專利名稱：獼猴屬靈長類動物精液超低溫冷凍保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動物繁殖的方法，特別涉及靈長類動物精子保存方法。
技術(shù)背景 自從英國生物學(xué)家Polge等用甘油作為防凍劑冷凍保存精子以來，應(yīng)用冷凍精子 進(jìn)行體外受精和人工授精被廣泛應(yīng)用于人類不育不孕癥的治療和家畜動物的繁殖育種，也 為珍稀瀕危動物遺傳多樣性保護(hù)提供了一條途徑。獼猴屬靈長類動物，如獼猴、食蟹猴、熊 猴、藏酋猴等是人類的近親，在組織結(jié)構(gòu)，生理生化、免疫和代謝等方面與人類高度相似，是 建立病毒等傳染性疾病模型、精神神經(jīng)性疾病模型、心血管疾病模型、腫瘤模型和生殖生理 等研究的最佳實(shí)驗動物。隨著世界上第一只攜帶綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因獼猴和亨廷頓舞蹈 病轉(zhuǎn)基因獼猴的誕生，應(yīng)用靈長類動物模型研究和治療人類重大功能性疾病成為一個非常 熱門和重要的研究領(lǐng)域。獼猴屬各靈長類物種被列為國家一、二級保護(hù)珍稀瀕危動物，但一 方面，人類受到各種重大功能性疑難疾病不斷困擾，迫切需要大量獼猴動物用于自然科學(xué) 研究和解決人類健康問題，另一方面，隨著持續(xù)破壞所導(dǎo)致的環(huán)境惡化，野生靈長類動物野 外生存條件喪失使其繁殖能力下降。依據(jù)現(xiàn)代生殖生物理論，一個雄性動物的精子可以獲 得成千上萬個后代個體，因此，高效保存動物精子能顯著降低保養(yǎng)活體動物個體和種群的 高額負(fù)擔(dān)，縮短繁殖周期，提高生產(chǎn)效率。相對于人類和家畜動物，獼猴屬靈長類動物精子在冷凍過程中對溫度和冷凍條件 的變化非常脆弱和敏感，冷凍精子的運(yùn)動能力、精子質(zhì)膜和頂體的完整率急劇下降，精子存 活時間縮短、體外受精的受精率和人工授精的受孕率及產(chǎn)仔率低下。提高靈長類動物冷凍 保存精子的復(fù)蘇運(yùn)動度、質(zhì)膜和頂體的完整率、存活時間及受精能力的關(guān)鍵是防凍液的研 制和冷凍降溫程序的設(shè)計。甘油是動物精子冷凍保存最常用的滲透性防凍劑，甘油可滲入細(xì)胞，取代細(xì)胞內(nèi) 的水分子，引起細(xì)胞脫水，減少冷凍過程中胞內(nèi)冰晶的形成；甘油可與質(zhì)膜磷脂的親水基團(tuán) 形成靜電結(jié)合，起到膜穩(wěn)定劑的作用。甘油的濃度是影響精子冷凍的重要參數(shù)，濃度太低達(dá) 不到冷凍保護(hù)的目的，濃度過高會導(dǎo)致精子指標(biāo)下降，而且，不同物種的精子對甘油的耐受 能力不同，如袋鼠精子冷凍時甘油的濃度高達(dá)10-20%，豬精子甘油濃度超過3%會因頂體 受到的損傷而失去受精能力，牛精子通常使用4-8%的甘油，因而，不同物種必需選擇該物 種最適甘油濃度。糖類物質(zhì)是用于精子冷凍保存的非滲透性防凍劑，除了調(diào)節(jié)滲透壓，使細(xì)胞脫水， 減少胞內(nèi)冰晶的形成以及糖的羥基基團(tuán)與精子質(zhì)膜磷脂親水的磷酸基團(tuán)結(jié)合，穩(wěn)定精子質(zhì) 膜外，糖類通過降低溶液的冰點(diǎn)和取代膜周圍的水分子，抑制胞外結(jié)冰，縮短危險溫度區(qū)， 減少冰晶生長對細(xì)胞膜造成的損傷。此外，糖類還可影響冷凍過程中結(jié)冰的方式、冰晶的形 狀、冰晶之間未凍結(jié)溶液通道的寬度以及凍結(jié)溶液的機(jī)械屬性，因此，可以降低冷凍對精子 的損傷。而在冷凍復(fù)蘇過程中糖分子結(jié)合在質(zhì)膜周圍產(chǎn)生空間效應(yīng)，可阻止細(xì)胞皺縮引起 的質(zhì)膜變形、折疊所致的膜融合。