專利名稱：利用胡蘿卜游離小孢子培養(yǎng)單倍體再生植株的技術(shù)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域中植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)；特別涉及一種利用胡 蘿卜游離小孢子培養(yǎng)倍體再生植株的技術(shù)方法。用于胡蘿卜游離小孢子再 生植株單倍體培養(yǎng)、單倍體再生體系建立的生物技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景用胡蘿卜游離小孢子培養(yǎng)單倍體植株， 一直是世界范圍內(nèi)未解決的難 題，具有活力的游離小孢子在獲得后迸行愈傷誘導(dǎo)過程中，存在著小孢子 只能膨大，以后則降解，或者只能產(chǎn)生小愈傷，不能進(jìn)一部分化的現(xiàn)象。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于避免胡蘿卜游離小孢子培養(yǎng)過程中降解，不能產(chǎn)生 愈傷組織的缺點(diǎn)，提供一種利用胡蘿卜游離小孢子培養(yǎng)單倍體再生植株的 技術(shù)方法，要解決的技術(shù)問題是將游離小孢子培養(yǎng)成單倍體再生植株，同 時(shí)建立單倍體再生系統(tǒng)。而單倍體加倍獲得的二倍體是胡蘿卜遺傳及品種 選育的最佳一材料。本發(fā)明的技術(shù)方案是 一種利用胡蘿卜游離小孢子培養(yǎng)單倍體再生植 株的技術(shù)方法，其特征在于將獲得的無菌具有活力的胡蘿卜游離小孢子 接入"HLB"培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)，35天以后開始長出胚性愈傷組 織，愈傷組織達(dá)到lcm直徑時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)分化再生植株培養(yǎng)，再生植株誘導(dǎo) 生根、馴化、移栽。本發(fā)明的目的是通過如下措施來達(dá)到此技術(shù)是在無菌的條件下進(jìn)行 的。過程如下1、 將胡蘿卜小花先經(jīng)過70%酒精50秒滅菌，再經(jīng)過0.1 %升汞5分 鐘滅菌，滅菌后用無菌水沖洗6次；將滅菌后的小花放入液體"HLB"培養(yǎng) 基中研碎，過400目篩；取液體離心，經(jīng)過800轉(zhuǎn)/分鐘，3分鐘后去掉上 清液，鏡檢有活力的游離小孢子含量達(dá)到十萬個(gè)/ml濃度為止。2、 將1中濃度適宜的游離小孢子液體轉(zhuǎn)入固體"HLB"誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng) 基上，在室內(nèi)自然光照，25i:條件下培養(yǎng)至長出胚性愈傷組織。33、 將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入MS+6—BA (0.5mg/升)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)分 化培養(yǎng)，25°C，光照30001ux，14小時(shí)，直至分化出小植株。4、 將小植株轉(zhuǎn)入MS+NM (0.5mg/升)生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，25°C，光 照20001ux， 12小時(shí)，直至植株長出8條以上的根。5、 將生根的再生植株馴化后移栽。 本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)本發(fā)明解決了胡蘿卜游離小孢子培養(yǎng)過程中游離小孢子降解而不產(chǎn)生 胚性愈傷組織的難題，通過使用"HLB"誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基，能夠獲得游離小 孢子單倍體再生植株，同時(shí)建立一套可靠、重復(fù)性好的再生系統(tǒng)，該方法 實(shí)用性強(qiáng)，應(yīng)用價(jià)值高。針對(duì)胡蘿卜游離小孢子培養(yǎng)單倍體再生植株過程中難以誘導(dǎo)培養(yǎng)出胚 性愈傷組織的問題，發(fā)明人進(jìn)行了大量的研究工作，最終獲得了利用游離 小孢子誘導(dǎo)胚性愈傷組織的"HLB"培養(yǎng)基，在此培養(yǎng)基上培養(yǎng)可以誘導(dǎo)出 胚性愈傷組織，進(jìn)一步誘導(dǎo)分化出小植株、生根、移栽的方法，從而獲得 單倍體再生植株，使利用胡蘿卜游離小孢子培養(yǎng)出單倍體再生植株成為可 能，為胡蘿卜遺傳研究及育種提供新種質(zhì)。本發(fā)明旨在提供一種胡蘿卜游離小孢子培養(yǎng)單倍體再生植株過程中難以誘導(dǎo)培養(yǎng)出胚性愈傷組織的問題的方法；通過該方法可以用游離小孢子 培養(yǎng)出單倍體再生植株，并建立其再生體系。1、 該技術(shù)具有準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)。胡蘿卜單倍體培養(yǎng)的方法花藥培養(yǎng)和 游離小孢子培養(yǎng)兩種方法，前者利用胡蘿卜花藥，由于花藥及含有單倍體 的小孢子，又含有二倍體的體細(xì)胞，用其培養(yǎng)出的再生植株的來源不明， 所以應(yīng)用價(jià)值有限；而用游離小孢子培養(yǎng)出的再生植株，由于在培養(yǎng)過程 中過濾掉體細(xì)胞，所培養(yǎng)出的再生植株都是單倍體或其加倍的純合雙單倍 體，準(zhǔn)確性很高。2、 該技術(shù)應(yīng)用價(jià)值高。胡蘿卜雜交育種中，雜交親本的純合至關(guān)重要， 而親本的純合需要5代自交以后，所用時(shí)間為IO年左右，其純度只能接近 100%。采用游離小孢子培養(yǎng)獲得的單倍體經(jīng)過加倍后可以直接得到100% 純合雙單倍體，直接用于雜交育種，時(shí)間只需要3年左右。所以應(yīng)用此技 術(shù)不僅縮短育種周期，又可以提高純度，具有很好的實(shí)際應(yīng)用效果。3、 本方法是將獲得的無菌具有活力的胡蘿卜游離小孢子接入"HLB" 培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)，長出胚性愈傷組織后進(jìn)行誘導(dǎo)分化再生植株培養(yǎng)，再生植株誘導(dǎo)生根、馴化、移栽。與其它植物的游離小孢子培養(yǎng)方 法相比，除培養(yǎng)基不同以外，其它技術(shù)也不煩瑣，具有可操作性。
具體實(shí)施方式
