專利名稱：一種提高鹽樺苗種成活率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
屬于植物組織培養(yǎng)，煉苗移栽技術(shù)領(lǐng)域，確切地說是涉及鹽樺的組織培養(yǎng)繁殖技
術(shù)和試管苗煉苗移栽技術(shù)。
背景技術(shù)：
鹽樺(Betrla halophila Ching)為樺木科樺木屬植物，落葉小喬木或直立大灌木，樹高3 4米。樹皮和小枝為灰褐色，小枝有短而密的白色柔毛，及黃色的樹脂腺體。葉長2.5 4.5厘米，卵形或菱形。果序?yàn)橄麓沟膱A柱形，長2 3厘米，直徑約l厘米。小堅(jiān)果呈卵形，長2毫米，寬1. 5毫米，膜質(zhì)果翅寬闊，寬度為果的1. 5倍，翅的兩面均有疏而短的柔毛。屬于中性植物，喜光，喜土壤潮濕。它的地理分布范圍極為狹小，僅產(chǎn)于阿勒泰縣內(nèi)朗河的下游，是我國著名的植物學(xué)家秦仁昌教授發(fā)現(xiàn)定名的新種。
鹽樺抗鹽能力非常強(qiáng)，超過世界上任何一種喬木，在幼苗期抗鹽率即可達(dá)到1. 3%以上，是以抗鹽堿著稱的胡楊、沙棗抗鹽率的5倍以上，是鹽堿地綠化和造林的重要樹種，也可以改良土壤，因此其保護(hù)和開發(fā)價(jià)值很大。它被列為國家二級珍稀瀕危植物，是原生地已瀕臨滅絕的小喬木樹種，僅存于我國新疆阿勒泰地區(qū)， 一旦滅絕，則我國乃至世界植物名錄上將永遠(yuǎn)消失。因此開展鹽樺繁殖方面的研究，對推廣和應(yīng)用鹽樺尤為重要。
目前鹽樺一般用種子繁殖，為濕地的指示灌木，但由于種源稀少，扦插成活率低，不能大量育苗。因此，通過組織培養(yǎng)快速繁殖鹽樺是一種非常有效的途徑，可以極大地提高其繁殖系數(shù)，為生產(chǎn)提供大量苗木。我國對鹽樺的組織培養(yǎng)研究較少，主要對鹽樺的芽增殖誘導(dǎo)階段和誘導(dǎo)生根階段進(jìn)行研究，并獲得了生根植株，在理論上進(jìn)行生產(chǎn)是可行的，但尚未投入生產(chǎn)。 在文獻(xiàn)中較多地取用休眠枝為外植體，在實(shí)驗(yàn)室萌發(fā)后取樣，周期較長，長勢較弱。另外，由于枝條上密布許多短而密的白色柔毛及黃色的樹脂腺體，而且采自于自然環(huán)境下，自身附帶的污染物較多，一般使用升汞，但是利用升汞對外植體進(jìn)行滅菌容易造成材料死亡率較高，并對環(huán)境污染嚴(yán)重，故不提倡使用；次氯酸鈉滅菌效果好、對環(huán)境污染較小、使用方便等優(yōu)點(diǎn)是外植體滅菌劑的最佳選擇。 在鹽樺無菌苗增殖的過程中，容易導(dǎo)致苗木細(xì)弱，生根困難。還有煉苗、移栽過程，國內(nèi)報(bào)道的方法大多是經(jīng)過洗凈根部的培養(yǎng)基后，移栽至滅過菌的單一介質(zhì)(蛭石、細(xì)紗等)中，由于鹽樺無菌苗的葉薄、根肉質(zhì)，容易滋生雜菌，降低了成活率；使用這些單一的介質(zhì)容易導(dǎo)致苗木生長細(xì)弱，不利于以后的大田移苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供用于改良土壤和綠化、可適合大量繁殖的一種提高鹽樺苗種成活率的方法。 本發(fā)明采取的技術(shù)方案 —種提高鹽樺苗種成活率的方法，其方案是由鹽樺組織培養(yǎng)和煉苗移栽兩個(gè)過程構(gòu)成，并按以下操作步驟分別實(shí)施鹽樺組織培養(yǎng)和煉苗移栽 (1)制作無菌芽在生長季節(jié)，選用半木質(zhì)化的帶芽莖段作為外植體，用洗潔精搓洗去枝條表面的毛；以70%的乙醇浸泡lmin后，然后用10%次氯酸鈉浸泡12min ;滅菌處理后，將莖段接種到培養(yǎng)基MS+BA1. 0 1. 5mg/L進(jìn)行培養(yǎng)； (2)增殖過程將無菌芽接種于培養(yǎng)基MS+6-BA0. 1-1. Omg/L+NAAO-O. 5mg/L中，并每隔4周將新芽和莖段分割切下并接種到新的培養(yǎng)基中繼續(xù)擴(kuò)增； (3)壯苗和生根將無菌芽接種到MS+BAO. 1 1. Omg/L+NAAO 0. lmg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，4周后選取枝干健壯的無菌苗轉(zhuǎn)接到1/2MS+IBA0. 1 0. 5mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行生根；并由以下操作完成煉苗移栽， (4)移栽預(yù)處理將生根無菌苗在自然條件下鍛煉1周，用鑷子取出生根苗，洗凈根上的培養(yǎng)基，用1000-1500倍的適樂時(shí)藥劑浸泡10-20分種， (5)制作栽培基質(zhì)用滅菌過的蛭石、珍珠巖、草炭依3，3，4重量百分?jǐn)?shù)混合構(gòu)成基質(zhì)；移栽前用同濃度藥劑淋透生根苗，并放置1天； (6)移栽后管理先由塑料膜覆蓋，使?jié)穸?0% 80%，溫度28 30" ;20 30天后移至溫室培養(yǎng)，逐步打開薄膜，增加光照，10天后進(jìn)入一般地養(yǎng)護(hù)。
實(shí)施本發(fā)明后的積極效果是 本發(fā)明提高了鹽樺苗種的成活率，移栽成活率達(dá)95%以上。為大量繁殖優(yōu)質(zhì)的鹽樺工程苗，滿足上海臨港新城鹽堿地，改良土壤和綠化需要?jiǎng)?chuàng)造了條件。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)對本發(fā)明作進(jìn)一步說明
1.鹽樺無菌芽的獲得 選取休眠芽或長勢旺盛的健壯枝條為外植體，剪去葉片后，用洗潔精輕輕搓洗，再用流水沖洗2-3小時(shí)，去除枝條表面污物。轉(zhuǎn)移到超凈工作臺上，剪成2cm左右長的帶芽莖段，放入每個(gè)無菌三角瓶中。先用70%的酒精浸泡lmin，然后按照下述方法進(jìn)行滅菌處理
(1)用0. 1%升汞消毒8分鐘，最后用無菌水洗3-6次；
(2)用0. 1%升汞消毒15分鐘，最后用無菌水洗3-6次；
(3)用0. 1%升汞消毒20分鐘，最后用無菌水洗3-6次；
(4)用10%次氯酸鈉消毒6分鐘，最后用無菌水洗3-6次；
(5)用10%次氯酸鈉消毒8分鐘，最后用無菌水洗3-6次；
(6)用10%次氯酸鈉消毒12分鐘，最后用無菌水洗3-6次； 經(jīng)過以上方法滅菌處理后，將莖段接種到培養(yǎng)基MS+BA1. 0 1. 5mg/L上，并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱光照強(qiáng)度為2500 30001x，光照時(shí)間14h/d，溫度為24t:左右。期間注意觀察，隨時(shí)剔除污染的材料，并將無污染的材料轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基上，以免交叉感染。30天后統(tǒng)計(jì)經(jīng)上述處理后的污染率，比較不同消毒方法的滅菌效果。 上述結(jié)果表明利用升汞消毒休眠芽與次氯酸鈉消毒半木質(zhì)化莖段相比，本發(fā)明先用洗潔精輕輕搓洗后，流水沖洗2-3小時(shí)，再用10%次氯酸鈉消毒12分鐘滅菌的方法能夠顯著降低外植體的污染率，能夠得到更多地?zé)o菌芽。
表1不同滅菌方法的污染情況
編 號滅菌試劑材料5余 m 、接種數(shù) (個(gè))污染個(gè)數(shù) (個(gè))污染率 (%)
10.1%升汞休眠芽8504794
20.1%升汞休眠芽15504080
30.1%升汞休眠芽20503264
410%次氯酸鈉半木質(zhì)化莖段6301446
10%次氯酸鈉半木質(zhì)化莖段8301034
610%次氯酸鈉半木質(zhì)化莖段1230825 2.鹽樺的增殖 由以上步驟獲得的無菌個(gè)體經(jīng)過4周培養(yǎng)后，將成功誘導(dǎo)出的側(cè)枝切下，過長的莖段再以每2cm長度切小，將每段接種于MS+BA0. 1 1. 0mg/L+NAA0 0. lmg/L培養(yǎng)基中。以后每隔4周將長大的材料按上述方法重復(fù)切割，以獲得足夠多的無菌苗種。上述擴(kuò)增培養(yǎng)過程仍在培養(yǎng)箱中進(jìn)行，光照和溫度保持不變。
