專利名稱：：利用百合鱗片切片快速誘導(dǎo)小鱗莖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種高效生產(chǎn)百合小鱗莖的方法，屬于植物培育
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：百合"j7i，矽A)為百合科aW&cesW,合屬fZi7j'，;植物，是國(guó)際上重要的球根花卉，具有花型美觀、花色艷麗、芳香宜人的特點(diǎn)，深受人們的喜愛(ài)。但我國(guó)目前生產(chǎn)用的種球主要依賴進(jìn)口，每年需種球1.5億粒。通過(guò)近幾年國(guó)家和各省在百合種球國(guó)產(chǎn)化方面進(jìn)行立項(xiàng)支持，己有少量的國(guó)產(chǎn)種球投放市場(chǎng)，據(jù)統(tǒng)計(jì)2008年國(guó)產(chǎn)種球約2500萬(wàn)粒，這與我國(guó)每年百合生產(chǎn)的需求量還有相當(dāng)大的差距。由于我國(guó)種球繁育技術(shù)還不成熟，加上百合種球的繁育周期長(zhǎng)，而且要經(jīng)過(guò)小鱗莖組培快繁或鱗片扦插、田間種球培育、采后低溫破休眠等多個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)。目前采用的鱗片扦插生產(chǎn)小鱗莖的技術(shù)，每片鱗片只能在基部產(chǎn)出2一3個(gè)小鱗莖，且易發(fā)生鱗片的腐爛，生產(chǎn)效率較低；采用組培快繁技術(shù)生產(chǎn)小鱗莖，則會(huì)因種球生長(zhǎng)于地下土壤中而使消毒難度增大，進(jìn)種成功率低，且主要是采用鱗片下半部進(jìn)行組培，初代誘導(dǎo)增殖率在3倍左右，以基部產(chǎn)生愈傷組織或/和不定芽為主，需經(jīng)多代轉(zhuǎn)接和調(diào)整培養(yǎng)基才能形成小鱗莖，操作繁瑣，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，且培養(yǎng)過(guò)程中容易發(fā)生變異。因此以常規(guī)的扦插或組培方法來(lái)滿足新品種或脫毒原種的快速生產(chǎn)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，生產(chǎn)上急需既可靠，又優(yōu)質(zhì)、高效，且快速生產(chǎn)百合小鱗莖的技術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的鱗片扦插繁殖效率低，而組培快繁技術(shù)不僅存在進(jìn)種率低，而且產(chǎn)生小鱗莖部位有限，并以愈傷組織和不定芽為主，形成小鱗莖的過(guò)程多、時(shí)間長(zhǎng)，且易發(fā)生變異等問(wèn)題，本發(fā)明提供一種利用百合鱗片切片快速誘導(dǎo)小鱗莖的方法，以快速大量生產(chǎn)出質(zhì)量?jī)?yōu)、成本低的百合小鱗莖，滿足市場(chǎng)需求。本發(fā)明通過(guò)下列技術(shù)方案完成一種利用百合鱗片切片快速誘導(dǎo)小鱗莖的方法，包括種球低溫打破休眠處理，鱗片消毒處理，其特征在于消毒鱗片經(jīng)過(guò)下列步驟處理A、將經(jīng)過(guò)消毒處理的鱗片接種到MS基本培養(yǎng)基中，在溫度為25—28°C，光照強(qiáng)度為15002000LX的條件下預(yù)培養(yǎng)810天；B、將經(jīng)過(guò)A步驟預(yù)培養(yǎng)的鱗片，自基部往上切成0.20.3cm的片段后，接種到下列誘導(dǎo)培養(yǎng)基中MS+0.51.0mg/L的IBA+66.5g/L的瓊脂+5080g/L的糖，PH值為5.86.0;在溫度為2325'C且黑暗的條件下，誘導(dǎo)培養(yǎng)至切片長(zhǎng)出35個(gè)小鱗莖；C、將切片上誘導(dǎo)培養(yǎng)出的小鱗莖分割下來(lái)，接種在下列培養(yǎng)基中MS+0.51.0mg/L的IBA+6090g/L的糖+66.5g/L的瓊脂，PH值5.56.0;在溫度為2325。