專(zhuān)利名稱(chēng)：：水稻生長(zhǎng)素運(yùn)輸?shù)鞍谆騉sPIN2的基因工程應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明公開(kāi)了水稻生長(zhǎng)素運(yùn)輸?shù)鞍谆?sPIN2的基因工程應(yīng)用，屬于基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地講涉及水稻中編碼生長(zhǎng)素運(yùn)輸?shù)鞍准捌湔{(diào)控的基因應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：氮素是作物重要的大量營(yíng)養(yǎng)元素之一，參與生物體各種代謝過(guò)程。它是植物體中很多生命物質(zhì)的組成成分，比如氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸、酶、葉綠素等。氮分別占植物體干重的1.5-2%和植物總蛋白的16%(FrinkCR.，WaggonerPE.andAusubelJH.Nitrogenfertilizer:retrospectandprospect.Proc.Nati.Acad.Sci.USA.1999.96:11751180.)。目前，中國(guó)氮肥用量占全球氮肥用量的30%(彭少兵，黃見(jiàn)良，鐘旭華，楊建昌，王光火，鄒應(yīng)斌，張福鎖，朱慶森，RolandBuresh，ChristianWitt.提高中國(guó)稻田氮肥利用率的研究策略.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué).2002，35(9):10951103.)，成為世界第一大消費(fèi)國(guó)。其中水稻田中氮肥的施用量超過(guò)其它任何農(nóng)作物，氮肥的損失量占施肥總量的70%。我國(guó)普遍存在著由于氮肥利用率低和大量的氮素?fù)p失導(dǎo)致的一系列環(huán)境問(wèn)題。水稻雖然喜銨作物，但是已經(jīng)有研究表明一定量的硝態(tài)氮能夠促進(jìn)水稻對(duì)銨的吸收，而且在水稻生長(zhǎng)發(fā)育的后期田里和旱作水稻主要以硝態(tài)氮為主。水稻的根系發(fā)育受硝酸鹽調(diào)控，其中主要硝酸鹽促根系生長(zhǎng)的機(jī)制是硝酸鹽調(diào)控了生長(zhǎng)素的運(yùn)輸分布。研究表明細(xì)胞和細(xì)胞之間的IAA極性運(yùn)輸是IAA運(yùn)輸?shù)鞍讈?lái)完成的。其中IAA內(nèi)流運(yùn)輸?shù)鞍子蠥UX1和LAX(AUXl-like)基因家族，外流運(yùn)輸?shù)鞍谆蛴蠵IN基因家方矣(Eiichi.Regulationofrootgrowthbyplanthormones-rolesforauxinandgibberelin.CriticalReviewsinPlantScience,2005，24(4):249-265.)。擬南芥PINl突變體對(duì)IAA的運(yùn)輸能力下降且不能形成正常的花序(0kadaK，JunichiU，KomakiMK，BellCJandShimuraY.RequirementoftheAuxinPolarTransportSysteminEarlyStagesofArabidopsisFloralBudFormation.ThePlantCell,1991，3(7):677-684.)，PIN2突變體導(dǎo)致根系向重力性消失(MullerA，GuanCH，GalweilerL，TanzlerP，HuijserP，MarchantA，ParryG，BennettM，WismanMandPalmeK.AtPIN2definesalocusofArabidopsisforrootgravitropismcontrol.TheEMBOJournal.1998，17(23):6903-6011.)水稻中0sPINl在植株的地上地下部均有表達(dá)，而0sPIN2只在根尖及根莖結(jié)合處表達(dá)(WangJR，HuH，WangGH，LiJ，ChenJYandWuPMolecularPlant.ExpressionofPINGenesinRice(0ryzasativaL):TissueSpecificityandRegulationbyHormones.2009,2(4):823-831.)。通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法過(guò)量或抑制表達(dá)0sPINl都要會(huì)導(dǎo)致水稻根冠比的變化(XuM，ZhuL，ShouHandWuP.PlantCellPhysiol.APINlfamilygene，OsPINl，involvedin肌xin—d印endentadventitiousrootemergenceandtilleringinrice.2005，46(10):1674-1681.)，但并未報(bào)道對(duì)氮素利用效率及產(chǎn)量性狀的改善。本發(fā)明首次公開(kāi)了過(guò)量表達(dá)生長(zhǎng)素運(yùn)輸?shù)鞍谆?sPIN2對(duì)水稻根系、株型的調(diào)控有很大作用，能夠提高水稻對(duì)氮肥的利用率、改善水稻株型、增加水稻的產(chǎn)量。
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的旨在提供水稻生長(zhǎng)素運(yùn)輸?shù)鞍谆?sPIN2的基因工程應(yīng)用，該基因在水稻中過(guò)量表達(dá)可以增大水稻根系、分蘗數(shù)量、分蘗角度、氮素利用效率和最終水稻產(chǎn)技術(shù)方案本發(fā)明提供了水稻生長(zhǎng)素運(yùn)輸?shù)鞍谆?sPIN2的基因工程應(yīng)用，基因登錄號(hào)是AK101191，該基因在調(diào)節(jié)作物根系發(fā)育，分蘗數(shù)目、分蘗角度，提高氮肥利用效率及最終產(chǎn)量方面的應(yīng)用。包括1)總RNA的提取水稻日本晴種子經(jīng)質(zhì)量比30%NaClO消毒，催芽，培養(yǎng)到二葉一心時(shí)，挑選出大小一致的水稻植株，去掉胚乳后移栽至pH5.5的1/2國(guó)際水稻所IRRI營(yíng)養(yǎng)液中，四葉一心時(shí)換為國(guó)際水稻所IRRI全營(yíng)養(yǎng)液，培養(yǎng)一周后，取根及葉片迅速置于液氮中冷凍保存，稱(chēng)取0.lg左右樣品，用液氮研碎，研磨充分加入1.5ml離心管，迅速加入lmlTrizol試劑，加入0.2mL氯仿，離心后吸取上清，加入0.5mL異丙醇，離心后棄上清，加入70%乙醇洗滌沉淀，RNA溶于DEPC水中(體積比為1%。)，用質(zhì)量比為1.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，并用分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度和純度；2)總cDNA合成每個(gè)RNA樣品2yg，加入50ymolL—"01igodT18，加1%。