專利名稱：利用原生質(zhì)體再生技術(shù)進行食用菌菌種復(fù)壯和脫毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細胞工程范疇，具體的說是一種利用原生質(zhì)體再生技術(shù)進行食用菌菌
種復(fù)壯和脫毒的方法。
背景技術(shù)：
目前，我國栽培的食用菌品種多是通過自然選育的，許多食用菌的性狀不穩(wěn)定，而且容易退化、老化，使得這些食用菌品種的優(yōu)質(zhì)性狀很難長久保持，且更易受到病毒病的危害。因此，目前迫切需要一種新的食用菌復(fù)壯和脫毒技術(shù)，不但使食用菌保持其優(yōu)質(zhì)性狀，而且恢復(fù)較好的抗病毒能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在解決背景技術(shù)存在的上述問題，而提供一種利用原生質(zhì)體再生技術(shù)進行食用菌菌種復(fù)壯和脫毒的方法，包括以直接去除細胞壁進而達到去除細胞抑制因子，實現(xiàn)細胞活力恢復(fù)的原生質(zhì)體制備方法；從大量的原生質(zhì)體細胞中篩選出細胞活性最強的菌株的原生質(zhì)體再生方法。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種利用原生質(zhì)體再生技術(shù)進行食用菌菌種復(fù)壯和脫
毒的方法，按如下步驟進行 A.親本選擇 易退化和感染病毒病的常年栽培的食用菌品種，其退化菌株癥狀為菌絲生長緩慢無力，稀疏或成束，發(fā)育不均勻，菌絲發(fā)黃，菌種內(nèi)出現(xiàn)雜色斑點或不規(guī)則形的顆粒狀物；其病毒病癥狀為菌柄膨大呈近球形或燒瓶形，不形成菌蓋或只形成很小的菌蓋；
B.原生質(zhì)體制備 a.選擇氯化鈉、甘露醇、硫酸鎂、蔗糖為穩(wěn)滲劑溶質(zhì)，優(yōu)選甘露醇；b.選擇穩(wěn)滲劑濃度為:0. 5mol/L、0. 6mol/L、0. 7mol/L或0. 8mol/L，優(yōu)選0. 6mo1/
L ; C.選擇蝸牛酶、幾丁質(zhì)酶、纖維素酶或溶壁酶為細胞壁降解酶，優(yōu)選溶壁酶； d.選擇降解酶的濃度為1%、1.5%、2%、2. 5%，優(yōu)先選擇2% ;
e.選擇酶解時間為0. 5h 3. 5h，優(yōu)選2. 5h ;
f.選擇酶解溫度為30°C 40。C ，優(yōu)選35。C ;
C.原生質(zhì)體再生 a.選擇PSA、 SPA、 MDYA液體培養(yǎng)基為預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基，優(yōu)選PSA ; b.培養(yǎng)方法采用液體轉(zhuǎn)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)法或者直接固體培養(yǎng)，優(yōu)選液體轉(zhuǎn)固體
培養(yǎng)基培養(yǎng)法； D.建立食用菌復(fù)壯和脫毒菌株的評定標(biāo)準(zhǔn) 以原生質(zhì)體再生菌株與未處理菌株的生長、發(fā)育和病毒攜帶率的比較，建立包括食用菌處理前和處理后在菌絲生長速度、出菇時間、產(chǎn)量、品質(zhì)和病毒檢出率比對的食用菌
3復(fù)壯和脫毒菌株的評定標(biāo)準(zhǔn)。 本發(fā)明所述原生質(zhì)體制備步驟中穩(wěn)滲劑溶質(zhì)優(yōu)選甘露醇，目的在于原生質(zhì)體的 得率較高，且再生率較高；穩(wěn)滲劑濃度優(yōu)選0. 6mol/L，目的在于此濃度最適于原生質(zhì)體的 釋放和保存；細胞壁降解酶優(yōu)選溶壁酶，目的在于獲得最高的原生質(zhì)體釋放；溶壁酶濃度 優(yōu)選2%，目的在于可以實現(xiàn)最優(yōu)的細胞壁降解；酶解時間優(yōu)選2. 5h，目的在于此時間原生 質(zhì)體達到了最大的釋放數(shù)量；酶解溫度優(yōu)選35t:，目的在于此溫度原生質(zhì)體達到了最大的 釋放數(shù)量。 本發(fā)明所述原生質(zhì)體再生步驟中預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基優(yōu)選PSA，目的在于獲得最優(yōu)的