同樣，糖類對不同物種的的冷凍保護(hù)作用存在差異，特別是冷凍保護(hù)獼猴精子的甘油和糖類最適當(dāng)配合濃度的防凍液還未有報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是針對現(xiàn)有技術(shù)方法的不足，提供一種可廣泛應(yīng)用于獼猴屬各靈長類物種的精液超低溫冷凍保存方法，包擴(kuò)甘油和糖類組合構(gòu)成的防凍液，以及應(yīng)用防凍液進(jìn) 行精液超低溫冷凍保存和復(fù)蘇的方法。本發(fā)明目的通過以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)取 0.2g Tris、1.2g TES、2g 乳糖、2g 葡萄糖、0. 2g 棉籽糖、10000IU 青霉素 G 鈉鹽、5mg硫酸鏈霉素依次溶于60mL Milli-Q超純水中，加入20mL雞蛋卵黃，混合均勻后加 水定容至IOOmL ；(2)將溶液以7000g離心1小時，收集上清液制成稀釋液；(3)取45mL稀釋液加入5mL的甘油制成防凍液，預(yù)冷至4°C ；(4)在室溫下，將精液與稀釋液按1 9的體積比在試管中混合、封口，以室溫水 浴，再放入4°C冰箱中緩慢降溫平衡2小時；(5)向試管中加入等體積的防凍液，混合均勻后分裝入麥管中于液氮中保存；混 合均勻后分裝入0. 25mL麥管中于液氮中保存；(6)復(fù)蘇時將冷凍麥管由液氮中迅速轉(zhuǎn)移至37°C的水浴中解凍2分鐘。所述方法步驟(4)的室溫為22_25°C。所述方法步驟(5)是將防凍液分五次加入試管，每次加入1/5體積，每次間隔5分 鐘，甘油的終濃度為5%。所述方法步驟(5)是把麥管置于液氮面上方5cm處冷凍10分鐘，降溫速率為 300C /min，再于液氮中保存。所述方法步驟(5)麥管容積為0. 25mL。Tris和TES分別為三羥甲基氨基甲烷和N-三(羥甲基)甲基_2_氨基乙烷磺酸 鈉的英文縮寫。本發(fā)明具有的積極效果是本發(fā)明選取的甘油濃度對于提高獼猴屬靈長類動物冷凍精子的復(fù)蘇運(yùn)動度、質(zhì)膜 和頂體的完整率、存活時間有顯著效果。本發(fā)明防凍液中的葡萄糖，可以一定程度的通過細(xì)胞膜進(jìn)入精子，并為ATP合成 能力低下的精子提供代謝能量。乳糖和棉籽糖分子結(jié)構(gòu)中C H比率低，而羥基基團(tuán)的數(shù) 量比單糖多，能夠更好的保護(hù)精子的細(xì)胞膜，顯著提高對獼猴精子的冷凍保護(hù)效果。在精液冷凍降溫過程中，稀釋精液后先于4°C降溫平衡2小時，分5次加入含有甘 油的防凍液并最終達(dá)到5%的甘油終濃度，這種模式可以有效地緩解由于甘油的加入導(dǎo)致 細(xì)胞體積因環(huán)境滲透壓升高引起的劇烈變化而受到的損傷，而且預(yù)冷的防凍液中甘油的毒 副作用在4°C也相對于室溫下減弱了很多，這種方法有利于精子的存活和細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能 的保持。此外，降溫模式、降溫速率和在液氮蒸氣中的冷凍時間也構(gòu)成了本發(fā)明防凍液使用 效果的顯著特征。本發(fā)明方法簡單，取材容易且成本價格低廉，不需要特殊設(shè)備，易于推廣。實(shí)驗結(jié)果表明，本發(fā)明的方法能夠有效地提高獼猴屬各種靈長類動物冷凍精子的復(fù)蘇運(yùn)動度，保護(hù)冷凍復(fù)蘇精子質(zhì)膜和頂體結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出了良好的精子冷凍保護(hù)作用和防 凍效果，進(jìn)而提高了凍精的受精率。以下通過實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，實(shí)施例內(nèi)容包括但不限制具體實(shí)施方式
