專利名稱：紫三葉的組織培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物的組織培養(yǎng)方法，尤其是涉及紫三葉的組織培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
紫三葉為豆科車軸草屬植物，原產(chǎn)于溫帶及亞熱帶地區(qū)，為多年生草本，指狀復(fù)葉 通常有3片小葉，小葉近無柄，常有齒缺，小葉呈紫紅色與綠色相間，是一種良好的花鏡材 料。但是作為國外引進的新品種，紫三葉初期引種數(shù)量較少，因此種苗供應(yīng)受到一定限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種可提高繁殖速 度和苗的整齊度，并提高性狀穩(wěn)定性的紫三葉的組織培養(yǎng)方法。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)紫三葉的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)無菌材料的獲得取萌發(fā)的幼嫩的芽，去除外面包裹的葉片后，用自來水沖洗l_3h后于超凈工作 臺上，依次利用質(zhì)量濃度為70-75 %的乙醇浸泡10-50s，體積濃度為0. 5-2 %。的汞浸泡 10-30min，再用無菌水沖洗4_6次，利用無菌濾紙吸干芽表面的水分后，將芽切成0. 5-2cm 長的帶腋芽的節(jié)段，節(jié)段接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；(2)芽的分化和增殖節(jié)段接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上1-3周后，小芽部位開始膨大，出現(xiàn)綠色突起，2-3周 后可見芽分生組織，再培養(yǎng)1-2個月，小芽可以長到2-3cm，將小芽切下轉(zhuǎn)入芽的增殖培養(yǎng) 基中進行增殖培養(yǎng)，小芽的分化較多，但生長迅速且無玻璃化等不良現(xiàn)象，在培養(yǎng)基中生長 發(fā)育良好；(3)不定芽壯苗培養(yǎng)在芽的增殖培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)出的叢生芽中每叢有3-4株能夠伸長，其余的處于矮 化狀態(tài)，將叢生芽分成小叢后，轉(zhuǎn)至壯苗培養(yǎng)基上生長，不定芽迅速伸長，15-30天后可以長 至 1. 5_3cm ；(4)生根培養(yǎng)取1.5-3cm的不定芽小植株，轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，5-15天后幼苗 基部分化出白色的根原基，15-30天后可以長至2-3cm，根系粗壯，須根眾多，生根率為 90-100% ；(5)煉苗與移栽生根培養(yǎng)15-30天，根系長至0. 5-lcm時，選擇根系發(fā)達、生長健壯的無菌苗，于室 內(nèi)開瓶煉苗1-4天，然后將苗取出，洗凈根部的瓊脂，栽于溫室內(nèi)的苗床中馴化20-40天，即 可移栽室外，給予肥水管理，最終的移栽成活率為90-100%。所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括MS+6-BA1. 0-3. 0mg/L+NAA0. 1-0. 3mg/L。
所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)選MS+6-BA3. 0mg/L+NAA0. 3mg/L。所述的芽的增殖培養(yǎng)基包括MS+6-BA0. 5-2. Omg/L+NAAO. 1-0. 2mg/L。所述的芽的增殖培養(yǎng)基優(yōu)選MS+6-BA2. Omg/L+NAAO. 2mg/L。所述的壯苗培養(yǎng)基包括MS+6-BA0. 5-2. Omg/L+NAAO. 1-0. 2mg/L。所述的壯苗培養(yǎng)基優(yōu)選MS+6-BA1. Omg/L+NAAO. lmg/L。所述的生根培養(yǎng)基包括MS+NAA0. 05-0. 2mg/L。所述的生根培養(yǎng)基優(yōu)選MS+NAAO. lmg/L。所述的培養(yǎng)基還包括蔗糖20_40g/L、瓊脂粉4_8g/L，培養(yǎng)基pH5. 5-6. 0，培養(yǎng)溫度 24-26°C，光照 1500-25001x。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過組培技術(shù)，極大提高了紫三葉的繁殖速度和苗的整 齊度，并提高了其性狀的穩(wěn)定性，可實現(xiàn)育苗的工廠化大批量生產(chǎn)。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。實施例1(1)無菌材料的獲得取萌發(fā)的幼嫩的芽，去除外面包裹的葉片后，用自來水沖洗Ih后于超凈工作臺 上，依次利用質(zhì)量濃度為70%的乙醇浸泡10s，體積濃度為0. 5%。的汞浸泡lOmin，再用無菌 水沖洗4次，利用無菌濾紙吸干芽表面的水分后，將芽切成0. 5cm長的帶腋芽的節(jié)段，節(jié)段 接種于包括MS+6-BA1. Omg/L+NAAO. lmg/L的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；(2)芽的分化和增殖節(jié)段接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上1周后，小芽部位開始膨大，出現(xiàn)綠色突起，2周后 可見芽分生組織，再培養(yǎng)1個月，小芽可以長到2cm，將小芽切下轉(zhuǎn)入包括MS+6-BA0. 