一種利用胡蘿卜游離小孢子培養(yǎng)單倍體再生植株的技術(shù)方法，其特征在于將獲得的無菌具有活力的胡蘿卜游離小孢子接入"HLB"培養(yǎng)基上進(jìn) 行誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)，35天以后開始長出胚性愈傷組織，愈傷組織達(dá)到lcm直 徑時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)分化再生植株培養(yǎng)，再生植株誘導(dǎo)生根、馴化、移栽。本發(fā)明解決了胡蘿卜游離小孢子培養(yǎng)過程中游離小孢子降解而不產(chǎn)生 胚性愈傷組織的難題，通過使用"HLB"誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基，能夠獲得游離小 孢子單倍體再生植株，同時(shí)建立一套可靠、重復(fù)性好的再生系統(tǒng)，該方法 實(shí)用性強(qiáng)，應(yīng)用價(jià)值高。下面通過具體實(shí)施例，進(jìn)一步詳細(xì)介紹本發(fā)明；實(shí)施例l1、 將胡蘿卜小花先經(jīng)過70%酒精50秒滅菌，再經(jīng)過0.1%升汞5分 鐘滅菌，滅菌后用無菌水沖洗6次；將滅菌后的小花放入液體"HLB"培養(yǎng) 基中研碎，過400目篩；取液體離心，經(jīng)過800轉(zhuǎn)/分鐘，3分鐘后去掉上 清液，鏡檢有活力的游離小孢子含量達(dá)到十萬個(gè)/ml濃度為止。2、 將1中濃度適宜的游離小孢子液體轉(zhuǎn)入固體"HLB"誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng) 基上，在室內(nèi)自然光照，25'C條件下培養(yǎng)至長出胚性愈傷組織。3、 將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入MS+6—BA (0.5mg/升)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)分 化培養(yǎng)，25'C，光照30001ux,14小時(shí)，直至分化出小植株。4、 將小植株轉(zhuǎn)入MS+NAA (0.5mg/升)生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，25°C，光 照20001ux, 12小時(shí)，直至植株長出8條以上的根。5、 將生根的再生植株馴化后移栽。權(quán)利要求
1、一種利用胡蘿卜游離小孢子培養(yǎng)單倍體再生植株的技術(shù)方法，其特征在于將獲得的無菌具有活力的胡蘿卜游離小孢子接入“HLB”培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)，35天以后開始長出胚性愈傷組織，愈傷組織達(dá)到1cm直徑時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)分化再生植株培養(yǎng)，再生植株誘導(dǎo)生根、馴化、移栽1)游離小孢子培養(yǎng)是在無菌條件下實(shí)施；其過程包括2)將經(jīng)過表面消毒后無菌的游離小孢子接入“HLB”培養(yǎng)基上進(jìn)行胚性愈傷組織愈傷培養(yǎng)，培養(yǎng)出胚性愈傷組織；3)將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基進(jìn)行再生植株分化培養(yǎng)；4)將再生植株進(jìn)行誘導(dǎo)生根，移栽。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用胡蘿卜游離小孢子培養(yǎng)單倍體再生植株 的技術(shù)方法，其特征在于1) 將胡蘿卜小花先經(jīng)過70%酒精50秒滅菌，再經(jīng)過0.17。升汞5分 鐘滅菌，滅菌后用無菌水沖洗6次；將滅菌后的小花放入液體"HLB"培養(yǎng) 基中研碎，過400目篩；取液體離心，經(jīng)過800轉(zhuǎn)/分鐘，3分鐘后去掉上 清液，鏡檢有活力的游離小孢子含量達(dá)到十萬個(gè)/ml濃度為止；2) 將1中濃度適宜的游離小孢子液體轉(zhuǎn)入固體"HLB"誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng) 基上，在室內(nèi)自然光照，25t:條件下培養(yǎng)至長出胚性愈傷組織；3) 將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入MS+6—BA (0,5mg/升)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)分 化培養(yǎng)，25°C，光照30001ux， 14小時(shí)，直至分化出小植株；4) 將小植株轉(zhuǎn)入MS+NM (0.5mg/升)生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，25°C，光 照20001ux, 12小時(shí)，直至植株長出8條以上的根；5) 將生根的再生植株馴化后移栽。
全文摘要
一種利用胡蘿卜游離小孢子培養(yǎng)單倍體再生植株的技術(shù)方法，用于蔬菜作物胡蘿卜的生物技術(shù)領(lǐng)域。將獲得的無菌具有活力的胡蘿卜游離小孢子接入“HLB”培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)，35天以后開始長出胚性愈傷組織，愈傷組織達(dá)到1cm直徑時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)分化再生植株培養(yǎng)，再生植株誘導(dǎo)生根、馴化、移栽。本方法中使用的“HLB”誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基，能夠?qū)⒑}卜游離小孢子誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，利用本發(fā)明技術(shù)方法可以建立胡蘿卜游離小孢子再生體系，從而獲得單倍體再生植株。而單倍體植株是胡蘿卜遺傳研究的最好材料，由單倍體植株染色體加倍而成的純合二倍體，又是品種選育的最好資源。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101606488SQ20091006980
公開日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2009年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月21日
發(fā)明者尹立榮, 管長志, 恒 趙, 磊 陳, 霍文娟 申請(qǐng)人:天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心