DEPC水補(bǔ)足10iiL，70。C下水浴5min，冰上放置5min后，依次加入RNaseinhibitor0.5iiL和5xRTbuffer5iiL，10mMdNTP2.5iiL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1iiL，1%。DEPC水補(bǔ)足25iiL，42"C水浴60min后，70。C水浴10min終止反應(yīng)；3)0sPIN2基因的cDNA全長(zhǎng)的獲得用以上獲得的水稻日本晴總cDNA為模板，設(shè)計(jì)PCR引物，其PCR產(chǎn)物包含完整的0sPIN2閱讀框(從起始密碼子ATG至3'端非編碼區(qū))，引物序列為PIN2-F:5'—ATGATCACCGGACGCGACATC-3，；PIN2-R:5'-GGAATCTTTAGTACCGCCAACCC-3'PCR程序如下94t:預(yù)變性4min，98t:變性10s，68"C復(fù)性延伸2min，30個(gè)循環(huán)后，72°C10min，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其大小為2203bp片段，將目的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分離后切膠回收，將回收的片段與pMD-19載體連接，酶連體系總體積10iiL，包含5iiL連接液，1yL的pMD-19載體，3_4yL的PCR純化產(chǎn)物，用水補(bǔ)足10yL，然后16t:連接過(guò)夜；再轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中涂在含有安芐100ygmL—1的LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)12h-14h后，挑取陽(yáng)性菌落進(jìn)行DNA測(cè)序，0sPIN2基因登錄號(hào)為AK101191，0sPIN2的cDNA全長(zhǎng)序列包括開(kāi)放閱讀框(ORF)1896bp及3'端非編碼區(qū)UTR307bp;將測(cè)序正確的菌液加入等體積30%甘油于_701:保存?zhèn)溆?，獲得含有目的基因0sPIN2cDNA全長(zhǎng)序列的重組質(zhì)粒，命名為pPIN2inT;4)超量表達(dá)載體pUbi-PIN2的構(gòu)建根據(jù)水稻生長(zhǎng)素運(yùn)輸?shù)鞍谆?sPIN2的cDNA序列，設(shè)計(jì)PCR引物，其PCR產(chǎn)物包含完整的0sPIN2閱讀框(從起始密碼子ATG至終止密碼TAG)，并在上游和下游引物上分別引入限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)BamHI，引物序列為overPIN2-F:5'-CTGAGGATCCATGATCACCGGACGCGACATC-3'BamHIoverPIN2-R:5'-GTCAGGATCCCTATATCCCAAGAAGCACATAGT_3，BamHI用以上獲得的pPIN2inT質(zhì)粒為模板，PCR程序如下94。C預(yù)變性4min，98t:變性10s，68t:復(fù)性延伸2min，30個(gè)循環(huán)后，72t:10min，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物大小為2200bp。將目的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分離后切膠回收，回收產(chǎn)物用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI進(jìn)行單酶切，同時(shí)用BamHI單酶切植物過(guò)量表達(dá)載體pCAMBIA1390-ubi質(zhì)粒，然后分別回收酶切過(guò)的PCR片段和載體，將載體進(jìn)行去磷酸化后再次回收；回收后通過(guò)T4連接酶將線(xiàn)性化的載體與酶切過(guò)的PCR片段在4t:下連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，涂在含有卡那霉素50iigmL—1的LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)12h后，挑取陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒經(jīng)BamHI酶切驗(yàn)證片段大小無(wú)誤后，并經(jīng)過(guò)BglII單酶切找出以正向連入表達(dá)載體的克隆，將該菌液進(jìn)行DNA測(cè)序，將含有測(cè)序正確克隆的菌液加入等體積30X甘油于-7(TC保存，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒命名為pUbi-PIN2;最后通過(guò)電擊法將pUbi-PIN2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌EHA105的感受態(tài)細(xì)胞中，涂在含有卡那霉素和鏈霉素均為50iigmL—1的YEP固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)48h后，挑取陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒，經(jīng)BamHI單酶切驗(yàn)證無(wú)誤后，菌液加入等體積30%甘油于-70°0保存，轉(zhuǎn)基因備用；5)轉(zhuǎn)基因植株的獲得侵染愈傷組織和共培養(yǎng)將水稻愈傷組織從繼代培養(yǎng)基中挑出放入離心管中，取培養(yǎng)好的菌液lml于1.5ml離心管中，4°C，5000rpm，離心lmin，去上清，用含200ymolL—1乙酰丁香酮As的30ml感菌液將收集的菌體制成懸浮液，此懸浮液倒入挑好的愈傷組織中，侵染5min，倒掉液體，將愈傷組織取出，置于無(wú)菌的含吸水紙的培養(yǎng)皿上瀝干30-40min，將愈傷組織置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25t:暗培養(yǎng)60小時(shí)；洗菌和抗生素篩選培養(yǎng)將愈傷組織從共培養(yǎng)培養(yǎng)基中取出，用無(wú)菌水清5次，每次不停的振蕩5min，再用含500mgL—1羧芐青霉素car的無(wú)菌水浸泡40-60min，最后置于無(wú)菌濾紙上瀝干2h，第一輪篩選將晾干的愈傷組織轉(zhuǎn)入含250mgL—1羧芐青霉素car和50mgL—1潮霉素Hyg的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行第一次選擇，30°C，光照培養(yǎng)14d;第二輪篩選將長(zhǎng)有抗性愈傷組織的初始愈傷組織轉(zhuǎn)到含250mgL—1羧芐青霉素car