的范圍。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 稱量0. 2g Tris、1.2g TES、2g 乳糖、2g 葡萄糖、0. 2g 棉籽糖、10000IU 青霉素、5mg 硫酸鏈霉素依次溶于60mLMilli-Q超純水中，再加入20mL雞蛋卵黃，混合均勻后加水定容 至IOOmL ；于7000g的速率離心1小時，收集上清液制成精液稀釋液；向精液稀釋液中加入 10% (體積比)的甘油制成精液冷凍保存的防凍液；在室溫條件下(22-25°C)，將獼猴精液 與稀釋液按1 9的體積比在4mL的試管中混合，然后將試管封口放入裝有200mL室溫水 的燒杯中，并將此燒杯放入4°C的冰箱中緩慢降溫平衡2小時；向試管中加入等體積的預(yù)冷 至4°C的含有甘油的防凍液，混合均勻，將稀釋精液分裝入0. 25mL冷凍麥管放入液氮保存。對冷凍保存的獼猴精液，分別用活體熒光染料碘化丙啶PI染色法和異硫氰熒光 素聯(lián)接的花生四烯酸FITC-PNA熒光染色法實(shí)驗測定冷凍精子復(fù)蘇后精子的復(fù)蘇運(yùn)動度、 存活時間、精子質(zhì)膜完整率，精子頂體的完整率，其結(jié)果表明冷凍復(fù)蘇精子的復(fù)蘇運(yùn)動度 為56%，于37°C培養(yǎng)12小時后精子運(yùn)動度仍可維持在30%以上，精子質(zhì)膜完整率為57%， 頂體完整率為82%。利用冷凍復(fù)蘇精子與獼猴卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精，受精率為82%，受 精卵在體外發(fā)育至囊胚的發(fā)育率為39%。生產(chǎn)的囊胚經(jīng)過胚胎移植后可以順利著床并產(chǎn)生 子代。實(shí)施例2 稱量0. 2g Tris、1.2g TES、2g 乳糖、2g 葡萄糖、0. 2g 棉籽糖、10000IU 青霉素、5mg 硫酸鏈霉素依次溶于60mLMilli-Q超純水中，再加入20mL雞蛋卵黃，混合均勻后加水定容 至100mL。于7000g的速率離心1小時后，收集上清液制成精液稀釋液。向精液稀釋液中 加入10% (體積比)的甘油制成精液冷凍保存的防凍液。在室溫條件下(22-25°C)，將熊 猴的精液與稀釋液按1 9的體積比在4mL的試管中混合。然后將試管封口后放入裝有 200mL室溫水的燒杯中，并將此燒杯放入4°C的冰箱中緩慢降溫平衡2小時。向試管中分五 次加入等體積的預(yù)冷至4°C的含有甘油的防凍液，每次加入1/5體積，每次間隔5分鐘，甘油 的終濃度為5 %，混合均勻后，分裝稀釋精液入0. 25mL冷凍麥管中，將麥管置于液氮面上方 5cm處以30°C /min冷凍10分鐘后，放入液氮中保存。對冷凍保存熊猴精液，用與實(shí)施例1相同的實(shí)驗測定冷凍精子復(fù)蘇后精子的復(fù)蘇 運(yùn)動度、存活時間、精子質(zhì)膜完整率，精子頂體的完整率，其結(jié)果表明冷凍復(fù)蘇精子的復(fù)蘇 運(yùn)動度可達(dá)61 %，于37°C培養(yǎng)12小時后精子運(yùn)動度仍維持在20%以上，精子質(zhì)膜完整率為 64%,頂體完整率為85%。利用冷凍復(fù)蘇精子進(jìn)行體外受精，受精率可達(dá)53%。實(shí)施例3 稱量0. 2g Tris、1.2g TES、2g 乳糖、2g 葡萄糖、0. 2g 棉籽糖、10000IU 青霉素、5mg 硫酸鏈霉素依次溶于60mLMilli-Q超純水中，再加入20mL雞蛋卵黃，混合均勻后加水定容 至IOOmL ；于7000g的速率離心1小時，收集上清液制成精液稀釋液。向精液稀釋液中加入10% (體積比)的甘油制成精液冷凍保存的防凍液；在室溫條件下(22-25°C)，將食蟹猴的 精液與稀釋液按1 9的體積比在4mL的試管中混合，然后將試管封口后放入裝有200mL 室溫水的燒杯中，并將此燒杯放入4°C的冰箱中緩慢降溫平衡2小時，向試管中分五次加入 等體積的預(yù)冷至4°C的含有甘油的防凍液，每次加入1/5體積，每次間隔5分鐘，甘油的終 濃度為5%，混合均勻后，將稀釋精液分裝入0. 25mL冷凍麥管中置于液氮面上方5cm處以300C/min冷凍10分鐘后，放入液氮中保存。 對冷凍保存食蟹猴的精液，用與實(shí)施例1相同的實(shí)驗測定冷凍精子復(fù)蘇后精子的 復(fù)蘇運(yùn)動度、存活時間、精子質(zhì)膜完整率，精子頂體的完整率，其結(jié)果表明，冷凍復(fù)蘇精子的 復(fù)蘇運(yùn)動度為50%，精子質(zhì)膜完整率為59%，頂體完整率為83%。
