專利名稱：一種與砷響應(yīng)相關(guān)的調(diào)控片段及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與砷響應(yīng)相關(guān)的調(diào)控片段及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著工業(yè)的發(fā)展，重金屬對環(huán)境的污染已成為全球面臨的問題。其中砷對土壤和 水體的污染在我國時有發(fā)生。僅在2008年到2009年初，連續(xù)發(fā)生貴州獨山縣、湖南辰溪 縣、廣西河池、云南陽宗海、河南大沙河以及山東和江蘇交界處的邳蒼分洪道的六起砷污染 事件，導(dǎo)致超過千人不同程度的砷中毒。砷的危害與其它重金屬類似在于它不能被微生物 分解且能在生物體內(nèi)富集，通過食物鏈最終對人體造成危害。砷污染不僅對人類有危害，幾乎對所有生命體包括細(xì)菌、酵母等微生物以及動物 和植物都有毒害。砷不屬于生物生長、發(fā)育過程中所需要的必需元素，砷在細(xì)胞中的積累往 往會引起嚴(yán)重的氧化脅迫導(dǎo)致細(xì)胞死亡。另一方面，各種生物在不同環(huán)境中經(jīng)過長期的進(jìn) 化過程，形成了相應(yīng)的機(jī)制來解除和適應(yīng)一定程度的砷脅迫，而這些機(jī)制根據(jù)生物個體的 共性和特性也存在共有的砷解毒機(jī)理和特異性的調(diào)控系統(tǒng)。砷主要以砷酸鹽狀態(tài)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，但以亞砷酸鹽狀態(tài)被排出體外或者區(qū)隔化。砷 種類的分析表明植物組織中砷主要以亞砷酸鹽狀態(tài)存在。例如，亞砷酸鹽占印度芥菜根 及蓮中總砷的 96-100% (Pickering IJ, Prince RC, George MJ，Smith RD, GeorgeGN, Salt DE(2000)Reduction and co-ordination of arsenic in Indian mustard. Plant Physiol 122 :1171_1177)，占擬南芥葉中總砷的 97-100 % (Dhankher OP, LiYJ, Rosen BP, Shi J, Salt D, Senecoff JF, Sashti NA, Meagher RB(2002)Engineering tolerance and hyperaccumulation of arsenic in plants bycombining arsenate reductase and gammaglutamylcysteine synthetaseexpression. Nature Biotechnology 20 1140-1145)，占馬鈴薯和水稻根總砷的92-99% (Xu etal.，2007)。這些現(xiàn)象提示，砷以 五價砷酸鹽進(jìn)入植物體之后，在植物細(xì)胞中砷酸鹽被有效地還原成亞砷酸鹽，而且大多數(shù) 植物具有高效的砷還原能力。根據(jù)與酵母砷酸還原酶Acr2p序列同源性分析，前人克隆 并鑒定了植物中的砷酸還原酶基因ACR2，如擬南芥AtACR2/AtCDC25 (Dhankher OP, Rosen RP, McKinney EC, Meagher RB(2006)Hyperaccumulation of arsenic in the shoots ofArabidopsis silernced for arsenate reductase,ACR2. Proc Natl Acad Sci USA103 5413-5418)，絨毛草 HIACR/HlAsr (Bleeker et al.，2006)和水稻 0sACR2 ； 1、0sACR2 ； 2(Duan GL,Zhou Y,Tong YP,Mukhopadhyay R，Rosen BP,Zhu YG(2007)A CDC25 homologue from rice funct ions as an arsenate reductase. New Phytoll74 :311_321)等。利用大 腸桿菌表達(dá)ACR2蛋白如AtACR2、0sACR2 ；2、H1ACR2并證實其能夠催化GSH/Grx-依賴的砷 酸還原(Ellis DR, Gumaelius L, Indriolo Ε, Pickering IJ, Banks JA, Salt DE(2006)A novel arsenate reductase from thearsenic hyperaccumulating fern Pteris vittata. Plant Physioll41(4) 1544-1554) 在擬南芥中，AtACR2基因在所有器官中組成型低水平表達(dá)，根中蛋白表達(dá)比莖中表達(dá)水平高。水稻中，OsACR2 ； 1在根和莖中都有表達(dá)而OsACR2 ；2主要在根中表達(dá)。