和80mgL—1潮霉素Hyg的選擇培養(yǎng)基上，3(TC，光照培養(yǎng)10d然后轉(zhuǎn)移到組培室中培養(yǎng)4d;抗性愈傷組織的誘導(dǎo)分化和生根挑取顏色鮮黃的抗性愈傷組織移入裝有分化培養(yǎng)基的分化灌中，放入恒溫培養(yǎng)室中，組培室培養(yǎng)條件為24-30°C，14h光/8h暗，待苗長(zhǎng)至5cm，放入生根培養(yǎng)基中壯苗；剪取并收集待檢測(cè)苗1cm長(zhǎng)的新鮮綠色葉片，平放于含潮霉素80mgL—1培養(yǎng)基上，3(TC，16h/8h光/暗培養(yǎng)48h葉片依舊保持鮮綠的即為陽(yáng)性植株，而陰性幼苗的葉片出現(xiàn)塊狀壞死，通過(guò)潮霉素篩選得到陽(yáng)性TO植株；TO代種子發(fā)芽后得到Tl代轉(zhuǎn)基因苗，提取轉(zhuǎn)基因1\代苗不同株系的根部和葉片的總RNA，反轉(zhuǎn)錄總cDNA，采用引物AK101191，F(xiàn):5'-ATATTGTCAGATGCAGGGCTAG-3'，R:5'-TCCTACTTGATCTCATTTCCC-3'進(jìn)行半定量PCR鑒定，結(jié)果具有495bp條帶的，即為得到的穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因株系。有益效果1、通過(guò)系統(tǒng)研究，首次提供了水稻生長(zhǎng)素運(yùn)輸?shù)鞍谆?sPIN2的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)超表達(dá)植株具有更強(qiáng)大的根系與分蘗能力(圖6)。2、利用特異引物研究0sPIN2在水稻中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)0sPIN2只在根部表達(dá)(圖1)，將OsPIN2超表達(dá)后提高了氮素利用效率(表1)。3、OsPIN2超表達(dá)后增大了水稻的分蘗數(shù)目與分蘗角度，有利于改善水稻株型使產(chǎn)量得到提高(表1)。Reed等(1998)研究發(fā)現(xiàn)，地上部產(chǎn)生的IAA向根中的運(yùn)輸對(duì)于側(cè)根的生長(zhǎng)具有重要作用。利用特異引物發(fā)現(xiàn)0sPIN2只在根部表達(dá)，在葉片中不表達(dá)或表達(dá)量很低(圖l)。通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段獲得的OsPIN2超表達(dá)材料使得OsPIN2不僅在根系表大量增加并且在葉片中也發(fā)生表達(dá)(圖2)，由此使水稻植株體內(nèi)生長(zhǎng)素的運(yùn)輸分配發(fā)生變化，轉(zhuǎn)基因材料(08)獲得了更強(qiáng)大的根系(圖6)，有利于水稻對(duì)養(yǎng)分尤其是氮素的吸收和利用，提高氮素利用效率。此外，轉(zhuǎn)基因材料(08)平均分蘗數(shù)為53，與野生型相比分蘗數(shù)提高60%(表l);分蘗角度也比野生型增大(圖3)。分蘗力和分蘗角度是影響水稻株型的兩個(gè)最重要的因素。其中莖蘗數(shù)的多少，決定了葉面積指數(shù)、穗數(shù)及單株有效穗；分蘗角度，影響到株內(nèi)和株間對(duì)光、氣等條件的競(jìng)爭(zhēng)，對(duì)水稻的產(chǎn)量、抗性等也具有一定的影響。本發(fā)明公開(kāi)的0sPIN2超表達(dá)材料(08)與野生相比產(chǎn)量提高25%(表l)，有可能是由于0sPIN2在地上地下部超表達(dá)使水稻株型得到一定改善，從而使產(chǎn)量得到提高。圖1:0sPIN2在水稻不同部位(葉片，根)表達(dá)特征。l:葉片2:根圖2:T2代0sPIN2超表達(dá)材料(08、013、014)的分子鑒定，三個(gè)超表達(dá)株系(08、013、014)不僅在根部0sPIN2表達(dá)量比野生型強(qiáng)，而且在葉片中也獲得了0sPIN2的表達(dá)。圖3:T2代0sPIN2超表達(dá)材料(08)與野生型(日本晴)相比分蘗角度增大。圖4:T2代0sPIN2超表達(dá)材料(08)與野生型(日本晴)相比分蘗數(shù)目提高，相對(duì)于野生型分蘗數(shù)目增大60%。圖5:T2代0sPIN2超表達(dá)材料(08)與野生型(日本晴)相比產(chǎn)量提高25%，左側(cè)是單株T2代0sPIN2超表達(dá)材料收獲得到的種子，右側(cè)是同時(shí)種植的日本晴野生型單株收獲的種子。圖6:T2代0sPIN2超表達(dá)材料與野生型(日本晴)，從左至右依次為日本晴野生型、0sPIN2超表達(dá)材料(08)的三株苗(種子收獲后)。具體實(shí)施例方式(—)0sPIN2基因(登錄號(hào)為AK101191)在水稻中表達(dá)特征1)總RNA的提取水稻日本晴種子經(jīng)質(zhì)量比30%NaClO消毒，催芽，培養(yǎng)到二葉一心時(shí)，挑選出大小一致的水稻植株，去掉胚乳后移栽至pH5.5的1/2國(guó)際水稻所IRRI營(yíng)養(yǎng)液中，四葉一心時(shí)換為國(guó)際水稻所IRRI全營(yíng)養(yǎng)液(MaoDR.Themethodsofplantnutritionresearch.Beijing:BeijingAgriculturalUniversityPress,1994.)，培養(yǎng)一周后，取根及葉片迅速置于液氮中冷凍保存，稱(chēng)取O.lg左右樣品，用液氮研碎，研磨充分加入1.5ml離心管，迅速加入lmlTrizol試劑，加入0.2mL氯仿，離心后吸取上清，加入0.5mL異丙醇，離心后棄上清，加入70%乙醇洗滌沉淀，RNA溶于DEPC水中(體積比為1%。)，用質(zhì)量比為1.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，并用分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度和純度；2)總cDNA合成每個(gè)RNA樣品2iig，加入50iimolL—1OligodT18，加1%。DEPC水補(bǔ)足lOiiL，70。C下水浴5min，冰上放置5min后，依次加入RNaseinhibitor0.5yL和5xRTbuffer5iiL，10mMdNTP2.5iiL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1iiL，1%。DEPC水補(bǔ)足25iiL，42。C水浴60min后，7(TC水浴10min終止反應(yīng)(01igodT18由南京金思瑞公司合成；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas公司，Canada)。3)半定量PCR反合成總cDNA第一鏈后，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20iiL，包含10pmolL—'正反向引物各liiL，10xPCRbuffer2iiL，2.5mMdNTPl.6iiL，Taq酶O.4iiL，然后用滅菌水補(bǔ)足20iiL(引物由南京金思瑞公司合成；PCR試劑購(gòu)自Takara公司，大連)。