C且黑暗的條件下培養(yǎng)6090天，使小鱗莖的周徑達(dá)到3.0cm以上；D、取出C步驟培養(yǎng)所得小鱗莖，洗去培養(yǎng)基，經(jīng)消毒處理后，包埋于泥炭基質(zhì)中，于3—5。C的低溫環(huán)境中培養(yǎng)30天以上，即可下地種植，種植后的發(fā)芽率達(dá)95%以上。所述種球的低溫破休眠處理為現(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)方法即將種球采收后用常規(guī)方法進(jìn)行清洗、消毒處理后，用常規(guī)泥炭基質(zhì)包埋，放于24。C的冷庫(kù)或冰箱中處理4050天。所述鱗片消毒處理為現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)方法即將經(jīng)過(guò)低溫破休眠處理的種球剝棄最外的23層鱗片后，剝?nèi)∑溆圜[片，用自來(lái)水沖洗干凈后，再用洗衣粉水洗滌并漂洗干凈；將漂洗好的鱗片先在75%的酒精中泡2030秒，再在0.10.15%的升汞溶液中消毒處理2030分鐘，然后在2%的次氯酸鈉溶液中清毒浸泡20分鐘，在消毒過(guò)程中要不斷搖動(dòng)瓶子或在轉(zhuǎn)速為200r/min的搖床上搖動(dòng)，最后用無(wú)菌水漂洗3次。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)和效果1.與鱗片扦插技術(shù)相比，小鱗莖生產(chǎn)率顯著提高?，F(xiàn)有的扦插繁殖每個(gè)鱗片只產(chǎn)生23個(gè)小鱗莖，每個(gè)種球產(chǎn)生3040個(gè)小鱗莖；而本發(fā)明每個(gè)鱗片可產(chǎn)生2030個(gè)小鱗莖，每個(gè)種球可產(chǎn)生的小鱗莖在3004個(gè)以上。2.與常規(guī)鱗片組培生產(chǎn)的小鱗莖技術(shù)相比，本發(fā)明每個(gè)鱗片可切成8個(gè)切片以上，且80%以上的切片會(huì)產(chǎn)生小鱗莖，大大增加了材料量和小鱗莖產(chǎn)生量；同時(shí)，本發(fā)明直接誘導(dǎo)培養(yǎng)即可形成小鱗莖，減少了現(xiàn)有技術(shù)組培中產(chǎn)生的愈傷組織和不定叢芽還要經(jīng)過(guò)至少2次繼代轉(zhuǎn)接才能形成小鱗莖的過(guò)程及時(shí)間，同時(shí)也避免了從愈傷組織誘導(dǎo)小鱗莖會(huì)發(fā)生的變異。3.本發(fā)明通過(guò)對(duì)切片產(chǎn)生小鱗莖的分切和培養(yǎng)，可快速生產(chǎn)小籽球，不僅能快速高效、高產(chǎn)生產(chǎn)小籽球，而且是直接形成單個(gè)小鱗莖，不會(huì)產(chǎn)生從不定叢芽誘導(dǎo)小籽球的多蕊問(wèn)題。4.本發(fā)明的小鱗莖誘導(dǎo)和培養(yǎng)均在黑暗條件下進(jìn)行，可以有效的節(jié)約能源。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述。實(shí)施例11.種球的低溫破休眠處理將百合東方系品種"西伯利亞"和OT系品種"黃天霸"種球采收后用水清洗干凈，并用600倍百菌清+500倍代森鋅+500倍五氯硝基苯磷浸泡處理20分鐘后，用市售的泥炭為基質(zhì)包埋后放于冰箱4。C的冷藏室中，45天時(shí)取出種球；2.鱗片清洗和消毒將種球的鱗片逐層剝?nèi)?，將最外的?、2層的鱗片棄之不用；取第3層以后的鱗片，用自來(lái)水沖洗干凈后，再用適量濃度的洗衣粉水洗滌并漂洗干凈；將鱗片放入濃度為75%的酒精中泡20秒，再放入濃度為0.15%的升汞溶液中，在搖床上振動(dòng)25分鐘，之后在濃度為2%的次氯酸鈉溶液中浸泡20分鐘，最后用無(wú)菌水漂洗3次備用；3.鱗片預(yù)培養(yǎng)將消毒后的鱗片接種到MS基本培養(yǎng)基中，每瓶接種4片，在25'C溫度，2000LX光照強(qiáng)度的培養(yǎng)室中預(yù)培養(yǎng)8天；4.