專利名稱：一種油葵的基因轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)和植物育種領(lǐng)域，尤其是一種油葵的基因轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
油用向日葵(簡稱油葵)是近30年來總產(chǎn)量增長最快的世界三大油料作物之一， 年增長率7. 1%，世界上油葵的主產(chǎn)國是阿根廷、法國、其次是中國。我國的油葵主要集中在 東北三省、內(nèi)蒙古、新疆和正在迅速發(fā)展的陜西、山西和河北等省、自治區(qū)。油葵的籽實含油 率一股在46%左右，高的可達50%以上，出油率在42%以上。油葵油不含芥酸、硫代葡萄 糖甙等對人體有害的物質(zhì)，但含有豐富的對人體非常有益的不飽和脂肪酸，其中亞油酸含 量65%左右，油酸25%左在，亞油酸能調(diào)節(jié)新陳代謝、維持血壓平衡、能溶解脫離沉積在腸 壁上的多余膽固醇，因而可降低血壓、預(yù)防動脈硬化。由于含有和亞油酸比例相當(dāng)?shù)木S生素 E，可阻止亞油酸的迅速氧化。另外還含有大量的維生素A、類胡羅卜素等人體必需的營養(yǎng)物 質(zhì)，在促進毛細血管增生、改善血液循環(huán)、延緩細胞衰老、防止夜盲癥等方面具有重要作用。 油葵油油質(zhì)純正、無異味、芳香可口、易被吸收。作為食用油、油葵在全國僅占8%，而香港占 70%。隨著我國國民經(jīng)濟的發(fā)展和人民生活水平的提高，油葵油的消費將呈上升趨勢。
油葵作為重要的油料植物，近些年在我國已大面積應(yīng)用，有關(guān)的育種研究也有報 道，但關(guān)于利用基因工程技術(shù)進行育種的研究還沒有。由于油葵多為野生，種質(zhì)資源不豐 富，品種性狀單一，所以利用常規(guī)育種技術(shù)很難得到理想的育種目標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種育種速度快、方法簡單的油 葵的基因轉(zhuǎn)化方法。 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的
—種油葵的基因轉(zhuǎn)化方法，其轉(zhuǎn)化方法的步驟是
(1)取油葵試管苗組織作為外植體； (2)取農(nóng)桿菌C58C1的一個單菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基中過夜振蕩培養(yǎng)，待其 OD值為0. 2-0. 6時，取出并浸染油葵試管苗組織外植體； (3)將上述浸染過的油葵試管苗外植體放在含有2-5mg/L除草劑的分化培養(yǎng)基上 進行再生芽的誘導(dǎo)，該分化培養(yǎng)基為MS+KTO. 25mg/L+IAA0. 5mg/L，外植體長度為2-3cm，接 種50-150塊，培養(yǎng)條件為20-30°C、20-26h光照、光強1500-25001x，從接種后每0_14天繼 代一次，生成轉(zhuǎn)化苗； (4)將上述除草劑篩選的轉(zhuǎn)化苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，其生根培養(yǎng)基的構(gòu)成為 1/2MS+IAA0. 5mg/L，待轉(zhuǎn)化苗苗長到2_5cm高時即可移栽到花盆中。
而且，所述接種后最佳時間為每7天繼代一次。
而且，所述分化培養(yǎng)基上的除草劑濃度最佳為3mg/L。
而且，所述油葵試管苗組織外植體最佳為莖段部分。
3
而且，所述除草劑包括草丁膦。
本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是 本發(fā)明建立一套油葵的基因轉(zhuǎn)化方法，分別對篩選標(biāo)記(除草劑)濃度、不同轉(zhuǎn)化 外植體的選擇、采用不同的繼代時間進行了確定，本方法表明在培養(yǎng)基中加入3mg/L的除 草劑濃度下，以油葵的莖段為外植體，在每周繼代一次的條件下可獲得最高的轉(zhuǎn)化效率，為 油葵的各種基因轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明進一步說明，下述實施例是說明性的，不是限定性的， 不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍。 油葵(試管苗)及轉(zhuǎn)化所用帶抗鹽轉(zhuǎn)錄因子HS的質(zhì)粒(HS/pCB302)和農(nóng)桿菌 C58C1均由天津農(nóng)學(xué)院園藝系園林植物實驗室提供。以下實施例中用藥品為MS培養(yǎng)基；
6-BA試劑；NAA試劑；蔗糖；瓊脂粉；肌醇；蒸餾水；NaOH試劑。