加模板量因其濃度不同而不同，由內(nèi)參基因水稻細(xì)胞骨架蛋白基因(OsActin)的量來(lái)校正，基因OsActin與OsPIN2的PCR程序如下94"C預(yù)變性4min，94"C變性30s，55°C復(fù)性30s，72。C延伸30s，30個(gè)循環(huán)后，72。C7min，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物通過(guò)質(zhì)量比為1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。通過(guò)澳化乙淀(EB)染色后，在凝膠成像系統(tǒng)成像。基因的序列號(hào)和引物設(shè)計(jì)如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*:參考文獻(xiàn)，XiaorongFan，Lij皿Jia，YilinLi，SusanJ.Smith,AnthonyJMillerandQirongShen，2007Comparingnitratestorageandremobilizationintworicecultivarsthatdifferintheirnitrogenuseefficiency，JournalofExperimentalBotany58(7):1729-40通過(guò)對(duì)該基因在水稻不同部位(葉片，根)進(jìn)行表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)0sPIN2只在根中表達(dá)，而在葉片中不表達(dá)或表達(dá)量很低(圖1)。(二)0sPIN2基因的超量表達(dá)植株1)0sPIN2基因的cDNA全長(zhǎng)的獲得用以上獲得的水稻日本晴總cDNA為模板，設(shè)計(jì)PCR引物，其PCR產(chǎn)物包含完整的0sPIN2閱讀框(從起始密碼子ATG至3'端非編碼區(qū))，引物序列為PIN2-F:5'-ATGATCACCGGACGCGACATC-3，；PIN2-R:5'-GGAATCTTTAGTACCGCCAACCC-3'PCR程序如下94t:預(yù)變性4min，98t:變性10s，68"C復(fù)性延伸2min，30個(gè)循環(huán)后，72°C10min，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其大小為2203bp片段，將目的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分離后切膠回收，將回收的片段與pMD-19載體連接，酶連體系總體積10iiL，包含5iiL連接液，1yL的pMD-19載體，3_4yL的PCR純化產(chǎn)物，用水補(bǔ)足10yL，然后16t:連接過(guò)夜；再轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞(SmithRL，BanksJL，SnavelyMDandMaguireME.SequenceandtopologyoftheCorAmagnesiumtransportsystemsofSalmonellatyphimuri咖andEscherichiacoli.Identificationofanewclassoftransportprotein.JBiolChem.1993,268(19):14071-80.)，涂在含有安節(jié)100iigmL—1的LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)12h-14h后，挑取陽(yáng)性菌落進(jìn)行DNA測(cè)序，0sPIN基因在NCBI網(wǎng)站(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)登錄號(hào)為AK101191,，0sPIN2的cDNA全長(zhǎng)序列包括開(kāi)放閱讀框(0RF)1896bp及3'端非編碼區(qū)UTR307bp;將測(cè)序正確的菌液加入等體積30X甘油于-7(TC保存?zhèn)溆茫@得含有目的基因0sPIN2cDNA全長(zhǎng)序列的重組質(zhì)粒，命名為pPIN2inT;2)超量表達(dá)載體pUbi-PIN2的構(gòu)建根據(jù)水稻生長(zhǎng)素運(yùn)輸?shù)鞍谆?sPIN2的cDNA序列，設(shè)計(jì)PCR引物，其PCR產(chǎn)物包含完整的0sPIN2閱讀框(從起始密碼子ATG至終止密碼TAG)，并在上游和下游引物上分別引入限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)BamHI，引物序列為overPIN2-F:5'CTGAGGATCCATGATCACCGGACGCGACATC-3'(BamHI」overPIN2-R:5'-GTCAGGATCCCTATATCCCAAGAAGCACATAGT_3，(BamHIJ用以上獲得的pPIN2inT質(zhì)粒為模板，PCR程序如下94。C預(yù)變性4min，98t:變性10s，68t:復(fù)性延伸2min，30個(gè)循環(huán)后，72t:10min，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物大小為2200bp。將目的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分離后，切膠回收(凝膠回收試劑盒購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司)，回收產(chǎn)物用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI(Takara公司，大連)進(jìn)行單酶切。將過(guò)量表達(dá)載體pCAMBIA1390-ubi質(zhì)粒(ChenTL，LinYL，LeeYL，YangNSChanMT.Expressionofbioactivehumaninterferon—gammaintransgenicricecellsuspensioncultures.TransgenicResearch.2004，13:499-510)用BamHI(Promega公司)進(jìn)行單酶切。然后分別回收酶切后的PCR片段和過(guò)量表達(dá)載體，將載體進(jìn)行去磷酸化后(去磷酸化酶購(gòu)自Takara公司)再次回收。