再生率；培養(yǎng)方法優(yōu)選液體轉(zhuǎn)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)法，目的是獲得較高的再生率。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于 (1)建立了食用菌的原生質(zhì)體制備和再生技術(shù)體系。 (2)所獲得的再生菌株農(nóng)藝性狀優(yōu)良，以平菇89為代表，經(jīng)過試驗和區(qū)試表明，它 具有以下特征 ①菌絲生長速度快，出菇時間早，原基形成時間早3-6天； ②高產(chǎn)，經(jīng)過原生質(zhì)體復(fù)壯和脫毒菌株其產(chǎn)量比原種P89等增產(chǎn)60-80% ; ③抗雜菌能力較強，遇毛霉，根霉，曲霉及青霉能與其競爭生長，并蓋過雜菌； 病毒檢出率低，病毒檢出率較復(fù)壯和脫毒前少約90% ; ⑤栽培基質(zhì)的利用率高，經(jīng)過原生質(zhì)體復(fù)壯和脫毒菌株基質(zhì)利用較快； ⑥子實體品質(zhì)高，活性成分含量高。
具體實施例方式以下介紹的是作為本發(fā)明內(nèi)容的具體實施例，并通過實施例對本發(fā)明的內(nèi)容作進 一步的闡述。當(dāng)然，這不應(yīng)該理解為本發(fā)明的前述主體范圍僅限于實施例。
實施例1 : 白靈菇白10原生質(zhì)體復(fù)壯和脫毒菌株，具體方法如下 1.親本選擇平菇89是生產(chǎn)上常年栽培的食用菌品種，但是易退化。退化菌絲生 長緩慢，稀疏或成束，發(fā)育不均勻，菌絲發(fā)黃，菌種內(nèi)出現(xiàn)雜色斑點或不規(guī)則形的顆粒狀物。 蘑菇產(chǎn)量降低，易感染病蟲害。
2.原生質(zhì)體制備 以O(shè). 6mol/L的甘露醇、2X的溶壁酶為細胞壁降解液，在35t:條件下處P89的液體 培養(yǎng)菌絲2. 5h，過濾、離心收集原生質(zhì)體，血小球計數(shù)板鏡檢原生質(zhì)體數(shù)目。
3.原生質(zhì)體再生 在PSA培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)原生質(zhì)體12h，然后再在PSA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直到有菌 落產(chǎn)生。 4.原生質(zhì)體再生菌株與未處理菌株的特征、性狀 平菇89復(fù)壯、脫毒后，經(jīng)過大田試驗表明，它具有以下特征 ①菌絲生長速度快，出菇時間早，原基形成時間早3-6天。 ②高產(chǎn)，經(jīng)過原生質(zhì)體復(fù)壯和脫毒菌株其產(chǎn)量比原種P89等增產(chǎn)60-80% 。 ③抗雜菌能力較強，遇毛霉，根霉，曲霉及青霉能與其競爭生長，并蓋過雜菌；
④病毒檢出率低，病毒檢出率較復(fù)壯和脫毒前少約90%。 ⑤栽培基質(zhì)的利用率高，經(jīng)過原生質(zhì)體復(fù)壯和脫毒菌株基質(zhì)利用較快。 ⑥子實體品質(zhì)高，活性成分含量高。 實施例2 : 用杏鮑菇代替實例1中的平菇89，其余操作步驟、方法、試劑種類和濃度與實施例
l相同，結(jié)果表明，復(fù)壯、和脫毒后，菌株的優(yōu)越性明顯。
