專利名稱：一種海灣扇貝雄性不育體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海灣扇貝，具體地說是用北方海灣扇貝(Argopectenirradians irradians)和秘魯扇貝(Argopecten purpuratus)進(jìn)行種間雜交獲得雄性不育體的制備方法，特別提供了一種雌雄同體型海灣扇貝雄性不育體的制備方法。
背景技術(shù)：
雄性不育體的制備一直是海灣扇貝生產(chǎn)性完全雜交制種的關(guān)鍵。北方海灣扇貝 (Argopecten irradians irradians)原產(chǎn)于美國大西洋沿岸，左右殼幾近相等，殼面放射肋16 21條，適溫2 34°C，適鹽25 34，以浮游植物和有機(jī)碎屑為食。在原產(chǎn)地的繁殖期為9 10月份。幼苗當(dāng)年秋季可達(dá)5cm以上，較大個體7cm。生物學(xué)最小型為2. 2cm， 當(dāng)年可達(dá)性成熟，翌年形成生殖高峰。壽命12 16個月，少數(shù)可達(dá)24個月。海灣扇貝為雌雄同體，生殖腺位于腹嵴，精巢位于腹嵴外周緣，卵巢位于精巢內(nèi)側(cè)。被覆在未成熟生殖腺外表的一層黑膜在成熟過程中逐漸消退，成熟的卵巢為橘紅色，精巢為乳白色。精子和卵子進(jìn)入腎腔后，由外腎殖孔排入外套腔內(nèi)，再靠水流作用排出體外，行體外受精。1982年中國科學(xué)院海洋研究所張福綏院士將海灣扇貝引種到我國，因其生長速度快、養(yǎng)殖效益高，在世界上首次形成了海灣扇貝養(yǎng)殖業(yè)，并成為我國海水養(yǎng)殖的支柱產(chǎn)業(yè)之一。近些年來，由于環(huán)境惡化及近交衰退等原因，養(yǎng)殖海灣扇貝病害頻發(fā)、貝體小型化、長勢低化，嚴(yán)重影響了產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。因此，抗性強(qiáng)、長勢好的海灣扇貝新品種已成為產(chǎn)業(yè)發(fā)展的迫切需求。實踐表明，雜交育種是提高養(yǎng)殖扇貝抗性等生產(chǎn)性能的有效途徑。目前海灣扇貝的雜交育種主要是通過群體混交和精控雜交。群體混交雖可擴(kuò)大雜交規(guī)模，適合在生產(chǎn)中應(yīng)用，但作為雌雄同體型動物，海灣扇貝的成熟精卵通過同一生殖孔道從體內(nèi)排出體外，而大多數(shù)情況下是精子先于卵子排出。因此在同一個容器內(nèi)卵子很容易遭到同一個體精子的“污染”，從而導(dǎo)致自體受精，使雜交效率低化，難以達(dá)到生產(chǎn)性要求。精控雜交雖可實現(xiàn)完全的定向雜交，但其操作繁瑣，無法進(jìn)行生產(chǎn)性應(yīng)用。海灣扇貝未受精的純凈卵子的獲得，要遠(yuǎn)難于純凈精子的獲得，特別是規(guī)?；a(chǎn)時其難度差異就更大了，甚至可以說是根本無法進(jìn)行嚴(yán)格意義上的生產(chǎn)性定向完全雜交。因此，海灣扇貝雌雄同體的生殖特性是實現(xiàn)其高效定向完全雜交技術(shù)應(yīng)用的主要障礙。為了保證雜交技術(shù)的有效應(yīng)用，海灣扇貝雄性不育體化技術(shù)，即創(chuàng)制只能產(chǎn)生卵子，不能產(chǎn)生精子的雄性不育體， 是實現(xiàn)海灣扇貝生產(chǎn)性高效雜交制種的技術(shù)關(guān)鍵。對于雌雄異體動物的育種不存在雄性不育性的技術(shù)需求。