OsACR2 和 H1ACR2 表達(dá)受砷酸鹽脅迫的誘導(dǎo)(Bleeker PM, Hakvoort HW, Bliek M, Souer E, Schat H(2006)Enhanced arsenate reduction by a CDC25-like tyrosinephosphatase explains increased phytochelatin accumulation inarsenate-tolerant Holcus lanatus. Plant J 45 917-929 ；Duan etal.，2007)。然而，這些基因的表達(dá)是如何調(diào)控的目前仍不清楚。若 能找到基因組上控制這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域及其元件序列，不僅有助于深入認(rèn)識植物砷積累和解毒的分子機(jī)理，而且在砷超富集植物的基因工程中有重要應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于一種調(diào)控片段。本發(fā)明提供的調(diào)控片段是DNA片段，其核苷酸序列是如下1)或2)或3)1)序列表中序列1的自5’端第1-1856位所示的核苷酸序列；2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與所述1)的核苷酸序列雜交且具有啟動子活性的核苷酸序 列；3)與所述1)的核苷酸序列具有70%以上的同源性且具有啟動子活性的核苷酸序 列。本發(fā)明的目的在于提供另一種調(diào)控片段。本發(fā)明提供的另一調(diào)控片段也是DNA片段，其核苷酸序列是如下1)或2)或3)1)序列表中序列1的自5’端第1-2529位所示的核苷酸序列；2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與所述1)的核苷酸序列雜交且具有啟動子活性的核苷酸序 列；3)與所述1)的核苷酸序列具有70%以上的同源性且具有啟動子活性的核苷酸序 列。所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件是指，將雜交膜置于預(yù)雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖液， pH7. 2,7% SDS)中，65°C預(yù)雜交30min ；棄預(yù)雜交液，加入雜交液(0. 25mol/L磷酸鈉緩 沖液，pH7.2,7% SDS，同位素標(biāo)記的核苷酸片段)，65°C雜交12hr ；棄雜交液，加入洗膜 液I (20mmol/L磷酸鈉緩沖液，ρΗ7· 2,5% SDS)，65°C洗膜2次，每次30min ；加入洗膜液 II (20mmol/L 磷酸鈉緩沖液，ρΗ7· 2,1% SDS)，65°C洗膜 30min。本發(fā)明的調(diào)控片段(啟動子活性片段)還包括與來自SEQ ID NO. 1的片段的核苷 酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。這里使用的術(shù)語“互補(bǔ)的”系指遵循堿基配對原則產(chǎn)生的之意。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點突變的方 法，對本發(fā)明的調(diào)控片段的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明分離 得到的調(diào)控片段的核苷酸序列70%或者更高同源性的核苷酸，只要保持了表達(dá)靶基因的啟 動子活性，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。這里使用的術(shù)語“同源性，，指與天然核酸序列的序列相似性?！巴葱?，，包括與本 發(fā)明的調(diào)控片段的核苷酸序列具有優(yōu)選地75%或更高，更優(yōu)選地85%或更高，甚至更優(yōu)選 地90%或更高，以及最優(yōu)選地95%或更高同一性的核苷酸序列。同源性可以用肉眼或計算 機(jī)軟件進(jìn)行評價。使用計算機(jī)軟件，兩個或多個序列之間的同源性可以用百分比(％)表 示，其可以用來評價相關(guān)序列之間的同源性。
含有任一上述的調(diào)控片段的重組載體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。上述重組載體具體可以是任一上述的調(diào)控片段插入載體ρΒΙΙΟΙ的多克隆位點制 成的重組載體。含有任一上述的調(diào)控片段的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。含有任一上述的調(diào)控片段的重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。任一上述的調(diào)控片段在驅(qū)動目的基因在植物體內(nèi)表達(dá)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍之內(nèi)。上述目的基因可以是⑶S基因。任一上述的調(diào)控片段在研究植物體對砷脅迫應(yīng)答中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù) 范圍之內(nèi)。