實施例3 : 用白靈菇10代替實施例1中的平菇89，其余操作步驟、方法、試劑種類和濃度與實 施例1相同，結(jié)果表明，復(fù)壯、和脫毒后，菌株的優(yōu)越性明顯。
權(quán)利要求
一種利用原生質(zhì)體再生技術(shù)進行食用菌菌種復(fù)壯和脫毒的方法，按如下步驟進行A.親本選擇易退化和感染病毒病的常年栽培的食用菌品種，其退化菌株癥狀為菌絲生長緩慢無力，稀疏或成束，發(fā)育不均勻，菌絲發(fā)黃，菌種內(nèi)出現(xiàn)雜色斑點或不規(guī)則形的顆粒狀物；其病毒病癥狀為菌柄膨大呈近球形或燒瓶形，不形成菌蓋或只形成很小的菌蓋；B.原生質(zhì)體制備a.選擇氯化鈉、甘露醇、硫酸鎂、蔗糖為穩(wěn)滲劑溶質(zhì)，優(yōu)選甘露醇；b.選擇穩(wěn)滲劑濃度為0.5mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L或0.8mol/L，優(yōu)選0.6mol/L；c.選擇蝸牛酶、幾丁質(zhì)酶、纖維素酶或溶壁酶為細胞壁降解酶，優(yōu)選溶壁酶；d.選擇降解酶的濃度為1％、1.5％、2％、2.5％，優(yōu)先選擇2％；e.選擇酶解時間為0.5h～3.5h，優(yōu)選2.5h；f.選擇酶解溫度為30℃～40℃，優(yōu)選35℃；C.原生質(zhì)體再生a.選擇PSA、SPA、MDYA液體培養(yǎng)基為預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基，優(yōu)選PSA；b.培養(yǎng)方法采用液體轉(zhuǎn)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)法或者直接固體培養(yǎng)，優(yōu)選液體轉(zhuǎn)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)法；D.建立食用菌復(fù)壯和脫毒菌株的評定標(biāo)準(zhǔn)以原生質(zhì)體再生菌株與未處理菌株的生長、發(fā)育和病毒攜帶率的比較，建立包括食用菌處理前和處理后在菌絲生長速度、出菇時間、產(chǎn)量、品質(zhì)和病毒檢出率比對的食用菌復(fù)壯和脫毒菌株的評定標(biāo)準(zhǔn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及細胞工程范疇，具體的說是一種利用原生質(zhì)體再生技術(shù)進行食用菌菌種復(fù)壯和脫毒的方法。其步驟包括親本選擇；原生質(zhì)體制備；原生質(zhì)體再生；建立食用菌復(fù)壯和脫毒菌株的評定標(biāo)準(zhǔn)。原生質(zhì)體制備步驟中包括選擇穩(wěn)滲劑溶質(zhì)、穩(wěn)滲劑濃度、降解酶、酶解時間、酶解溫度，原生質(zhì)體再生步驟中包括選擇預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法。本發(fā)明的優(yōu)點是首先實現(xiàn)通過原生質(zhì)體的獲得達到去除食用菌內(nèi)生菌和抑制因子積累的作用，從而達到使食用菌復(fù)壯和脫毒的目的，恢復(fù)食用菌的優(yōu)良特性。以平菇89和白靈菇10為例，該新品種綜合性狀特別在產(chǎn)量、適應(yīng)性、商品性、抗雜菌能力等方面顯著優(yōu)于對照品種，已產(chǎn)生顯著的經(jīng)濟效益。
文檔編號A01G1/04GK101773050SQ20091025943
公開日2010年7月14日 申請日期2009年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日
發(fā)明者劉海英, 張運峰, 范永山 申請人:唐山師范學(xué)院