在軟體動物門、雙殼綱、 扇貝科的種類，其大多數(shù)種屬也都是雌雄異體生殖類型，僅在海灣扇貝屬，其大多數(shù)種類是完全雌雄同體生殖類型，而其多有較高的經(jīng)濟(jì)價值，幾個亞種或種亦已引種到中國養(yǎng)殖。為了獲得雄性不育體海灣扇貝，理論上可有多條途徑，如激素誘導(dǎo)法等，但因其技術(shù)難度高、效率低等原因尚無成功案例，而其還有環(huán)境和食品安全等原因更增加了實際操作的難度。近幾年，我們采用多種扇貝對海灣扇貝進(jìn)行雜交方法以期獲得雄性不育體，如海灣扇貝χ櫛孔扇貝(正反交)、海灣扇貝χ華貴櫛孔扇貝(正反交)、海灣扇貝χ蝦夷扇貝(正反交)等，這些組合的受精都存在明顯的困難，或在胚胎發(fā)育期因畸形而夭折， 其更難言及雄性不育體的獲得了。同時在Argopecten irradians種內(nèi)的亞種間雜交研究也在進(jìn)行。原產(chǎn)于美國弗吉尼亞及其毗鄰水域的北方海灣扇貝(Argopecten irradians irradians)是海灣扇貝(Argopecten irradians)的一個亞種，是我國目前的主養(yǎng)品種，而其另一個產(chǎn)于墨西哥灣及其毗鄰水域的姊妹亞種墨西哥灣扇貝(Argopecten irradians concentricus)也已引種到我國進(jìn)行養(yǎng)殖。該兩個亞種的正反交實驗表明，其精卵可正常受精并發(fā)育，但其子代中未發(fā)現(xiàn)雄性不育體的存在。因此，通過海灣扇貝(Argopecten)屬內(nèi)不同種間的雜交是可能獲得雄性不育體的一個新途徑。

發(fā)明內(nèi)容
2009年有關(guān)產(chǎn)業(yè)單位從南美洲引進(jìn)一批秘魯扇貝(Argopectenpurpuratus)以期直接用于養(yǎng)殖生產(chǎn)。鑒于秘魯扇貝與海灣扇貝性狀的互補(bǔ)性，特別是鑒于兩種扇貝染色體數(shù)目相同、配子形態(tài)和尺寸相近、同源性較強(qiáng)、分化歷史不遠(yuǎn)，且同為雌雄同體生殖類型等因素，在前期海灣扇貝亞種間雜交的基礎(chǔ)上，我們重點開展了海灣扇貝和秘魯扇貝屬內(nèi)種間雜交研究，以期在海灣扇貝雄性不育性研究方面取得突破。經(jīng)過嚴(yán)格的雜交實驗及近一年的跟蹤養(yǎng)殖試驗觀察，海灣扇貝X秘魯扇貝(正反交)組合可產(chǎn)生較高比例的雄性不育體。到目前為止，除本專利所述，尚未見有制備海灣扇貝雄性不育體及以此為基礎(chǔ)的進(jìn)一步方法或產(chǎn)品的報道，更不論其它貝類或其它動物的這方面報道。到目前為止，海灣扇貝X 秘魯扇貝(正反交)雜交組合是海灣扇貝乃至所有貝類通過種間雜交途徑制備并獲得雄性不育體之唯一途徑。海灣扇貝雄性不育體的創(chuàng)制成功，為雄性不育系的建立奠定了基礎(chǔ)，并使海灣扇貝生產(chǎn)性雜交制種成為可能。同時，海灣扇貝的雄性不育化也將為貝類的性別演化與控制機(jī)制等基礎(chǔ)理論研究提供新的研究平臺。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供了一種適合制備海灣扇貝雄性不育體的方法， 填補(bǔ)了海灣扇貝乃至貝類雄性不育體制備的空白。本發(fā)明所具有不育體比例高，效果穩(wěn)定， 技術(shù)相對簡單，容易推廣等優(yōu)點。本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案一種海灣扇貝雄性不育體的制備方法，通過北方海灣扇貝(Argopectenirradians irradians)JJl (Argopecten purpuratus)禾中貝H個生f 胃#，g 些不育體可達(dá)性成熟，發(fā)育成熟的不育體只有橘紅色雌性性腺，并只能產(chǎn)生卵子而不能產(chǎn)生精子。