5mg/ L+NAAO. lmg/L的芽的增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，小芽的分化較多，但生長迅速且無玻璃 化等不良現(xiàn)象，在培養(yǎng)基中生長發(fā)育良好；(3)不定芽壯苗培養(yǎng)在芽的增殖培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)出的叢生芽中每叢有3株能夠伸長，其余的處于矮化 狀態(tài)，將叢生芽分成小叢后，轉(zhuǎn)至包括MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. lmg/L的壯苗培養(yǎng)基上生長， 不定芽迅速伸長，15天后可以長至1. 5cm ；(4)生根培養(yǎng)取1. 5cm的不定芽小植株，轉(zhuǎn)接入包括MS+NAAO. 05mg/L的生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生 根，5天后幼苗基部分化出白色的根原基，15天后可以長至2cm，根系粗壯，須根眾多，生根 率為90% ；(5)煉苗與移栽生根培養(yǎng)15天，根系長至0. 5cm時，選擇根系發(fā)達、生長健壯的無菌苗，于室內(nèi)開 瓶煉苗1天，然后將苗取出，洗凈根部的瓊脂，栽于溫室內(nèi)的苗床中馴化20天，即可移栽室 外，給予肥水管理，最終的移栽成活率為90%。上述各種情況的培養(yǎng)基還包括蔗糖20g/L、瓊脂粉4g/L，pH= 5. 5，培養(yǎng)溫度24°C， 光照 15001x。
5
實施例2(1)無菌材料的獲得取萌發(fā)的幼嫩的芽，去除外面包裹的葉片后，用自來水沖洗2h后于超凈工作臺 上，依次利用質(zhì)量濃度為75%的乙醇浸泡30s，體積濃度為1%。的汞浸泡15min，再用無菌水 沖洗5次，利用無菌濾紙吸干芽表面的水分后，將芽切成Icm長的帶腋芽的節(jié)段，節(jié)段接種 于包括MS+6-BA2. 0mg/L+NAA0. 2mg/L的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；(2)芽的分化和增殖節(jié)段接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上2周后，小芽部位開始膨大，出現(xiàn)綠色突起，3周后可 見芽分生組織，再培養(yǎng)1個半月，小芽可以長到3cm，將小芽切下轉(zhuǎn)入包括MS+6-BA1. Omg/ L+NAAO. lmg/L的芽的增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，小芽的分化較多，但生長迅速且無玻璃 化等不良現(xiàn)象，在培養(yǎng)基中生長發(fā)育良好；(3)不定芽壯苗培養(yǎng)在芽的增殖培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)出的叢生芽中每叢有4株能夠伸長，其余的處于矮化 狀態(tài)，將叢生芽分成小叢后，轉(zhuǎn)至包括MS+6-BA0. 2mg/L+NAA0. lmg/L的壯苗培養(yǎng)基上生長， 不定芽迅速伸長，20天后可以長至2cm ；(4)生根培養(yǎng)取1. 5cm的不定芽小植株，轉(zhuǎn)接入包括MS+NAAO. 05mg/L的生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生 根，5天后幼苗基部分化出白色的根原基，25天后可以長至2cm，根系粗壯，須根眾多，生根 率為90% ；(5)煉苗與移栽生根培養(yǎng)20天，根系長至Icm時，選擇根系發(fā)達、生長健壯的無菌苗，于室內(nèi)開瓶 煉苗3天，然后將苗取出，洗凈根部的瓊脂，栽于溫室內(nèi)的苗床中馴化30天，即可移栽室外， 給予肥水管理，最終的移栽成活率為100%。上述各種情況的培養(yǎng)基還包括蔗糖30g/L、瓊脂粉6g/L，pH = 5. 8，培養(yǎng)溫度25°C， 光照 20001x。實施例3(1)無菌材料的獲得取萌發(fā)的幼嫩的芽，去除外面包裹的葉片后，用自來水沖洗3h后于超凈工作臺 上，依次利用質(zhì)量濃度為75%的乙醇浸泡50s，體積濃度為1%。的汞浸泡30min，再用無菌水 沖洗6次，利用無菌濾紙吸干芽表面的水分后，將芽切成2cm長的帶腋芽的節(jié)段，節(jié)段接種 于包括MS+6-BA3. 0mg/L+NAA0. 3mg/L的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；(2)芽的分化和增殖節(jié)段接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上3周后，小芽部位開始膨大，出現(xiàn)綠色突起，4周后 可見芽分生組織，再培養(yǎng)2個月，小芽可以長到3cm，將小芽切下轉(zhuǎn)入包括MS+6-BA2. Omg/ L+NAAO. 2mg/L的芽的增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，小芽的分化較多，但生長迅速且無玻璃 化等不良現(xiàn)象，在培養(yǎng)基中生長發(fā)育良好；(3)不定芽壯苗培養(yǎng)在芽的增殖培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)出的叢生芽中每叢有4株能夠伸長，其余的處于矮化 狀態(tài)，將叢生芽分成小叢后，轉(zhuǎn)至包括MS+6-BA1. 0mg/L+NAA0. 2mg/L的壯苗培養(yǎng)基上生長，不定芽迅速伸長，30天后可以長至2cm ；(4)生根培養(yǎng)取2cm的不定芽小植株，轉(zhuǎn)接入包括MS+NAAO. 2mg/L的生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，15 天后幼苗基部分化出白色的根原基，30天后可以長至2. 5cm,根系粗壯，須根眾多，生根率 為 93% ；(5)煉苗與移栽生根培養(yǎng)30天，根系長至Icm時，選擇根系發(fā)達、生長健壯的無菌苗，于室內(nèi)開瓶 煉苗4天，然后將苗取出，洗凈根部的瓊脂，栽于溫室內(nèi)的苗床中馴化40天，即可移栽室外， 給予肥水管理，最終的移栽成活率為96%。上述各種情況的培養(yǎng)基還包括蔗糖40g/L、瓊脂粉8g/L，pH = 6. 0，培養(yǎng)溫度26°C， 光照 25001x。
權(quán)利要求