本發(fā)明的方法對雙子葉植物和單子葉植物均適用，因此，被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織 或器官既可來源于擬南芥、油菜、花生、棉花、大豆、向日葵、棕櫚樹、橄欖樹、蓖麻、馬鈴薯或 煙草等雙子葉植物，也可來源于水稻、玉米、小麥、大麥、燕麥、黑麥、高梁、谷子或草坪草等 單子葉植物。實驗證明無論是pAtACR2e轉(zhuǎn)基因擬南芥的地上部分還是根部中以及砷處理與 否，均測不到GUS的活性存在，表明僅以AtACR2基因上游啟動子區(qū)域及其5’非編碼區(qū)為驅(qū) 動序列時，無法驅(qū)動GUS基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)；而在pAtACR2e-li轉(zhuǎn)基因擬南芥中出現(xiàn)了較強(qiáng)的 ⑶S活性，表明第一內(nèi)含子和第一外顯子區(qū)域?qū)τ隍?qū)動基因表達(dá)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。此 外，pAtACR2e-li轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗在Na3AsO4脅迫條件下⑶S組化反應(yīng)染色明顯比無砷條 件下弱，暗示第一內(nèi)含子和第一外顯子序列還參與了對Na3AsO4脅迫發(fā)生應(yīng)答，負(fù)調(diào)控該基 因的表達(dá)；pAtACR2e-li-2i轉(zhuǎn)基因擬南芥中的⑶S活性表現(xiàn)為最強(qiáng)，pAtACR2e-li_2i轉(zhuǎn)基 因株系中⑶S組化反應(yīng)染色在砷脅迫下較無砷條件也有所減弱，但沒有pAtACR2e-li轉(zhuǎn)基 因株系的差別大，說明第二內(nèi)含子和第二外顯子序列對AtACR2基因在砷脅迫下穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄 表達(dá)起一定的緩沖調(diào)控作用。


圖1為擬南芥AtACR2基因的啟動調(diào)控子及其基因組結(jié)構(gòu)示意圖，AtACR2基因組 序列中依次包括TSS上游啟動子PACK2、5’ -UTR、第一外顯子EIack2、第一內(nèi)含子IIack2、第二 外顯子E2AeK2、第二內(nèi)含子I2AeK2、第三外顯子E3AeK2和3，-UTR。圖2為擬南芥AtACR2基因的啟動調(diào)控序列驅(qū)動GUS報告基因的植物表達(dá)載體示 意圖。圖3為在無砷和砷脅迫處理后不同轉(zhuǎn)基因擬南芥的⑶S組化染色，(A) :PAtACR2e 轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗；(B) :PAtACR2e-li轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗；(C) :pAtACR2e-li-2i轉(zhuǎn)基因擬
南芥幼苗。 圖4為在無砷和砷脅迫處理后不同轉(zhuǎn)基因擬南芥地上部和根部的⑶S表達(dá)活性比 較，(A) :pAtACR2e、pAtACR2e_li和pAtACR2e_li_2i轉(zhuǎn)基因擬南芥地上部的GUS表達(dá)活性 比較；(B) :pAtACR2e、pAtACR2e_li和pAtACR2e_li_2i轉(zhuǎn)基因擬南芥根部的GUS表達(dá)活性 比較，數(shù)值為每種構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因擬南芥各8個株系(每個株系10棵植株)的平均值，單位 pmol 4-甲基傘形酮 mirT1 mg_1 蛋白，Bars are means 士 SD. (η = 3)。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實施例1、調(diào)控片段的獲得及其功能檢測一、擬南芥砷酸還原酶基因AtACR2啟動調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)特征分析以及擬南芥AtACR2基因的啟動調(diào)控表達(dá)載體的設(shè)計1、擬南芥砷酸還原酶基因AtACR2啟動調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)特征分析根據(jù)擬南芥基因組序列，AtACR2基因的基因組由三個外顯子和兩個內(nèi)含子組成 (圖1)。其中，第一個外顯子有164個堿基(包含33bp 5’非編碼區(qū))，第二個外顯子有139 個堿基。在如此短的外顯子片段后就存在2個內(nèi)含子(分別有406bp和511bp)，因而推測該 基因的表達(dá)調(diào)控區(qū)域除了 5’非編碼區(qū)上游的啟動子以外，其2個內(nèi)含子區(qū)域也可能參與了 AtACR2基因的表達(dá)調(diào)控。我們根據(jù)這種結(jié)構(gòu)特征(圖1)，將5’端非編碼區(qū)的上游1250bp 的啟動子序列命名為PAQi2以及第一個內(nèi)含子和第二個內(nèi)含子分別暫命名為IIaq 和12_。