具體操作過程如下1親本的促熟和催產(chǎn)，a.促熟親貝的促熟是在每年的1 4月份，海灣扇貝親貝催熟的起始溫度和當(dāng)時自然海水溫度一致，一般為7 8°C ；秘魯扇貝親貝催熟的起始溫度和引進(jìn)時引進(jìn)地的自然海水溫度一致，為11 12°C ；每天升溫0.5 1°C，逐漸升至16°C，穩(wěn)定3 5天后，再升至18 20°C培養(yǎng)；促熟過程一共持續(xù)15 20天；b.投喂飼料為新鮮硅藻，并輔以人工飼料；人工飼料為螺旋藻粉或蛋黃，占投喂飼料總重量的5 10% ；
c.經(jīng)過促熟的海灣扇貝和秘魯扇貝親本，陰干15 30mins后，用注射器向閉殼肌注射0. 015 0. 025mM的5-羥色胺0. 05 0. 15mL。2親本精、卵的分別排放和收集，a.海灣扇貝和秘魯扇貝的親本被分別單個放入單獨的預(yù)置升溫海水的容器中，在 30mins內(nèi)水溫從18 20°C逐漸升至24°C ；b.水溫升至24°C后的15 30mins，親本開始排出精子，這個過程持續(xù)45 60mins ；每個個體的精子被單獨收集；c.排精結(jié)束后，用22 24°C海水對精子排放后的扇貝充分沖洗，以清除親本殼內(nèi)外粘污的精子；d.親本排精后約15 20mins，開始排卵，每個個體可排卵3 4次；每個親本排出的卵子也被單獨收集；在人工授精前，避免意外受精；e.將收集的卵子倒入> 400目的篩網(wǎng)內(nèi)，用22 24°C海水對卵子進(jìn)行反復(fù)沖洗， 以防卵子表面被其它精子的意外粘污。3海灣扇貝和秘魯扇貝的雜交，a.海灣扇貝和秘魯扇貝實行一對一正反向雜交，用海灣扇貝的精子給秘魯扇貝的卵子授精，同時也用秘魯扇貝的精子給海灣扇貝的卵子授精，建立正反交雜交組合；控制每個卵子表面附有精子5 10個；b.為了確保沒有自體受精的發(fā)生，在雜交的同時，分別取海灣扇貝親本和秘魯扇貝親本的部分卵子不加入精液，以為對照；1 2小時后鏡檢，如發(fā)現(xiàn)有受精胚體出現(xiàn)，則其相應(yīng)的正反向雜交組合被放棄。4海灣扇貝和秘魯扇貝雜交子代的培養(yǎng)，a.受精卵在22 24°C沙濾海水中20 24小時孵化成面盤幼蟲，面盤幼蟲培養(yǎng)密度為5 7個/ml ；b.幼蟲孵化后開始投喂金藻，5天及5天后投喂等體積混合的金藻和硅藻，根據(jù)幼蟲胃內(nèi)飼料鏡檢情況，以決定每天投入的飼料次數(shù)和數(shù)量；c.當(dāng)30 40%幼蟲出現(xiàn)眼點時，投入聚乙烯網(wǎng)片用做幼蟲的附著基；d.孵化后的10 13天，幼蟲經(jīng)過附著變態(tài)成為稚貝；將稚貝和其附著基裝入 50 70目尼龍網(wǎng)袋培育，每個網(wǎng)袋放入1 2片附有稚貝的附著基；e.當(dāng)稚貝殼長達(dá)到600 800 μ m時進(jìn)行降溫培育，每天降溫1 2°C，直至溫度降至室外自然海水溫度，并直接轉(zhuǎn)入海區(qū)或海水池塘養(yǎng)殖；f.當(dāng)稚貝殼長達(dá)到0.3 5cm時，將其從附著基上刷至20 30目尼龍網(wǎng)袋中繼續(xù)海上培養(yǎng)，殼長達(dá)2. 5 3. 5cm時，轉(zhuǎn)移至養(yǎng)成籠進(jìn)行海上養(yǎng)成，養(yǎng)成籠每層置25 35 個幼貝。5雜交子代雄性不育體的鑒定，a.