鱗片切片將步驟3預(yù)培養(yǎng)的無(wú)菌鱗片在超凈工作臺(tái)上逐片依次從基部向上橫切成0.2cm的片段，鱗片頂部的0.30.5cm的鱗片梢除去不用；5.小鱗莖的誘導(dǎo)培養(yǎng)將切下的鱗片，接種到MS+IBA0.5mg/L+瓊脂6.5g/L+糖60g/L的鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，接種時(shí)要將切片靠鱗片基部的一面朝下，培養(yǎng)基的PH值為5.8，接種后放到溫度為25'C，無(wú)光照的黑暗培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)20天，40天和60天的分化情況統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表l:可以看出黃天霸與西伯利亞相比，誘導(dǎo)時(shí)間稍短，誘導(dǎo)度稍高；表11=1叩種數(shù)切片數(shù)(片)20天40天60天產(chǎn)生突起(%)產(chǎn)生小鱗莖產(chǎn)生小鱗莖(平均鱗錢(cm)西伯利亞1512114.945.582.63.661.08黃天霸1714315.950.684.63.981.126.小鱗莖的培養(yǎng)將步驟5獲得的1.0cin以上的小鱗莖分割下來(lái)，接種在PH值5.5的MS+IBA1.0mg/L+糖90g/L+瓊脂6g/L的培養(yǎng)基，在溫度為23t:且黑暗的條件下培養(yǎng)60天，80.2%上的小鱗莖周徑達(dá)到3.0cm以上；7.小鱗莖的出瓶前處理和定植將周徑達(dá)到3.0cm以上的小鱗莖從瓶?jī)?nèi)取出，洗去培養(yǎng)基，并用0.3%的多菌靈消毒處理后，用市購(gòu)的泥炭基質(zhì)包埋后，放在4。C的冰箱中處理30天后，即可進(jìn)行定植。種植后的發(fā)芽率達(dá)到95.9%。實(shí)施例21.種球的低溫破休眠處理品種和處理方法同實(shí)施例1;2.鱗片清洗和消毒操作同實(shí)施例1，消毒處理時(shí)用0.15%的升汞搖洗20分鐘，即在轉(zhuǎn)速為200r/min的搖床上搖動(dòng)，之后在2%的次氯酸鈉溶液中泡20分鐘，最后用無(wú)菌水漂洗3次；63.鱗片預(yù)培養(yǎng)將經(jīng)過(guò)消毒處理的鱗片接種到MS基本培養(yǎng)基中，在溫度為28°C，光照強(qiáng)度為1500LX的條件下預(yù)培養(yǎng)10天；4.鱗片切片操作同實(shí)施例1;5.切片誘導(dǎo)培養(yǎng)將切下的鱗片，逐片接種到MS+NAA0.5mg/L+瓊脂66.5g/L+糖70g/L的鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，接種時(shí)要將切片靠鱗片基部的一面朝下，培養(yǎng)基的PH值為5.8，接種后放到溫度為23'C，無(wú)光照條件的暗培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)20天，40天和60天的分化情況統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表2:可以看出黃天霸與西伯利亞相比，誘導(dǎo)率稍高，但總的誘導(dǎo)情況較方案一稍差；表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>6.小鱗莖的培養(yǎng)將步驟5獲得的l.Ocm以上的小鱗莖分割下來(lái)，接種在TO值6.0的MS+IBA0.5mg/L+糖90g/L+瓊脂6.5g/L的培養(yǎng)基中，在溫度為25。C且黑暗的條件下培養(yǎng)90天，78.5%以上的小鱗莖周徑達(dá)到3.0cm以上；7.小鱗莖的出瓶前處理和定植同實(shí)施例1。種植后的平均發(fā)芽率達(dá)到95.6%。