2、擬南芥AtACR2基因的啟動調(diào)控表達(dá)載體的設(shè)計為了深入了解AtACR2基因表達(dá)的組織特異性及其對砷酸鹽脅迫的響應(yīng)機(jī)制， 根據(jù)AtACR2基因的基因組及其啟動子區(qū)域的結(jié)構(gòu)特點，其啟動子paqs和兩個內(nèi)含子 IIacr2> I2Ace2等區(qū)域可能參與了對基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的啟動和調(diào)控，因而分別設(shè)計了三段序列 (PAtACR2e、PAtACR2e_il、PAtACR2e_il_i2)作為啟動調(diào)控子驅(qū)動報告基因GUS基因，分 別構(gòu)建成植物表達(dá)載體。其中，將含有AtACR2基因的5’ -UTR及其上游1250bp啟動區(qū)域 (Pacr2)構(gòu)成的pataqi2e序列驅(qū)動報告基因的植物表達(dá)載體命名為pAtACR2e ；將包括了基因上 游1250bp啟動子區(qū)域PA。K2、第一個外顯子、第一內(nèi)含子11_2和第二外顯子幾個堿基的片段 (外顯子序列經(jīng)轉(zhuǎn)錄剪切后可與GUS基因組成融合表達(dá))構(gòu)成的ΡΜΑα;2ε_η序列驅(qū)動報告基 因的植物表達(dá)載體命名為pAtACR2e-il ；將包括PAai2、第一個外顯子、第一內(nèi)含子iiack2、第 二外顯子以及第二內(nèi)含子I2Aae和第三外顯子幾個堿基的片段構(gòu)成的ΡΑ Αα;2ε-η- 2序列，驅(qū)動 報告基因的植物表達(dá)載體命名為PAtACR2e-il-i2(圖2)二、調(diào)控片段的獲得人工合成下述引物pro-Hind III-5 :5， -CCT AAGCTT ATTTTCCGGACATCTCTCAAGCTAC-3，；pro-I-BamH 1-3 :5， -CAC GGATCC TCCAAACACCTTTTCTTCCCTAA-3，；pro-2-BamH 1-3 :5， -TTG GGATCC TCCAGCTATATGCCCGTCAT-3，；pro-3-BamH 1-3 :5， -CGG GGATCC ATCTTCTTTCTTCTCATCAAGA-3，。以野生型哥倫比亞擬南芥(可購自美國擬南芥生物資源中心 (ArabidopsisBiological Resource Center, ABRC))的基因組 DNA (基因組 DNA 的提取參 照 Sambrook, J. , Fritsch, E. F. & Maniatis, T. (1989)Molecular Cloning, A laboratory Manual (2nd ed). Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.提供的方法進(jìn) 行)為模板，用上述引物pro-Hind III-5分別和pro-l-BamH 1-3、pro-2-BamH 1-3以及 pro-3-BamH 1-3組成引物對，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用TaKaRa的高保真pfu聚合酶，擴(kuò)增3個調(diào) 控片段。
利用天根生物工程公司的膠回收試劑盒，具體操作參照試劑盒說明書。DNA序列 測定由英俊生物技術(shù)公司完成，測序結(jié)果顯示3個調(diào)控片段分別是序列表中序列1的自 5，端第1-1277位(命名為PAtACR2e)、序列表中序列1的自5，端第1-1856位(命名為 PAtACR2e-il)和序列表中序列1的自5，端第1-2529位(命名為PAtACR2e_il_i2)。三、調(diào)控片段的功能檢測1、構(gòu)建重組表達(dá)載體將這3 個片段 PAtACR2e、PAtACR2e-il 和 PAtACR2e_il_i2 分別經(jīng) Hind III-BamH I酶切后，連入沒有啟動子的植物表達(dá)載體pBI101(Clontech，USA)Hind III和BamH I位 點，位于⑶S基因上游，從而分別構(gòu)建pAtACR2e、pAtACR2e-li和pAtACR2e-li_2i植物表達(dá) 載體(載體的示意圖如圖2所示)。以熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 α，經(jīng)酶切和測序鑒 定，3個重組表達(dá)載體構(gòu)建正確。2、轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得將pAtACR2e、pAtACR2e_li和pAtACR2e_li_2i質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，分別 獲得含有這三種重組表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，通過花浸泡法轉(zhuǎn)化野生型哥倫比亞擬南芥，于溫 室中培養(yǎng)，待成熟后收獲TO代種子。1)擬南芥陽性苗的抗性篩選由于植物表達(dá)載體整合到擬南芥基因組中時，除了攜帶目標(biāo)片段以外，還將卡那 霉素抗性的基因同時轉(zhuǎn)入植物基因組中，因此可進(jìn)行卡那霉素抗性篩選陽性植株。