對生長1齡或1齡后的雜交后代進(jìn)行升溫促熟；促熟方法如權(quán)利要求3所述步驟a;b.促熟后的雜交貝通過肉眼觀察性腺發(fā)育情況；c.將水溫升至22 24°C，對促熟的雜交貝進(jìn)行催產(chǎn)，鏡檢觀察是否有精子排放或所產(chǎn)卵子是否有精子污染；d.性腺切片的輔助觀察性腺的切片將雜交個體性腺剪下，浸入Bouin’ s液固定≥8小時，放入體積濃度70 80 %乙醇保存；經(jīng)30 %，50 %，70 %，95 %乙醇脫水，二甲苯透明，透蠟，石蠟包埋，切片厚度5 μ m，采用HE (蘇木精-伊紅)染色后用中性樹膠制成永久裝片；顯微鏡觀察性腺發(fā)育情況，確定性腺內(nèi)是否有成熟精子；e.大部分個體性腺發(fā)育為完全橘紅色，乳白色“精區(qū)”退化，只產(chǎn)生卵子，不產(chǎn)生精子，這類個體被確定為雄性不育體。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的優(yōu)點1.本發(fā)明涉及海灣扇貝雄性不育體的制備方法，目前尚未見到關(guān)于海灣扇貝乃至所有貝類雄性不育體制備方法的報道。2.本發(fā)明為海灣扇貝生產(chǎn)性完全雜交制種技術(shù)新方案提供的材料基礎(chǔ)。3.本發(fā)明用來制備雄性不育體的方法是采用種間雜交方法，該方法保證了雌性不育體的持續(xù)獲得。4.本發(fā)明通過種間雜交成功培育出海灣扇貝的雄性不育體，與其他方法，例如激素法相比，制備的雄性不育體比例高、技術(shù)效果穩(wěn)定、且沒有污染和潛在的食品安全問題。5.本發(fā)明通過海灣扇貝和秘魯扇貝的雜交獲得海灣扇貝雄性不育體，其雜交對象的選擇適合，沒有配子隔離，且F1可達(dá)性成熟。6.本發(fā)明通過種間雜交成功培育出海灣扇貝的雄性不育體，雄性不育體的制作技術(shù)較為簡單、效果穩(wěn)定、易于推廣。7.本發(fā)明所涉及的雌雄同體雜交方法，采用雌雄同體扇貝精、卵分別單獨控制排放技術(shù)，能夠確保種間的嚴(yán)格定向雜交。
具體實施例方式實施例親本的促熟和催產(chǎn)2009年4月，將北方海灣扇貝(Argopecten irradiansirradians)禾口禾必魯扇貝(Argopecten purpuratus)親本培育7jC溫升至 20°C并十亙溫在20°C，以對其進(jìn)行恒溫促熟。海灣扇貝親貝催熟的起始溫度和當(dāng)時當(dāng)?shù)刈匀缓Ｋ疁囟纫恢?，?°C;秘魯扇貝親貝催熟的起始溫度和引進(jìn)時引進(jìn)地的自然海水溫度一致，為irC; 分別每天升溫1°C，逐漸升至18°C，穩(wěn)定3天后，再升至20°C恒溫培養(yǎng)；促熟過程一共持續(xù) 18天；投喂飼料為新鮮硅藻，并輔以人工飼料蛋黃，蛋黃占飼料總重量的10% ；采卵前將經(jīng)過促熟的海灣扇貝和秘魯扇貝親本陰干15min，用微量注射器向閉殼肌注射100μ 1濃度為 200μΜ的5-羥色胺，以促進(jìn)精卵的單獨排放，然后對每個個體分別進(jìn)行精卵的排放和收集。1.親本精、卵的分別排放和收集對先行排精個體的精子進(jìn)行收集后，海灣扇貝和秘魯扇貝的親本被分別單個放入 5L的塑料桶中待產(chǎn)，在30mins內(nèi)水溫從20°C逐步升至24°C ；水溫升至24°C后的15 30mins，親本開始排出精子，這個過程持續(xù)45 60mins ； 每個個體的精子被單獨收集；排精結(jié)束后，用22 24°C海水對精子排放后的親本殼內(nèi)外進(jìn)行徹底的清洗，清除親本殼內(nèi)外粘污的精子，以避免所粘留精子對后續(xù)所排自體卵子的意外受精；親本排精后約15 20mins，開始排卵，每個個體可排卵3 4次；每個親本排出的卵子也被單獨收集，在人工授精前，避免意外受精；將收集的卵子倒入400目的篩網(wǎng)內(nèi)，用22 24°C清潔海水對卵子進(jìn)行反復(fù)沖洗，以防卵子表面被其它精子的意外粘污。