回收后通過(guò)T4連接酶(Promega公司)將線(xiàn)性化的載體與酶切過(guò)的PCR片段在4t:下連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，涂在含有卡那霉素(50iigmL—0的LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)12h后，挑取陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒經(jīng)BamHI酶切驗(yàn)證片段大小無(wú)誤后，并經(jīng)過(guò)BglII(Takara公司)單酶切找出以正向連入表達(dá)載體的克隆，將該菌液送南京金思瑞科技有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序，將測(cè)序正確的克隆菌液加入等體積30%甘油于_701:保存，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒命名為pUbi-PIN2。最后通過(guò)電擊法將pUbi-PIN2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105(XuM，ZhuL，ShouHandWuP.APINlfamilygene，0sPIN1，involvedinauxin—dependentadventitiousrootemergenceandtilleringinrice.PlantCellPhysiol.20050ct，46(10):1674-81.)的感受態(tài)細(xì)胞中，涂在含有卡那霉素和鏈霉素(均為50ugmL—0的YEP固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)48h后，挑取陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒，經(jīng)BamHI單酶切驗(yàn)證無(wú)誤后，菌液加入等體積30%甘油于-7(TC保存，轉(zhuǎn)基因備用。3)轉(zhuǎn)基因植株的獲得為了避免轉(zhuǎn)基因過(guò)程產(chǎn)生的植物細(xì)胞質(zhì)基因突變，我們進(jìn)行了不同批次的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)。分別于2006年12月-2007年2月和2007年12月-2008年2月將以上獲得的轉(zhuǎn)有pUbi-PIN2質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，侵染水稻愈傷組織，共培養(yǎng)3天，經(jīng)過(guò)抗性愈傷組織的選擇培養(yǎng)、分化、生根、煉苗得到不同年份不同批次的TO代轉(zhuǎn)基因植株。為了避免植株性狀的改變是由于非基因組插入導(dǎo)致的細(xì)胞質(zhì)嵌合體造成的，我們?cè)趯?duì)所有轉(zhuǎn)基因材料都進(jìn)行了兩次擴(kuò)繁，得到了穩(wěn)定遺傳的Tl代和T2代材料，并對(duì)穩(wěn)定遺傳的T2代材料進(jìn)行的生理測(cè)定。3.1)試劑和溶液縮寫(xiě)本發(fā)明中培養(yǎng)基所用到的英文所寫(xiě)縮寫(xiě)表示如下6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-節(jié)基腺嘌呤);Car(Carbenicillin，羧節(jié)青霉素);NAA(N即thaleneaceticacid，萘乙酸);IAA(Indole-3-aceticacid，口引哚乙酸);2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyaceticacid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(CaseinEnzymaticHydrolysate，水解酪蛋白);L-pro(L-脯氨酸);L-Glu(L-谷氨酰胺);MES(2-(N-Morpholino)EthaneSulfonicAcid);N6(N6大量元素成份溶液)；B5(B5微量元素成份溶液)；AA(AA大量元素成份)。3.2)溶液與培養(yǎng)基配方1)N6培養(yǎng)基母液每升含量(20倍)_56.6g3.32g(相當(dāng)于CaCl22.506g)2.70g8.0g9.26g_2)B5微量母液每升含量(100倍)_KIH3B03MnS04H20ZnS047H20Na2Mo042H20CuS045H20CoCl26H20_3)有機(jī)母液_煙酸(Nicotinicacid)[OOSe]鹽酸吡卩多醇(VB6)鹽酸硫胺素(VB》肌醇(myo-Inositol)L0067J訓(xùn)3CaCl22H20MgS047H20KH2P04(NH4)2S040.0750g0.30gl.Og0.2g0.025g0.0025g0.0025glmg/mllmg/ml10mg/ml10mg/ml4)鐵鹽(100倍):_<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>5)AA大量元素母液(每升含量)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>6)誘導(dǎo)愈傷組織與繼代培養(yǎng)基(每升含量)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>7)水稻愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)培養(yǎng)基(每升含量)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>8)抗性愈傷組織選擇培養(yǎng)基(每升含量)N6大量元素50w/B5微量飾/:衡/煙酸7附/鹽酸吡眵醇鹽酸硫胺素-7附/肌醇廳/L-Glu:(UgL-pro:CH:Sm/麥芽糖/蔗糖聊Phytagel:,PH值滅菌后(55'C)再加第一輪選擇-Car(羧芐青霉素)Hgy(潮霉素)，附g/Z第二輪選擇Car(羧芐青霉素)Hgy(潮霉素)，附g/丄柳mg/X第三輪選擇Car(羧芐青霉素)Hgy(潮霉素)SO附g/Z9)分化培養(yǎng)基配方(每升含量)N6大量元素衡/B5微量涵/錄撲.煙酸j/鹽酸吡哆醇7//鹽酸硫胺素肌醇脂/L-Glu:0.5gL陽(yáng)pro:CH:6-BA:附/NAA蔗糖聊AgarPH值10)生根培養(yǎng)基配方(每升含量)N6大量元素B5微量5附/姊外-5附/煙酸鹽酸吡眵醇鹽酸硫胺素肌醇蔗糖聊agar:&0g11)感菌液配方(每升含量)AA大量元素B5微量衡/鐵鹽衡/煙酸鹽酸吡眵醇7附/鹽酸硫胺素肌醇脂/MES:"gCH:麥芽糖聊PH值55'C時(shí)加As至終濃度為2WpM12)農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的YEP液體培養(yǎng)基配方(每升含量)_酵母提取物10g蛋白胨10gNaCl5gpH7.0_3.3)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)愈傷組織去皮的水稻種子(一盤(pán)14粒)入三角瓶，用70%乙醇浸泡lmin(淹沒(méi)種子)，倒掉70%乙醇，用30%次氯酸鈉浸泡30min，然后用滅菌水清洗5_6次直至清亮。