權(quán)利要求1、一種利用百合鱗片切片快速誘導(dǎo)小鱗莖的方法，包括種球低溫打破休眠處理，鱗片消毒處理，其特征在于消毒鱗片經(jīng)過(guò)下列步驟處理A、將經(jīng)過(guò)消毒處理的鱗片接種到MS基本培養(yǎng)基中，在溫度為25-28℃，光照強(qiáng)度為1500～2000LX的條件下預(yù)培養(yǎng)8～10天；B、將經(jīng)過(guò)A步驟預(yù)培養(yǎng)的鱗片，自基部往上切成0.2～0.3cm的片段后，接種到下列誘導(dǎo)培養(yǎng)基中MS+0.5～1.0mg/L的IBA+6～6.5g/L的瓊脂+50～80g/L的糖，PH值為5.8～6.0；在溫度為23～25℃且黑暗的條件下，誘導(dǎo)培養(yǎng)至切片長(zhǎng)出3～5個(gè)小鱗莖；C、將切片上誘導(dǎo)培養(yǎng)出的小鱗莖分割下來(lái)，接種在下列培養(yǎng)基中MS+0.5～1.0mg/L的IBA+60～90g/L的糖+6～6.5g/L的瓊脂，PH值5.5～6.0；在溫度為23～25℃且黑暗的條件下培養(yǎng)60～90天，使小鱗莖的周徑達(dá)到3.0cm以上；D、取出C步驟培養(yǎng)所得小鱗莖，洗去培養(yǎng)基，經(jīng)消毒處理后，包埋于泥炭基質(zhì)中，于3-5℃的低溫環(huán)境中培養(yǎng)30天以上，即可下地種植，種植后的發(fā)芽率達(dá)95％以上。2、如權(quán)利要求1所述的利用百合鱗片切片快速誘導(dǎo)小鱗莖的方法，其特征在于所述種球的低溫破休眠處理為現(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)方法即將種球采收后用常規(guī)方法進(jìn)行清洗、消毒處理后，用常規(guī)泥炭基質(zhì)包埋，放于24""C的冷庫(kù)或冰箱中處理4050天。3、如權(quán)利要求1所述的利用百合鱗片切片快速誘導(dǎo)小鱗莖的方法，其特征在于所述鱗片消毒處理為現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)方法即將經(jīng)過(guò)低溫破休眠處理的種球剝棄最外的23層鱗片后，剝?nèi)∑溆圜[片，用自來(lái)水沖洗干凈后，再用洗衣粉水洗滌并漂洗干凈；將漂洗好的鱗片先在75%的酒精中泡2030秒，再在0.10.15%的升汞溶液中消毒處理2030分鐘，然后在2%的次氯酸鈉溶液中清毒浸泡20分鐘，在消毒過(guò)程中要不斷搖動(dòng)瓶子或在轉(zhuǎn)速為200r/min的搖床上搖動(dòng)，最后用無(wú)菌水漂洗3次。全文摘要本發(fā)明提供一種利用百合鱗片切片快速誘導(dǎo)小鱗莖的方法，包括種球低溫打破休眠處理，鱗片消毒處理，其特征在于消毒鱗片經(jīng)過(guò)下列處理鱗片預(yù)培養(yǎng)、鱗片切片、小鱗莖的誘導(dǎo)培養(yǎng)、小鱗莖的培養(yǎng)、小鱗莖出瓶前的處理和定植。本發(fā)明每個(gè)鱗片可產(chǎn)生20～30個(gè)小鱗莖，每個(gè)種球可產(chǎn)生的小鱗莖在300個(gè)以上，不僅能快速高效、高產(chǎn)生產(chǎn)小籽球，而且是直接形成單個(gè)小鱗莖，不會(huì)產(chǎn)生從不定叢芽誘導(dǎo)小籽球的多蕊問(wèn)題，本發(fā)明直接誘導(dǎo)培養(yǎng)即可形成小鱗莖，減少了現(xiàn)有技術(shù)組培中產(chǎn)生的愈傷組織和不定叢芽還要經(jīng)過(guò)至少2次繼代轉(zhuǎn)接才能形成小鱗莖的過(guò)程及時(shí)間，同時(shí)也避免了從愈傷組織誘導(dǎo)小鱗莖會(huì)發(fā)生的變異。本發(fā)明的小鱗莖誘導(dǎo)和培養(yǎng)均在黑暗條件下進(jìn)行，可以有效的節(jié)約能源。文檔編號(hào)A01H4/00GK101554138SQ200910094350公開(kāi)日2009年10月14日申請(qǐng)日期2009年4月15日優(yōu)先權(quán)日2009年4月15日發(fā)明者吳麗芳,吳學(xué)尉,葵和,崔光芬,康超勇,張藝萍,汪國(guó)仙,王繼華申請(qǐng)人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所