2.海灣扇貝和秘魯扇貝的雜交在獲得兩種扇貝無意外污染的精卵后，海灣扇貝和秘魯扇貝實行一對一正反向雜交，分別用海灣扇貝的精子給秘魯扇貝的卵子授精，用秘魯扇貝的精子給海灣扇貝的卵子授精，建立正反交雜交組合；每個卵子表面控制精子5 10個；制備8個海灣扇貝X秘魯扇貝(正交)，8個秘魯扇貝X海灣扇貝(反交)雜交系。為了確保沒有自體受精的發(fā)生，在雜交的同時，分別取海灣扇貝親本和秘魯扇貝親本的部分卵子不加入精液，作為對照，1 2小時后鏡檢，如發(fā)現(xiàn)有受精胚體出現(xiàn)，則其相應(yīng)的正反向雜交組合被放棄。3.海灣扇貝和秘魯扇貝雜交子代的培養(yǎng)受精卵在22 24°C沙濾海水中20 24小時孵化成面盤幼蟲，幼蟲孵化后開始投喂金藻，5日齡前幼蟲投喂金藻；5日及5日后投喂等體積混合的金藻和硅藻，根據(jù)幼蟲胃內(nèi)飼料鏡檢情況，來決定每天投入的飼料次數(shù)和數(shù)量；雜交幼蟲的培養(yǎng)密度5 7個/ml，用于幼蟲培養(yǎng)的海水控制在22 24°C左右。當(dāng)雜交扇貝幼蟲30 40%出現(xiàn)眼點時(此時雜交貝殼長至約190 210 μ m)，投入聚乙烯網(wǎng)片作為幼蟲的附著基；幼蟲孵化后的10 13天，幼蟲附著結(jié)束，扇貝的幼蟲變態(tài)成為稚貝，將稚貝和其附著基裝入60目尼龍網(wǎng)袋(或聚乙烯網(wǎng)袋)培育，每個網(wǎng)袋放入1 2片附著基；當(dāng)稚貝殼長達(dá)到600 800 μ m時進(jìn)行降溫培育，每天降溫2°C，直至溫度降至自然海水溫度，直接掛海上培養(yǎng)；當(dāng)稚貝殼長達(dá)到0. 3 5cm時，將其從附著基上刷至20 30目尼龍網(wǎng)袋中繼續(xù)海上培養(yǎng)，殼長達(dá)2. 5 3. 5cm時，轉(zhuǎn)移至養(yǎng)成籠進(jìn)行海上養(yǎng)殖，養(yǎng)成籠每層25 35個幼貝。4.雜交后代雄性不育體的鑒定方法如下 每個雜交系取10個只有雌性腺個體進(jìn)行催產(chǎn)和鏡檢，取3只個體進(jìn)行性腺切片觀察。a. 2010年4月對1齡雜交后代進(jìn)行室內(nèi)升溫催熟；催熟的起始溫度和當(dāng)時當(dāng)?shù)刈匀缓Ｋ疁囟纫恢?，?°C;分別每天升溫1°C，逐漸升至16°C，穩(wěn)定3天后，再升至20°C培養(yǎng)；促熟過程一共持續(xù)20天；b.促熟后的雜交貝通過肉眼觀察性腺發(fā)育情況；50. 0 84. 9%以上個體只保留橘紅色雌性性腺(表1)；c.將水溫升至22 24°C，利用22 24°C海水對促熟的雜交貝進(jìn)行催產(chǎn)，鏡檢觀察是否有精子排放或所產(chǎn)卵子是否有精子污染；d.性腺切片的輔助觀察(任成林等，動物組織Hl El染色石蠟切片技術(shù)的改進(jìn)，河北北方學(xué)院學(xué)報，2007，23 :41 45)性腺的切片將雜交個體性腺剪下，浸入Bouin’ s液固定≥8小時，放入體積濃度70-80 %乙醇保存；經(jīng)30 %，50 %，70 %，95 %乙醇脫水，二甲苯透明，透蠟，石蠟包埋，切片厚度5 μ m，采用HE (蘇木精-伊紅)染色后用中性樹膠制成永久裝片；顯微鏡觀察性腺發(fā)育情況，看性腺內(nèi)是否有熟精子；e.