用鑷子把種子撥到滅菌的濾紙上，吸干水分，最后把種子置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在30。C光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)20-30d。繼代培養(yǎng)選擇小米粒大小的黃色有韌性的脫落下來(lái)的愈傷組織，用滅菌的鑷子轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基生長(zhǎng)7-14d。農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備挑取轉(zhuǎn)有pUbi-PIN2質(zhì)粒的農(nóng)桿菌EHA105原液20iiL，接種于5ml含50mgL—1鏈霉素和50mgL—1卡那霉素的YEP(Sambrook，etal.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.2001)液體培養(yǎng)基中，2『C振蕩過(guò)夜。取活化菌液500L，接種于5ml含相同抗生素新鮮的YEP培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至菌液在600nm波長(zhǎng)處的吸光值(0D600)0.8_1.0。侵染愈傷組織和共培養(yǎng)將水稻愈傷組織從繼代培養(yǎng)基中挑出放入離心管中，愈傷組織的數(shù)量量沒(méi)過(guò)50ml離心管錐形部位即可(選擇淡黃圓潤(rùn)有韌性的愈傷組織)。取培養(yǎng)好的菌液1ml于1.5ml離心管中，4。C，5000rpm，離心lmin，去上清。用含200iimolL—1乙酰丁香酮(As)的30ml感菌液將收集的菌體制成懸浮液，此懸浮液倒入挑好的愈傷組織中，侵染5min。倒掉液體，將愈傷組織取出，置于無(wú)菌的含吸水紙的培養(yǎng)皿上瀝干30-40min。將愈傷組織置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上(上面墊上一層9cm無(wú)菌濾紙)，25t:暗培養(yǎng)60小時(shí)。洗菌和抗生素篩選培養(yǎng)將愈傷組織從共培養(yǎng)培養(yǎng)基中取出，用無(wú)菌水清5次，每次不停的振蕩5min。再用含500mgL—工羧芐青霉素(car)的無(wú)菌水浸泡40-60min。最后置于無(wú)菌濾紙上瀝干2h。第一輪篩選將晾干的愈傷組織轉(zhuǎn)入含250mgL—工羧芐青霉素(car)和50mgL—1潮霉素(Hyg)的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行第一次選擇，30°C，光照培養(yǎng)14d;第二輪篩選將長(zhǎng)有抗性愈傷組織的初始愈傷組織轉(zhuǎn)到含250mgL—1羧芐青霉素(car)和80mgL—1潮霉素(Hyg)的選擇培養(yǎng)基上，3(TC，光照培養(yǎng)10d然后轉(zhuǎn)移到組培室中培養(yǎng)4d?？剐杂鷤M織的誘導(dǎo)分化和生根挑取顏色鮮黃的抗性愈傷組織移入裝有分化培養(yǎng)基的分化灌中，放入恒溫培養(yǎng)室中，等待分化成苗(30d左右，組培室培養(yǎng)條件為24-30°C，14h光/8h暗)，待苗長(zhǎng)至5cm左右，放入生根培養(yǎng)基中壯苗。轉(zhuǎn)基因苗的鍛煉和移栽將苗根部和莖葉分化得較完好的試管挑出(苗長(zhǎng)至試管頂部，就要及時(shí)開(kāi)蓋)，打開(kāi)封口膜，加入適量無(wú)菌水(防止培養(yǎng)基長(zhǎng)菌)，煉苗3d至7d左右，然后洗去瓊脂，移栽到溫室進(jìn)行水培或土培生長(zhǎng)、檢測(cè)。3.4)潮霉素快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因幼苗得到TO代植株剪取并收集待檢測(cè)苗lcm左右長(zhǎng)的新鮮綠色葉片(兩端均留有切口)，平放于含潮霉素(80mgL—1)培養(yǎng)基上，3(TC，16h/8h(光/暗)培養(yǎng)48h葉片依舊保持鮮綠的即為陽(yáng)性植株，而陰性幼苗的葉片出現(xiàn)塊狀壞死(鄭曄.水稻高效轉(zhuǎn)基因體系的建立及其應(yīng)用.2008)。通過(guò)潮霉素篩選得到陽(yáng)性TO植株120個(gè)株系。2007年4月到11月和2008年4月到11月南京農(nóng)業(yè)大學(xué)牌樓溫網(wǎng)室進(jìn)行對(duì)超表達(dá)材料的種植得到TO代種子。3.5)OsPIN2超表達(dá)株系的分子鑒定TO代種子發(fā)芽后得到Tl代轉(zhuǎn)基因苗，提取轉(zhuǎn)基因1\代苗不同株系的根部和葉片的總RNA，反轉(zhuǎn)錄總cDNA，進(jìn)行半定量鑒定(總RNA的提取，總cDNA的合成，半定量PCR方法同"0sPIN2基因在水稻中表達(dá)特征")，得到穩(wěn)定遺傳的08、013、014轉(zhuǎn)基因株系(圖2)。3.6)超表達(dá)株系的擴(kuò)繁及生理測(cè)定2008年4月到11月和2009年4月到11月南京農(nóng)業(yè)大學(xué)牌樓溫網(wǎng)室進(jìn)行對(duì)超表達(dá)材料的擴(kuò)繁，得到植株性狀穩(wěn)定遺傳的T2代材料。觀察Tl代和T2代轉(zhuǎn)基因水稻與野生型水稻的生長(zhǎng)差異。從表1可以看出0sPIN2超表達(dá)材料比野生型產(chǎn)量提高29%，氮素吸收量比野生型高5倍。表1.T2代0sPIN2超表達(dá)材料(08)與野生型表型差異表型08WT單株分蘗數(shù)60a26b單株產(chǎn)量(g)28.8a22.3b植株總氮(mg)948.7a189.3b注釋a，b為極顯著差異綜上所述，本發(fā)明人提供的0sPIN2基因是首次在水稻中驗(yàn)證其生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)它參與生長(zhǎng)素運(yùn)輸，影響水稻分蘗角度。該基因在水稻中過(guò)量表達(dá)可以增大水稻根系、分蘗數(shù)量、分蘗角度、氮素利用效率和最終水稻產(chǎn)量。可利用本發(fā)明0sPIN2基因作為目的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，其中可用任何一種啟動(dòng)子例如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子、Ubiquitin啟動(dòng)子或其它啟動(dòng)子，該表達(dá)載體中必要時(shí)可包括增強(qiáng)子，不論是轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或翻譯增強(qiáng)子。為了簡(jiǎn)化轉(zhuǎn)化細(xì)胞的鑒定可使用選擇性標(biāo)記包括對(duì)抗生素抗性的酶，也可利用顏色變化(例如B-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或發(fā)光(例如熒光素酶)來(lái)識(shí)別的化合物的酶類(lèi)，也可用無(wú)標(biāo)記選擇。