將收獲的轉(zhuǎn)基因種子用0. 2%的Triton X-100浸泡IOmin ；用10%的次氯酸鈉表 面消毒12min后，用水將種子鋪在含100mg/L卡那霉素的1/2GM無糖培養(yǎng)基上，4°C黑暗培養(yǎng) 2天；22°C，16hr光照培養(yǎng)。一周后觀察幼苗生長情況，在抗性培養(yǎng)基中生長良好、葉片綠色 的植株初步確定為轉(zhuǎn)基因成功的植株，而生長受到抑制、黃化乃至死亡的植株為轉(zhuǎn)基因未 成功的株系。并進(jìn)一步通過PCR進(jìn)行分子鑒定(引物是5 ’ -CAGTCTGACGCTCTCCCAACTGAGC-3， 禾口 5，-GATTATTGAC CCACACTTTGCCGTA-3，)，共獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株 pAtACR2e 為 15 株、 pAtACR2e-li 為 10 株、pAtACR2e_li_2i 為 11 株。表1.⑶S染色液的溶質(zhì)
⑶S染色液_
100 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH7. 0) _ (62 mL 0.2 mol/L Na2HPO4; 38 mL 0.2 mol/L NaH2PO4)
0.1%Triton X-100--
10 mmol/L EDTA_
0. 5 mmol/L亞鐵氰化鉀_
0. 5 mmol/L鐵氰化鉀_
1 mg/mL X-Gluc3、轉(zhuǎn)基因擬南芥中⑶S表達(dá)的差異分析1)⑶S表達(dá)的組化反應(yīng)檢測
設(shè)置Na3AsO4O和200 μ M兩個濃度梯度，在V2GM培養(yǎng)基上對pAtACR2e、 pAtACR2e-li和pAtACR2e-li_2i三種轉(zhuǎn)基因陽性株幼苗處理15天，將整株幼苗取出，加入 含有GUS染色液(GUS染色液溶劑是水，溶質(zhì)見表1)的離心管中，使材料完全沒入染色液 中，37°C下染色12小時，75%乙醇脫色觀察⑶S染色情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)pAtACR2e表達(dá)載體的所有株系無論是否有無砷脅迫條件下均未出現(xiàn) 藍(lán)色(圖3A)，表明僅以AtACR2基因上游啟動子區(qū)域及其5’非編碼區(qū)為驅(qū)動序列時，無法 驅(qū)動⑶S基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)；而pAtACR2e-li和pAtACR2e-li_2i的轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗在無 砷條件下均可呈現(xiàn)較深的藍(lán)色(圖3B)，表明第一內(nèi)含子和第一外顯子區(qū)域?qū)τ隍?qū)動基因 表達(dá)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。此外，pAtACR2e-li轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗在Na3AsO4脅迫條件下 ⑶S組化反應(yīng)染色明顯比無砷條件下弱(圖3B)，暗示第一內(nèi)含子和第一外顯子序列還參與 了對Na3AsOJA迫發(fā)生應(yīng)答，負(fù)調(diào)控該基因的表達(dá)；而pAtACR2e-li-2i轉(zhuǎn)基因株系中⑶S組 化反應(yīng)染色在砷脅迫下較無砷條件也有所減弱，但沒有pAtACR2e-li轉(zhuǎn)基因株系的差別大 (圖3C)，由此推測第二內(nèi)含子和第二外顯子序列對AtACR2基因在砷脅迫下穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄表達(dá) 起一定的緩沖調(diào)控作用。2)⑶S表達(dá)活性的定量分析為了進(jìn)一步了解擬南芥砷酸還原酶基因中上述各啟動調(diào)控元件影響該基因表達(dá) 的作用程度，利用GUS活性的熒光檢測方法對GUS表達(dá)活性進(jìn)行了定量分析。將pAtACR2e、 pAtACR2e-li和pAtACR2e_li_2i轉(zhuǎn)基因擬南芥，在1/2GM固體培養(yǎng)基中進(jìn)行含200 μ M Na3AsO4脅迫處理和未處理培養(yǎng)15天后，分別收取地上部莖葉和根部材料，進(jìn)行⑶S活性測定。結(jié)果如圖4所示，無論是pAtACR2e轉(zhuǎn)基因擬南芥的地上部分還是根部中以及砷處 理與否，均測不到⑶S的活性存在；而在pAtACR2e-li轉(zhuǎn)基因擬南芥中出現(xiàn)了較強(qiáng)的⑶S活 性；pAtACR2e-li-2i轉(zhuǎn)基因擬南芥中的⑶S活性表現(xiàn)為最強(qiáng)。這一結(jié)果與組化反應(yīng)結(jié)果一 致。此外，在pAtACR2e-li和pAtACR2e-li_2i兩種轉(zhuǎn)基因擬南芥中，根部比地上部分具有 更高的⑶S活性；當(dāng)用200 μ M Na3AsO4處理后，各部分⑶S活性降低，特別是pAtACR2e-li 的根部，⑶S活性降低約60% (圖4B)。