專利名稱：包埋玻璃化超低溫保存山藥種質(zhì)的玻璃化保護(hù)劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種種質(zhì)保存技術(shù)，特別是一種包埋玻璃化超低溫保存山 藥種質(zhì)的玻璃化保護(hù)劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
山藥既是一種深受人們喜愛的食品，又是一種藥用價(jià)值很高且應(yīng)用廣 泛的中藥材，尤其懷山藥，其藥用價(jià)值更高。然而，對(duì)山藥種質(zhì)的保存技 術(shù)仍沿用傳統(tǒng)的方法，許多珍貴種質(zhì)資源丟失，不能適應(yīng)現(xiàn)在日益增長(zhǎng)的 需求量的要求。超低溫保存技術(shù)是目前保存期長(zhǎng)、品質(zhì)穩(wěn)定、應(yīng)用成熟的
--種種質(zhì)保存方法。20世紀(jì)90年代出現(xiàn)了包埋玻璃化法超低溫保存技術(shù)， 它綜合了玻璃化法和包埋脫水法的優(yōu)點(diǎn)，而克服了包埋干法操作繁瑣及細(xì) 胞內(nèi)外冰晶的形成和玻璃化法的毒性。目前已在蘋果、薄荷、草莓、柿、 山葵、甘薯、大蒜等得到成功應(yīng)用。此種方法由繼代培養(yǎng)、低溫練苗、預(yù) 培養(yǎng)、包埋、裝載和脫水處理、液氮保存、保存后化凍和洗滌及再生培養(yǎng) 等環(huán)節(jié)組成。然而，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)這種方法在山藥種質(zhì)的保存中應(yīng)用未能成功， 經(jīng)研究其原因之一是脫水的玻璃化保護(hù)劑不適于山藥種質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能將包埋玻璃化超低溫保存技術(shù)應(yīng)用于山藥 種質(zhì)保存的玻璃化保護(hù)劑及其應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是，包埋玻璃 化超低溫保存山藥種質(zhì)的玻璃化保護(hù)劑，包括甘油、乙二醇、二甲基亞砜
和聚乙二醇，其特征在于:甘油的濃度為30%、乙二醇的濃度為15%、 二甲 基亞砜的濃度為10%和聚乙二醇的濃度為15%的混合液。包埋玻璃化超低 溫保存山藥種質(zhì)的玻璃化保護(hù)劑的應(yīng)用，其特征在于將經(jīng)過(guò)裝載液處理 后的山藥種質(zhì)置于玻璃化保護(hù)劑溶液中在0-25"C下脫水20-120分鐘。本發(fā) 明與現(xiàn)有技術(shù)比較具有操作方便、保存時(shí)間長(zhǎng)且保存后山藥種質(zhì)遺傳穩(wěn)定 性好的顯著優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的玻璃化保護(hù)劑與原包埋玻璃化超低溫保存技術(shù)中的玻璃化保 護(hù)劑的不同之處是各成份的濃度不同。經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)研究對(duì)其濃度進(jìn)行了
改進(jìn)獲得了成功，該保護(hù)劑的組成及其濃度為30%的甘油、15%的乙二醇、 10%的二甲基亞砜和15%的聚乙二醇的混合液。
上述保護(hù)劑對(duì)山藥種質(zhì)進(jìn)行包埋玻璃化超低溫處理中的應(yīng)用方法是， 將經(jīng)過(guò)裝載處理后懷山藥種質(zhì)在上述玻璃化保護(hù)劑中在0 25。C下脫水 20-120分鐘，然后依次進(jìn)行液氮保存、化凍、洗滌、再培養(yǎng)。包埋玻璃化 法超低溫保存懷山藥種質(zhì)的技術(shù)將繼代培養(yǎng)50 70d的懷山藥試管苗，于 4 。C低溫下鍛煉7 30d，在無(wú)菌條件下切取l cm左右的帶芽莖段，放入MS + 0.1 mol.L"蔗糖+ 0.1 mol.L"甘油或MS + 0.2mol.L"蔗糖預(yù)培養(yǎng)基中4 。C 下恒定培養(yǎng)3 5 d，然后將材料切成2mm左右的帶芽莖段，室溫下與含2~3% 海藻酸鈉和0.2 mol丄"蔗糖的MS培養(yǎng)基混合，將混合液滴入含有0.5 mol丄—1 CaCl2和0.2mol'L"蔗糖MS培養(yǎng)基中進(jìn)行包埋，包埋時(shí)間為20 35 min，使之 形成包埋珠(每個(gè)包埋珠含一個(gè)帶芽莖段)；將包埋珠用裝載液在O "C下裝 載30 120min，然后用玻璃化保護(hù)劑在O 。C下脫水30 120 min或25。C下脫水 20 60min。，迅速投入液氮保存；在液氮中保存1 360 d后，立即將包埋珠 放入37 42 。C水浴中快速化凍l 3 min，化凍后用含0.3 1.0 mol丄"蔗糖的 MS洗滌液洗滌包埋珠2次，每次8 15min，轉(zhuǎn)入再生培養(yǎng)基(MS+KT1 mg丄-'+TDZ 0.02 mg'L"+NAA 0.02 mg'L")中，先于暗處培養(yǎng)7 20 d，再轉(zhuǎn) 到光下培養(yǎng)，可長(zhǎng)成正常植株。
通過(guò)對(duì)保存時(shí)間和保存后再生植株的遺傳穩(wěn)定性的研究發(fā)現(xiàn)保存時(shí) 間對(duì)材料的相對(duì)存活率和成活率均沒有影響；再生植株與常溫保存苗相比， 株高、葉片數(shù)、芽數(shù)、莖節(jié)長(zhǎng)、葉綠素和可溶性蛋白的含量、SOD、 POD、 PPO和淀粉酶的同工酶酶譜以及RAPD條帶均未出現(xiàn)變異。
權(quán)利要求
1、包埋玻璃化超低溫保存山藥種質(zhì)的玻璃化保護(hù)劑，包括甘油、乙二醇、二甲基亞砜和聚乙二醇，其特征在于甘油的濃度為30％、乙二醇的濃度為15％、二甲基亞砜的濃度為10％和聚乙二醇的濃度為15％的混合液。
2、 包埋玻璃化超低溫保存山藥種質(zhì)的玻璃化保護(hù)劑的應(yīng)用，其特征在于將經(jīng)過(guò)裝載液處理后的山藥種質(zhì)置于玻璃化保護(hù)劑溶液中在0-25"C下脫水20-120分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種包埋玻璃化超低溫保存山藥種質(zhì)的玻璃化保護(hù)劑及其應(yīng)用，本發(fā)明的目的是提供一種能將包埋玻璃化超低溫保存技術(shù)應(yīng)用于山藥種質(zhì)保存的玻璃化保護(hù)劑及其應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是，包括甘油、乙二醇、二甲基亞砜和聚乙二醇，甘油的濃度為30％、乙二醇的濃度為15％、二甲基亞砜的濃度為10％和聚乙二醇的濃度為15％的混合液。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)比較具有操作方便、保存時(shí)間長(zhǎng)且保存后山藥種質(zhì)遺傳穩(wěn)定性好的顯著優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明用于山藥的離體保存。
文檔編號(hào)A01N3/00GK101642091SQ200910066049
公開日2010年2月10日 申請(qǐng)日期2009年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月3日
發(fā)明者娜 周, 宋萍萍, 張曉麗, 翔 李, 苗 李, 李明軍, 李海兵, 趙喜亭 申請(qǐng)人:河南師范大學(xué)