大部分個體性腺發(fā)育為完全橘紅色、乳白色“精區(qū)”退化，只產(chǎn)生卵子，不產(chǎn)生精子，這類個體被確定為雄性不育體。具體結(jié)果見表1 表1 實施例1 16為16對重復(fù)配對雜交組合子代的各生產(chǎn)指標(biāo)及雄性不育體比例，其中8個為利用海灣扇貝卵子和秘魯扇貝精子的正向雜交(AI/AP)，8個為利用秘魯扇貝的卵子和海灣扇貝的精子的反向雜交(AP/AI)。
權(quán)利要求
1.一種海灣扇貝雄性不育體的制備方法，其特征在于通過海灣扇貝與秘魯扇貝的種間雜交以獲得海灣扇貝雄性不育體，這些不育體可達(dá)性成熟，性成熟時只有橘紅色雌性性腺，并只能產(chǎn)生卵子而不能產(chǎn)生精子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于雄性不育體的具體制備操作過程如下，a.親本的促熟和催產(chǎn)；b.親本精、卵的分別排放和收集；c.海灣扇貝和秘魯扇貝的雜交；d.海灣扇貝和秘魯扇貝雜交子代的培養(yǎng)；e.雜交后代雄性不育體的鑒定。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于親本的促熟和催產(chǎn)具體過程如下，a.促熟親貝的促熟是在每年的1 4月份，海灣扇貝親貝催熟的起始溫度和當(dāng)時自然海水溫度一致，一般為7 8°C ；秘魯扇貝親貝催熟的起始溫度和引進(jìn)時引進(jìn)地的自然海水溫度一致，為11 12°C ；每天升溫0.5 1°C，逐漸升至16°C，穩(wěn)定3 5天后，再升至 18 20°C培養(yǎng)；促熟過程一共持續(xù)15 20天；b.投喂飼料為新鮮硅藻，并輔以人工飼料；人工飼料為螺旋藻粉或蛋黃，占飼料總重量的5 10% ；c.經(jīng)過促熟的海灣扇貝和秘魯扇貝親本，陰干15 30mins后，用注射器向閉殼肌注射 0. 015 0. 025mM 的 5-羥色胺 0. 05 0. 15mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于親本精、卵的分別排放和收集具體過程如下，a.海灣扇貝和秘魯扇貝的親本被分別單個放入單獨的預(yù)置升溫海水的容器中，在 30mins內(nèi)水溫從18 20°C逐漸升至24°C ；b.水溫升至24°C后的15 30mins，親本開始排出精子，這個過程持續(xù)45 60mins； 每個個體的精子被單獨收集；c.排精結(jié)束后，用22 24°C海水對精子排放后的扇貝充分沖洗，以清除親本殼內(nèi)外粘污的精子；d.親本排精后約15 20mins，開始排卵，每個個體可排卵3 4次；每個親本排出的卵子也被單獨收集；在人工授精前，避免意外受精；e.將收集的卵子倒入>400目的篩網(wǎng)內(nèi)，用22 24°C海水對卵子進(jìn)行反復(fù)沖洗，以防卵子表面被其它精子的意外粘污。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于海灣扇貝和秘魯扇貝的雜交具體過程如下，a.海灣扇貝和秘魯扇貝實行一對一正反向雜交，用海灣扇貝的精子給秘魯扇貝的卵子授精，同時也用秘魯扇貝的精子給海灣扇貝的卵子授精，建立正反交雜交組合；控制每個卵子表面附有精子5 10個；b.為了確保沒有自體受精的發(fā)生，在雜交的同時，分別取海灣扇貝親本和秘魯扇貝親本的部分卵子不加入精液，以為對照；1 2小時后鏡檢，如發(fā)現(xiàn)有受精胚體出現(xiàn)，則其相應(yīng)的正反向雜交組合被放棄。