表明第一內(nèi)含子和第一外顯子區(qū)域參與砷脅迫應(yīng) 答調(diào)控的作用程度在不同的組織器官中存在差異。其中⑶S活性測定方法包括如下的步驟A、蛋白的提取及濃度測定a)取IOOmg植物樣品在液氮中研磨成粉末，加入3倍體積的⑶S提取緩沖液，再研 磨2min，將粉末裝入1. 5ml離心管，搖動5min，12，OOOrpm，40°C離心lOmin，取上清4°C保存?zhèn)溆?。b)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取配制的25 μ g/mlBSA母液，按下表進(jìn)行BSA梯度稀釋。 從中取4ml加入Iml考馬斯亮藍(lán)染液，混勻，室溫放置2min，測定595nm的光吸收值，制作標(biāo) 準(zhǔn)曲線。c)樣品蛋白含量測定取蛋白上清2 μ 1，加水至4ml，加入Iml考馬斯亮藍(lán)染液，混 勻，室溫放置2min，測定595nm的光吸收值，根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品蛋白含量。B、⑶S熒光檢測a)制作4-MU標(biāo)準(zhǔn)配制4_MU梯度濃度液(由反應(yīng)終止液配制)10 μ M，2. 5 μ M，1 μ Μ, 500ηΜ, IOOnM, IOnM,在激發(fā)光365nm，發(fā)射光455nm，狹縫3nm條件下，測定各樣品的熒 光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 b)酶反應(yīng)取40 μ 1蛋白上清，加入400 μ 1反應(yīng)緩 沖液里(37°C預(yù)熱)，立即取 100 μ 1加入到900 μ 1反應(yīng)終止液(0時的空白對照)，37°C溫浴，60min再取100 μ 1，加入 900 μ 1反應(yīng)終止液，測定熒光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各樣品酶活。
權(quán)利要求
一種DNA片段，其核苷酸序列是如下1)或2)或3)1)序列表中序列1的自5’端第1-1856位所示的核苷酸序列；2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與所述1)的核苷酸序列雜交且具有啟動子活性的核苷酸序列；3)與所述1)的核苷酸序列具有70％以上的同源性且具有啟動子活性的核苷酸序列。
2.—種DNA片段，其核苷酸序列是如下1)或2)或3):1)序列表中序列1的自5’端第1-2529位所示的核苷酸序列；2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與所述1)的核苷酸序列雜交且具有啟動子活性的核苷酸序列；3)與所述1)的核苷酸序列具有70%以上的同源性且具有啟動子活性的核苷酸序列。
3.含有權(quán)利要求1或2所述的DNA片段的重組載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于所述重組載體是權(quán)利要求1或2所 述的DNA片段插入載體ρΒΙΙΟΙ的多克隆位點制成的重組載體。
5.含有權(quán)利要求1或2所述的DNA片段的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
6.含有權(quán)利要求1或2所述的DNA片段的重組菌。
7.權(quán)利要求1或2所述的DNA片段在驅(qū)動目的基因在植物體內(nèi)表達(dá)中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述目的基因是GUS基因。
9.權(quán)利要求1或2所述的DNA片段在研究植物體對砷脅迫應(yīng)答中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為雙子葉植物或單子葉 植物，優(yōu)選為擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與砷響應(yīng)相關(guān)的調(diào)控片段及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的調(diào)控片段的核苷酸序列是如下1)或2)或3)1)序列表中序列1的自5’端第1-1856位所示的核苷酸序列；2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與所述1)的核苷酸序列雜交且具有啟動子活性的核苷酸序列；3)與所述1)的核苷酸序列具有70％以上的同源性且具有啟動子活性的核苷酸序列。實驗證明本發(fā)明提供的調(diào)控片段參與砷響應(yīng)應(yīng)答，具有啟動子活性。
文檔編號A01H5/00GK101805735SQ201010128600
公開日2010年8月18日 申請日期2010年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月17日
發(fā)明者何振艷, 孫洋洋, 徐文忠, 戴曉靜, 麻密 申請人:中國科學(xué)院植物研究所