—種油葵的基因轉(zhuǎn)化方法，其轉(zhuǎn)化方法是 (1)取生長健壯的油葵試管苗，將莖段作為外植體； (2)取農(nóng)桿菌C58C1的一個單菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基中過夜振蕩培養(yǎng)，待其 0D值為0. 4時，取出并浸染油葵試管苗外植體； (3)將上述浸染過的油葵試管苗外植體放在含有3mg/L除草劑的分化培養(yǎng)基上， 分化培養(yǎng)基為MS+KTO. 25mg/L+IAA0. 5mg/L，進行再生芽的誘導(dǎo)，莖段長度為2-3cm，接種 100塊，培養(yǎng)條件為28°C，24h光照，光強20001x，從接種后每7天繼代一次；除草劑濃度為 3mg/L時應(yīng)該為理想的篩選壓力。當(dāng)繼代時間為7天時，接種外植體的再生率最高，即獲得 的基因轉(zhuǎn)化率也最高；繼代時間為7天時獲得的轉(zhuǎn)化效果最好。 (4)將上述除草劑篩選的轉(zhuǎn)化苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上，該生根培養(yǎng)基的構(gòu)成為
1/2MS+IAA0. 5mg/L，待轉(zhuǎn)化苗苗長到3cm高時即可移栽到花盆中。 所述除草劑為草丁膦，草丁膦是標(biāo)記基因為bar基因的篩選藥劑的一種。
權(quán)利要求
一種油葵的基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于其轉(zhuǎn)化方法的步驟是(1)取油葵試管苗組織作為外植體；(2)取農(nóng)桿菌C58C1的一個單菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基中過夜振蕩培養(yǎng)，待其OD值為0.2-0.6時，取出并浸染油葵試管苗組織外植體；(3)將上述浸染過的油葵試管苗外植體放在含有2-5mg/L除草劑的分化培養(yǎng)基上進行再生芽的誘導(dǎo)，該分化培養(yǎng)基為MS+KT0.25mg/L+IAA0.5mg/L，外植體長度為2-3cm，接種50-150塊，培養(yǎng)條件為20-30℃、20-26h光照、光強1500-2500lx，從接種后每0-14天繼代一次，生成轉(zhuǎn)化苗；(4)將上述除草劑篩選的轉(zhuǎn)化苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，其生根培養(yǎng)基的構(gòu)成為1/2MS+IAA0.5mg/L，待轉(zhuǎn)化苗苗長到2-5cm高時即可移栽到花盆中。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種油葵的基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述接種后最佳時 間為每7天繼代一次。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種油葵的基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述分化培養(yǎng)基上 的除草劑濃度最佳為3mg/L。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種油葵的基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述油葵試管苗組 織外植體最佳為莖段部分。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種油葵的基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述除草劑為草丁膦。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種油葵的基因轉(zhuǎn)化方法，步驟是(1)取生長健壯的油葵試管苗組織作為外植體；(2)取農(nóng)桿菌C58C1的一個單菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基中過夜振蕩培養(yǎng)，待其OD值為0.2-0.6時，取出并浸染油葵試管苗組織外植體；(3)將上述浸染過的油葵試管苗外植體放在含有2-5mg/L除草劑的分化培養(yǎng)基上，分化培養(yǎng)，每0-14天繼代一次，生成轉(zhuǎn)化苗；(4)將上述除草劑篩選的轉(zhuǎn)化苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，待轉(zhuǎn)化苗苗長到2-5cm高時即可移栽到花盆中。本發(fā)明建立一套油葵的基因轉(zhuǎn)化方法，分別對篩選標(biāo)記(除草劑)濃度、不同轉(zhuǎn)化外植體的選擇、采用不同的繼代時間進行了明確，并且獲得了最高轉(zhuǎn)化效率，為油葵的各種基因轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。
文檔編號A01H5/00GK101787372SQ20101013446
公開日2010年7月28日 申請日期2010年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月29日
發(fā)明者劉艷軍, 張偉玉, 楊靜慧 申請人:天津農(nóng)學(xué)院