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于海灣扇貝和秘魯扇貝雜交子代的培養(yǎng)方法具體如下，a.受精卵在22 24°C沙濾海水中20 24小時孵化成面盤幼蟲，面盤幼蟲培養(yǎng)密度為5 7個/ml ；b.幼蟲孵化后開始投喂金藻，5天及5天后投喂等體積混合的金藻和硅藻，根據(jù)幼蟲胃內(nèi)飼料鏡檢情況，以決定每天投入的飼料次數(shù)和數(shù)量；c.當(dāng)30 40%幼蟲出現(xiàn)眼點時，投入聚乙烯網(wǎng)片用做幼蟲的附著基；d.孵化后的10 13天，幼蟲經(jīng)過附著變態(tài)成為稚貝；將稚貝和其附著基裝入50 70 目尼龍網(wǎng)袋培育，每個網(wǎng)袋放入1 2片附有稚貝的附著基；e.當(dāng)稚貝殼長達(dá)到600 800μ m時進(jìn)行降溫培育，每天降溫1 2°C，直至溫度降至室外自然海水溫度，并直接轉(zhuǎn)入海區(qū)或海水池塘培育；f.當(dāng)稚貝殼長達(dá)到0.3 5cm時，將其從附著基上刷至20 30目尼龍網(wǎng)袋中繼續(xù)海上培養(yǎng)，殼長達(dá)2. 5 3. 5cm時，轉(zhuǎn)移至養(yǎng)成籠進(jìn)行海上養(yǎng)殖，養(yǎng)成籠每層置25 35個幼貝。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于雜交子代雄性不育體的鑒定方法如下，a.對生長1齡或1齡后的雜交后代進(jìn)行升溫促熟；促熟方法如權(quán)利要求3所述步驟a；b.促熟后的雜交貝通過肉眼觀察性腺發(fā)育情況；c.將水溫升至22 24°C，對促熟的雜交貝進(jìn)行催產(chǎn)，鏡檢觀察是否有精子排放或所產(chǎn)卵子是否有精子污染；d.性腺切片的輔助觀察性腺的切片將雜交個體性腺剪下，浸入Bouin’s液固定>8 小時，放入體積濃度70 80 %乙醇保存；經(jīng)30 %，50 %，70 %，95 %乙醇脫水，二甲苯透明， 透蠟，石蠟包埋，切片厚度5 μ m，采用HE (蘇木精-伊紅)染色后用中性樹膠制成永久裝片； 顯微鏡觀察性腺發(fā)育情況，確定性腺內(nèi)是否有成熟精子；e.大部分個體性腺發(fā)育為完全橘紅色，乳白色“精區(qū)”退化，只產(chǎn)生卵子，不產(chǎn)生精子， 這類個體被確定為雄性不育體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種海灣扇貝雄性不育體的制備方法。選擇與海灣扇貝同屬、染色體數(shù)目相同、配子形態(tài)和尺寸相近，且同為雌雄同體的秘魯扇貝與海灣扇貝雜交，以制備雄性不育體。這些雌雄不育體隨著性腺發(fā)育，精巢逐漸被卵巢所取代，性腺發(fā)育成熟時，整個性腺呈雌性特有的橘紅色，且只能產(chǎn)生卵子而能不產(chǎn)生精子。本專利所闡述的方法具有不育體比例高和技術(shù)效果穩(wěn)定、相對簡單、易推廣等優(yōu)點。
文檔編號A01K61/00GK102217561SQ201010147849
公開日2011年10月19日 申請日期2010年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月13日
發(fā)明者張國范, 張守都, 李莉, 許飛 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所