3.鹽樺的壯苗及生根 將上述步驟獲得的無菌側(cè)芽接種到激素含量較低的MS+BA0. 1 1. 0mg/L+NAA0 0. lmg/L培養(yǎng)基進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，培養(yǎng)4周后選取枝干健壯的無菌苗，轉(zhuǎn)接到l/2MS+IBA0. l 0. 5mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。經(jīng)過30天的生根培養(yǎng)，生根率達(dá)96%，根粗壯，有4 5條側(cè)生根。 4.鹽樺無菌苗的移栽 先將無菌苗在自然條件下鍛煉1周，用鑷子小心取出生根苗，洗凈根上的培養(yǎng)基，用1000-1500倍的適樂時(shí)藥劑浸泡10-20分種。然后移栽至高壓滅菌過4種不同配方的基質(zhì)中(l)珍珠巖；(2)蛭石；(3)細(xì)沙；(4)蛭石珍珠巖草炭。移栽前用同濃度藥劑淋透放置1天，然后移栽。移栽后先在弱光下培養(yǎng)，塑料膜覆蓋，保證濕度60% 80 % ，溫度28 30°C，20 30天后移至溫室培養(yǎng)，慢慢打開薄膜，逐漸增加光照。10天后進(jìn)行一般地養(yǎng)護(hù)。 經(jīng)過不同基質(zhì)的比較，結(jié)果表明成活率最高的是蛭石和蛭石珍珠巖草炭=3:3: 4，沒有葉片發(fā)霉以及根系萎縮現(xiàn)象，并且能夠長出側(cè)生根，也能快速的長出新芽，成活率為ioo%。經(jīng)過2個(gè)月的栽培養(yǎng)護(hù)后，再比較這兩種基質(zhì)，生長于蛭石珍珠巖草炭=3:3:4基質(zhì)中的苗木生長速度快，苗木粗壯，因此更適合作為無菌苗的移栽基質(zhì)。 表2不同介質(zhì)對于鹽樺移栽成活率的影響
編號基質(zhì)總數(shù)(株)成活數(shù)(株)成活率％
1珍珠巖363186.11
2蛭石3636100.00
細(xì)沙362775.00
4蛭石:珍珠巖:草炭 3:3:43636100.00
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)效果在于
(1)獲得鹽樺無菌苗。鹽樺枝條上密布許多短而密的白色柔毛及黃色的樹脂腺體，
5而且采集于野外自然環(huán)境條件下，自身附帶的污染物較多，其滅菌過程具有相當(dāng)?shù)碾y度。本 技術(shù)采用較溫和的洗潔精，輕輕地搓洗去枝條表面的毛，初步降低污染后，再以70%的乙醇 lmin以及10%次氯酸鈉處理12min，平均無菌率70X以上。 (2)建立鹽樺快速繁殖體系。本技術(shù)在獲得鹽樺無菌苗的基礎(chǔ)上，直接利用其側(cè)芽 進(jìn)行分割繁殖，步驟簡單，操作方便。并在這過程中增加了壯苗的環(huán)節(jié)，有利于增加鹽樺組 培苗的生根率。期間未涉及愈傷組織的脫分化和分化過程，盡量避免了組織培養(yǎng)過程中遺 傳變異的可能性，一旦獲得無菌芽，即可進(jìn)行長期繁殖生產(chǎn)。所用試劑均為常規(guī)化工產(chǎn)品， 成本低廉，便于大規(guī)模工廠化生產(chǎn)。 (3)苗木移栽在移栽時(shí)用藥劑進(jìn)行浸泡處理，減少了病菌來源，預(yù)防病害的發(fā) 生，加快苗木生長；同時(shí)利用蛭石、珍珠巖、草炭不同配比作為鹽樺組培苗的移栽基質(zhì)，有利 于以后種植，苗木恢復(fù)生長快。本項(xiàng)目可不分季節(jié)，隨時(shí)為臨港新城鹽堿地綠化提供優(yōu)質(zhì)工 程苗。MS培養(yǎng)基(Murashing and skoog medium)的標(biāo)準(zhǔn)配方如下(單位mg/L) KN03 1900 NH萬 1650 CaCL2 2H20 440 MgS04 7H20 370 KH2P04 170 KI 0. 83 H3B03 6. 2 MnS04 4H20 22. 3 ZnS04 7H20 8. 6 Na2Mo04 2H20 0. 25 CuS04 5H20 0. 025 CoCL2 6H20 0. 025 Na2EDTA 2H20 37. 3 FeS04 7H20 27. 8 煙酸 0.5 鹽酸吡卩多醇 0. 5 鹽酸硫胺素 0. 1 甘氨酸 2 肌醇 100 MS/2，即大量元素含量減半的MS培養(yǎng)基。培養(yǎng)基按濃度配好后添加瓊脂30g/L， 蔗糖7g/L，然后用稀HC1或NaOH調(diào)整pH值到5. 8，分裝到250ml培養(yǎng)瓶中，最后在121°C 、 0. IMPa滅菌20min。
實(shí)施例 于2008年6月從上海市園林科學(xué)研究所鄔橋基地采集半木質(zhì)化的鹽樺枝條為外 植體，剪去葉片后用洗潔精輕輕搓洗，流水沖洗2小時(shí)。在超凈工作臺上，剪成2cm左右長 的帶芽莖段10個(gè)，先用70%的酒精浸泡lmin，然后用10%次氯酸鈉消毒12分鐘，最后用無