所用的表達(dá)載體可使用Ti質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒，植物病毒載體等。轉(zhuǎn)化方法可用經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、花粉管通道法或其它方法轉(zhuǎn)化植物。本發(fā)明中應(yīng)用的0sPIN2基因來(lái)自水稻，具有適合于水稻等單子葉植物表達(dá)的優(yōu)化密碼子，該基因除了可應(yīng)用于雙子葉植物，如大豆、棉花、煙草等，更加適合于水稻、玉米、小麥等單子葉植物。序列表〈110〉南京農(nóng)業(yè)大學(xué)〈120〉水稻生長(zhǎng)素運(yùn)輸?shù)鞍谆騉sPIN2的基因工程應(yīng)用〈130〉說(shuō)明書(shū)〈160>6〈170>PatentInversion3.1〈210>1〈211>22〈212>DNA〈213〉人工〈220〉:0155]:0156]:0157]:0158]〈221〉0sPIN2半定量F〈222〉(1).(22)〈223〉<400>1:0159]atattgtcagatgcagggctag:0160]〈210>2:0161]〈211>21:0162]〈212>DNA:0163]〈213〉人工:0164]〈220〉:0165]〈221〉OsPIN2半定量R:0166]〈222>(1).(21):0167]〈223〉:0168]〈400>2:0169]tcctacttgatctcatttccc21:0170]〈210>3:0171]<211>21:0172]〈212>DNA:0173]〈213>人工合成:0174]〈220〉:0175]〈221>PIN2-F:0176]〈222〉(1)(21):0177]〈223〉:0178]〈400>3:0179]atgatcaccggacgcgacatc21:0180]〈210>4:0181]〈211>23:0182]〈212>DNA:0183]〈213>人工合成<220>〈221>PIN2-R〈222〉(1)(23)〈223〉〈400>4ggaatctttagtaccgccaaccc23〈210>5〈211>31〈212>DNA〈213〉人工〈220〉〈221>overPIN2-F〈222>(1)..(31)〈223〉〈400>5ctgaggatccatgatcaccggacgcgacstc<210>6〈211>31〈212>DNA〈213〉人工<220>〈221>overPIN2-R〈222>(1)..(31)〈223〉<400〉6gtcaggatcctcctacttgatctcatttccc權(quán)利要求水稻生長(zhǎng)素運(yùn)輸?shù)鞍谆騉sPIN2的基因工程應(yīng)用。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的水稻生長(zhǎng)素運(yùn)輸?shù)鞍谆?sPIN2的基因工程應(yīng)用，其特征在于該基因在調(diào)節(jié)作物根系發(fā)育，分蘗數(shù)目、分蘗角度，提高氮肥利用效率及最終產(chǎn)量方面的應(yīng)用。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的水稻生長(zhǎng)素運(yùn)輸?shù)鞍谆?sPIN2的基因工程應(yīng)用，其特征在于1)總RNA的提取水稻日本晴種子經(jīng)質(zhì)量比30%NaClO消毒，催芽，培養(yǎng)到二葉一心時(shí)，挑選出大小一致的水稻植株，去掉胚乳后移栽至pH5.5的1/2國(guó)際水稻所IRRI營(yíng)養(yǎng)液中，四葉一心時(shí)換為國(guó)際水稻所IRRI全營(yíng)養(yǎng)液，培養(yǎng)一周后，取根及葉片迅速置于液氮中冷凍保存，稱(chēng)取0.lg樣品，用液氮研碎，研磨充分加入1.5ml離心管，迅速加入lmlTrizol試劑，加入0.2mL氯仿，離心后吸取上清，加入0.5mL異丙醇，離心后棄上清，加入70%乙醇洗滌沉淀，RNA溶于DEPC水中(體積比為1%。)，用質(zhì)量比為1.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，并用分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度和純度；2)總cDNA合成每個(gè)RNA樣品2yg，加入50ymolL—1OligodT18，加1%。DEPC水補(bǔ)足10iiL，70。C下水浴5min，冰上放置5min后，依次加入RNaseinhibitor0.5iiL和5xRTbuffer5iiL，10mMdNTP2.5iiL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1iiL，1%。DEPC水補(bǔ)足25iiL，42"C水浴60min后，7(TC水浴10min終止反應(yīng)；3)0sPIN2基因的cDNA全長(zhǎng)的獲得用以上獲得的水稻日本晴總cDNA為模板，設(shè)計(jì)PCR引物，其PCR產(chǎn)物包含完整的0sPIN2閱讀框，引物序列為PIN2-F:5，-ATGATCACCGGACGCGACATC-3，；PIN2-R:5'-GGAATCTTTAGTACCGCCAACCC-3'PCR程序如下94t:預(yù)變性4min，98t:變性10s，68t:復(fù)性延伸2min，30個(gè)循環(huán)后，72°C10min，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其大小為2203bp片段，將目的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分離后切膠回收，將回收的片段與pMD-19載體連接，酶連體系總體積10iiL，包含5iiL連接液，1yL的pMD-19載體，3_4yL的PCR純化產(chǎn)物，用水補(bǔ)足10yL，然后16t:連接過(guò)夜；再轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中涂在含有安芐100i！gmL—1的LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)12h-14h后，挑取陽(yáng)性菌落進(jìn)行DNA測(cè)序，0sPIN2基因登錄號(hào)為AK101191，0sPIN2的cDNA全長(zhǎng)序列包括開(kāi)放閱讀框ORF1896bp及3'端非編碼區(qū)UTR307bp;將測(cè)序正確的菌液加入等體積30%甘油于_701:保存?zhèn)溆?