紫三葉的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)無菌材料的獲得取萌發(fā)的幼嫩的芽，去除外面包裹的葉片后，用自來水沖洗1-3h后于超凈工作臺上，依次利用質(zhì)量濃度為70-75％的乙醇浸泡10-50s，體積濃度為0.5-2‰的汞浸泡10-30min，再用無菌水沖洗4-6次，利用無菌濾紙吸干芽表面的水分后，將芽切成0.5-2cm長的帶腋芽的節(jié)段，節(jié)段接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；(2)芽的分化和增殖節(jié)段接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上1-3周后，小芽部位開始膨大，出現(xiàn)綠色突起，2-3周后可見芽分生組織，再培養(yǎng)1-2個月，小芽可以長到2-3cm，將小芽切下轉(zhuǎn)入芽的增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，小芽的分化較多，但生長迅速且無玻璃化等不良現(xiàn)象，在培養(yǎng)基中生長發(fā)育良好；(3)不定芽壯苗培養(yǎng)在芽的增殖培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)出的叢生芽中每叢有3-4株能夠伸長，其余的處于矮化狀態(tài)，將叢生芽分成小叢后，轉(zhuǎn)至壯苗培養(yǎng)基上生長，不定芽迅速伸長，15-30天后可以長至1.5-3cm；(4)生根培養(yǎng)取1.5-3cm的不定芽小植株，轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，5-15天后幼苗基部分化出白色的根原基，15-30天后可以長至2-3cm，根系粗壯，須根眾多，生根率為90-100％；(5)煉苗與移栽生根培養(yǎng)15-30天，根系長至0.5-1cm時，選擇根系發(fā)達、生長健壯的無菌苗，于室內(nèi)開瓶煉苗1-4天，然后將苗取出，洗凈根部的瓊脂，栽于溫室內(nèi)的苗床中馴化20-40天，即可移栽室外，給予肥水管理，最終的移栽成活率為90-100％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紫三葉的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基 包括 MS+6-BA1. 0-3. 0mg/L+NAA0. 1-0. 3mg/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的紫三葉的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基 優(yōu)選 MS+6-BA3. 0mg/L+NAA0. 3mg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紫三葉的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的芽的增殖培養(yǎng) 基包括 MS+6-BA0. 5-2. 0mg/L+NAA0. 1-0. 2mg/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的紫三葉的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的芽的增殖培養(yǎng) 基優(yōu)選 MS+6-BA2. 0mg/L+NAA0. 2mg/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紫三葉的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的壯苗培養(yǎng)基包 括 MS+6-BA0. 5-2. 0mg/L+NAA0. 1-0. 2mg/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的紫三葉的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的壯苗培養(yǎng)基優(yōu) 選 MS+6-BA1. 0mg/L+NAA0. lmg/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紫三葉的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的生根培養(yǎng)基包 括 MS+NAA0. 05-0. 2mg/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的紫三葉的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的生根培養(yǎng)基優(yōu) 選 MS+NAA0. lmg/L。
10.根據(jù)權(quán)利要求2或4或6或8所述的紫三葉的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)基還包括蔗糖20-40g/L、瓊脂粉4-8g/L，培養(yǎng)基pH5. 5-6. 0,培養(yǎng)溫度24-26°C，光照 1500-25001x。
全文摘要
本發(fā)明涉及紫三葉的組織培養(yǎng)方法，包括無菌材料的獲得，芽的分化和增殖，不定芽壯苗培養(yǎng)，生根培養(yǎng)，煉苗與移栽等步驟。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明大大提高了紫三葉的繁殖速度和苗的整齊度，并提高了其性狀的穩(wěn)定性，可實現(xiàn)育苗的工廠化大批量生產(chǎn)。
文檔編號A01H4/00GK101869065SQ20091004997
公開日2010年10月27日 申請日期2009年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月24日
發(fā)明者沈勤, 陳建華, 黃建榮 申請人:上海上房園林植物研究所