6菌水洗3次后接種在MS+BA1. 0 1. 5mg/L培養(yǎng)基上，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。箱培養(yǎng)光照強(qiáng)度為 2500 30001x，光照時(shí)間14h/d，溫度為24"左右。經(jīng)過觀察，發(fā)現(xiàn)6個(gè)莖段污染，另外4個(gè) 莖段無菌并側(cè)芽開始生長。4周后，將側(cè)枝切下接種于新的培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)4周后再次 分割，每瓶8個(gè)芽，共3瓶。5個(gè)月后，將獲得的無菌側(cè)芽接種到激素含量較低的MS+BAO. 1 1. 0mg/L+NAA0 0. lmg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，培養(yǎng)4周后選取枝干健壯的無菌苗，轉(zhuǎn)接 到1/2MS+IBA0. 1 0. 5mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。最后將生根苗鍛煉后移栽在蛭石
珍珠巖草炭=3 : 3 : 4基質(zhì)中，獲得工程苗120株。
權(quán)利要求
一種提高鹽樺苗種成活率的方法，其特征是由鹽樺組織培養(yǎng)和煉苗移栽兩個(gè)過程構(gòu)成，并按以下操作步驟分別實(shí)施鹽樺組織培養(yǎng)和煉苗移栽(1)制作無菌芽在生長季節(jié)，選用半木質(zhì)化的帶芽莖段作為外植體，用洗潔精搓洗去枝條表面的毛；以70％的乙醇浸泡1min；后以10％次氯酸鈉浸泡12min；滅菌處理后，將莖段接種到培養(yǎng)基MS+BA1.0～1.5mg/L進(jìn)行培養(yǎng)；(2)增殖過程將無菌芽接種于培養(yǎng)基MS+6-BA0.1-1.0mg/L+NAA0-0.5mg/L中，并每隔4周將新芽和莖段分割切下并接種到新的培養(yǎng)基中繼續(xù)擴(kuò)增；(3)壯苗和生根將無菌芽接種到MS+BA0.1～1.0mg/L+NAA0～0.1mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，4周后選取枝干健壯的無菌苗轉(zhuǎn)接到1/2MS+IBA0.1～0.5mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行生根；并由以下操作完成煉苗移栽，(4)移栽預(yù)處理將生根無菌苗在自然條件下鍛煉1周，用鑷子取出生根苗，洗凈根上的培養(yǎng)基，用1000-1500倍的適樂時(shí)藥劑浸泡10-20分種，(5)制作栽培基質(zhì)用滅菌過的蛭石，珍珠巖，草炭依3，3，4重量百分?jǐn)?shù)混合構(gòu)成基質(zhì)藥劑；移栽前用同濃度藥劑淋透生根苗，并放置1天；(3)移栽后管理先由塑料膜覆蓋，使?jié)穸?0％～80％，溫度28～30℃；20～30天后移至溫室培養(yǎng)，逐步打開薄膜，逐漸增加光照，10天后進(jìn)入一般地養(yǎng)護(hù)。
全文摘要
一種提高鹽樺苗種成活率的方法，屬于植物組織培養(yǎng)，煉苗移栽技術(shù)領(lǐng)域，確切地說是涉及鹽樺的組織培養(yǎng)繁殖技術(shù)和試管苗煉苗移栽技術(shù)。其特點(diǎn)是由鹽樺組織培養(yǎng)和煉苗移栽兩個(gè)過程構(gòu)成，并按以下操作步驟分別實(shí)施鹽樺組織培養(yǎng)和煉苗移栽制作無菌芽，增殖，壯苗和生根，移栽預(yù)處理，制作栽培基質(zhì)，移栽后管理。本發(fā)明提高了鹽樺苗種的成活率，移栽成活率達(dá)95％以上。為大量繁殖優(yōu)質(zhì)的鹽樺工程苗，滿足上海臨港新城鹽堿地，改良土壤和綠化需要?jiǎng)?chuàng)造了條件。
文檔編號A01G31/00GK101703001SQ200910195950
公開日2010年5月12日 申請日期2009年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月21日
發(fā)明者崔心紅, 張群, 朱義, 羅玉蘭 申請人:上海市園林科學(xué)研究所