權(quán)利要求
獼猴屬靈長類動物精液超低溫冷凍保存方法，包括如下步驟(1)取0.2gTr i s、1.2g TES、2g乳糖、2g葡萄糖、0.2g棉籽糖、10000IU青霉素G鈉鹽、5mg硫酸鏈霉素依次溶于60mL Mil li-Q超純水中，加入20mL雞蛋卵黃，混合均勻后加水定容至100mL；(2)將溶液以7000g離心1小時，收集上清液制成稀釋液；(3)取45mL稀釋液加入5mL的甘油制成防凍液，預(yù)冷至4℃；(4)在室溫下，將精液與稀釋液按1∶9的體積比在試管中混合、封口，以室溫水浴，再放入4℃冰箱中緩慢降溫平衡2小時；(5)向試管中加入等體積的防凍液，混合均勻后分裝入麥管中于液氮中保存；混合均勻后分裝入0.25mL麥管中于液氮中保存；(6)復(fù)蘇時將冷凍麥管由液氮中迅速轉(zhuǎn)移至37℃的水浴中解凍2分鐘。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的冷凍保存方法，其特征是所述方法步驟⑷的室溫為 22-25 °C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的冷凍保存方法，其特征是所述方法步驟(5)是將防凍液分 五次加入試管，每次加入1/5體積，每次間隔5分鐘，甘油的終濃度為5%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的冷凍保存方法，其特征是所述方法步驟(5)是把麥管置于 液氮面上方5cm處冷凍10分鐘，降溫速率為30°C /min,再于液氮中保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的冷凍保存方法，其特征是所述方法步驟(5)是把麥管置于液 氮面上方5cm處冷凍10分鐘，降溫速率為30°C /min，再于液氮中保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的冷凍保存方法，其特征是所述方法步驟(5)麥管容積為 0.25mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的冷凍保存方法，其特征是所述方法步驟(5)麥管容積為 0.25mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的冷凍保存方法，其特征是所述方法步驟(5)麥管容積為 0.25mL。
全文摘要
獼猴屬靈長類動物精液超低溫冷凍保存方法，屬于動物繁殖方法。本發(fā)明將Tris、TES、乳糖、葡萄糖、棉籽糖、青霉素G鈉鹽、硫酸鏈霉素等溶于水，離心取上清液制成精液稀釋液，加甘油配成防凍液，再用稀釋液稀釋精液降溫至4℃，與等體積的預(yù)冷至4℃的防凍液混合，分裝冷凍麥管中并于液氮蒸汽降溫后放入-196℃液氮中保存。使用時，解凍復(fù)蘇精子。本發(fā)明可以提高獼猴屬靈長類動物冷凍精子復(fù)蘇運(yùn)動度、存活時間、質(zhì)膜和頂體完整率及受精率。
文檔編號A01N1/02GK101843238SQ20101019871
公開日2010年9月29日 申請日期2010年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月12日
發(fā)明者司維, 季維智, 牛昱宇, 王宏, 紀(jì)少琿 申請人:昆明亞靈生物科技有限公司