖接種；2)莖尖轉(zhuǎn)接；以上步驟都在都在超凈工作臺進(jìn)行。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的香蕉吸芽莖尖接種的方法，其特征在于，所述步驟1為將莖尖 接種到所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，接種深度以剛好插入球莖組織為宜；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS培養(yǎng) 基為基本培養(yǎng)基，添加6-芐氨基嘌呤(6-BA)4 5mg/L、萘乙酸(NAA)O. 05mg/L、白糖35g/ L0
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的香蕉吸芽莖尖接種的方法，其特征在于，所述步驟2為培養(yǎng) 20 25天后，將莖尖切口處形成的愈傷組織切去，然后將莖尖縱切成4等份，接種在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種香蕉吸芽莖尖接種的方法，該方法為將香蕉吸芽預(yù)處理，切成吸芽圓柱體后，用經(jīng)高溫消毒的手術(shù)刀將香蕉吸芽葉鞘沿著其與球莖交界處環(huán)割，依次層層環(huán)剝，直至把全部包住的葉鞘都剝離開，便可輕易挑取無菌的莖尖接種到添加有6-BA 4～5mg/L、NAA 0.05mg/L、白糖35g/L的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。本方法克服了傳統(tǒng)方法中需要使用消毒劑，材料預(yù)處理過程繁瑣、效率不高等缺陷，達(dá)到簡便易行、高效、環(huán)保的效果。
文檔編號A01H4/00GK101869076SQ20101021842
公開日2010年10月27日 申請日期2010年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月6日
發(fā)明者湯亞飛, 蘇海, 蔡時可, 謝梅新 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所