，獲得含有目的基因0sPIN2cDNA全長(zhǎng)序列的重組質(zhì)粒，命名為pPIN2inT;4)超量表達(dá)載體pUbi-PIN2的構(gòu)建根據(jù)水稻生長(zhǎng)素運(yùn)輸?shù)鞍谆?sPIN2的cDNA序列，設(shè)計(jì)PCR引物，其PCR產(chǎn)物包含完整的0sPIN2閱讀框，并在上游和下游引物上分別引入限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)BamHI，引物序列為overPIN2-F:5'-CTGAGGATCCATGATCACCGGACGCGACATC-3'BamHIoverPIN2-R:5'-GTCAGGATCCCTATATCCCAAGAAGCACATAGT_3，BamHI用以上獲得的pPIN2inT質(zhì)粒為模板，PCR程序如下94。C預(yù)變性4min，98t:變性10s，68t:復(fù)性延伸2min，30個(gè)循環(huán)后，72t:10min，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物大小為2200bp，將目的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分離后切膠回收，回收產(chǎn)物用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI進(jìn)行單酶切，同時(shí)用BamHI單酶切植物過(guò)量表達(dá)載體pCAMBIA1390-ubi質(zhì)粒，然后分別回收酶切過(guò)的PCR片段和載體，將載體進(jìn)行去磷酸化后再次回收；回收后通過(guò)T4連接酶將線(xiàn)性化的載體與酶切過(guò)的PCR片段在4°C下連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，涂在含有卡那霉素50iigmL—1的LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)12h后，挑取陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒經(jīng)BamHI酶切驗(yàn)證片段大小無(wú)誤后，并經(jīng)過(guò)BglII單酶切找出以正向連入表達(dá)載體的克隆，將該菌液進(jìn)行DNA測(cè)序，將含有測(cè)序正確克隆的菌液加入等體積30X甘油于-7(TC保存，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒命名為pUbi-PIN2;最后通過(guò)電擊法將pUbi-PIN2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌EHA105的感受態(tài)細(xì)胞中，涂在含有卡那霉素和鏈霉素均為50iigmL—1的YEP固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)48h后，挑取陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒，經(jīng)BamHl單酶切驗(yàn)證無(wú)誤后，菌液加入等體積30%甘油于-70°0保存，轉(zhuǎn)基因備用；5)轉(zhuǎn)基因植株的獲得侵染愈傷組織和共培養(yǎng)將水稻愈傷組織從繼代培養(yǎng)基中挑出放入離心管中，取培養(yǎng)好的菌液lml于1.5ml離心管中，4。C，5000rpm，離心lmin，去上清，用含200iimolL—1乙酰丁香酮As的30ml感菌液將收集的菌體制成懸浮液，此懸浮液倒入挑好的愈傷組織中，侵染5min，倒掉液體，將愈傷組織取出，置于無(wú)菌的含吸水紙的培養(yǎng)皿上瀝干30-40min，將愈傷組織置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25t:暗培養(yǎng)60小時(shí)；洗菌和抗生素篩選培養(yǎng)將愈傷組織從共培養(yǎng)培養(yǎng)基中取出，用無(wú)菌水清5次，每次不停的振蕩5min，再用含500mgL—1羧芐青霉素car的無(wú)菌水浸泡40-60min，最后置于無(wú)菌濾紙上瀝干2h，第一輪篩選將晾干的愈傷組織轉(zhuǎn)入含250mgL—1羧芐青霉素car和50mgL—1潮霉素Hyg的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行第一次選擇，30°C，光照培養(yǎng)14d;第二輪篩選將長(zhǎng)有抗性愈傷組織的初始愈傷組織轉(zhuǎn)到含250mgL—1羧芐青霉素car和80mgL—1潮霉素Hyg的選擇培養(yǎng)基上，3(TC，光照培養(yǎng)10d然后轉(zhuǎn)移到組培室中培養(yǎng)4d;抗性愈傷組織的誘導(dǎo)分化和生根挑取顏色鮮黃的抗性愈傷組織移入裝有分化培養(yǎng)基的分化灌中，放入恒溫培養(yǎng)室中，組培室培養(yǎng)條件為24-30°C，14h光/8h暗，待苗長(zhǎng)至5cm，放入生根培養(yǎng)基中壯苗；剪取并收集待檢測(cè)苗1cm長(zhǎng)的新鮮綠色葉片，平放于含潮霉素80mgL—1培養(yǎng)基上，30°C，16h/8h光/暗培養(yǎng)48h葉片依舊保持鮮綠的即為陽(yáng)性植株，而陰性幼苗的葉片出現(xiàn)塊狀壞死，通過(guò)潮霉素篩選得到陽(yáng)性TO植株；TO代種子發(fā)芽后得到Tl代轉(zhuǎn)基因苗，提取轉(zhuǎn)基因1\代苗不同株系的根部和葉片的總RNA，反轉(zhuǎn)錄總cDNA，采用引物AK101191，F(xiàn):5'-ATATTGTCAGATGCAGGGCTAG-3'，R:5'-TCCTACTTGATCTCATTTCCC-3'進(jìn)行半定量PCR鑒定，結(jié)果具有495bp條帶的，即為得到的穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因株系。4.權(quán)利要求3所述應(yīng)用獲得的含有目的基因0sPIN2cDNA全長(zhǎng)序列的重組質(zhì)粒pUbi-PIN2。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了水稻生長(zhǎng)素運(yùn)輸?shù)鞍谆騉sPIN2的基因工程應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。水稻生長(zhǎng)素運(yùn)輸?shù)鞍谆騉sPIN2的核苷酸序列及其表達(dá)OsPIN2蛋白氨基酸序列在NCBI網(wǎng)站(www.ncbi.nlm.nih.gov/)登錄號(hào)為AK101191。該基因的工程應(yīng)用為水稻中的首次報(bào)道，參與水稻生長(zhǎng)素的運(yùn)輸，增大水稻根系、分蘗數(shù)、分蘗角度、氮素利用效率以及最終產(chǎn)量。文檔編號(hào)A01H4/00GK101736014SQ20101001829公開(kāi)日2010年6月16日申請(qǐng)日期2010年1月22日優(yōu)先權(quán)日2010年1月22日發(fā)明者張亞麗,徐國(guó)華,范曉榮,陳贏男申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)