專利名稱：油菜雄性不育細(xì)胞質(zhì)nau10a的育種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公^f了一種甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)及其特征線粒體DNA序列，屬于遺傳工程 領(lǐng)域和植物育種領(lǐng)域。具體地講，涉及十7:花科植物的雜種優(yōu)勢利用，為十字花科 植物雜交種選育提供新型不存細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞質(zhì)。
背景技術(shù)：
細(xì)胞質(zhì)雄性不育可以應(yīng)用于雜交種生產(chǎn)，效益巨大，己經(jīng)為人們普遍認(rèn)可。細(xì) 胞質(zhì)雄性不育系用于配置雜交種，可提高油菜菜籽產(chǎn)量15%以上，也可可顯著提高 十字花科蔬菜的產(chǎn)量。
目前，在油菜乃至十字花科植物中，i要應(yīng)用細(xì)胞質(zhì)雄性不育主要是polima CMS、陜2A 、 OguCMS (參見劉平武等，it藍(lán)型油菜polCMS育性恢復(fù)基因的 分子標(biāo)記中國'油料作物學(xué)報(bào)，2007. 29 (1) : 14—19.)。
poli加C'MS是傅廷棟教授子1()72年存:H藍(lán)咽油菜品種波単.馬中發(fā)現(xiàn)19株天然 細(xì)胞質(zhì)雄性不,株，后將穩(wěn)定下來的不—,系稱polimaCMS(簡稱pol CMS),其恢復(fù) 基因位于A組染色體上，為一對(duì)顯性基l天l。 PolCMS不宵性也受溫度的影響，依其 保持系細(xì)胞核基因的不同，可分為高溫不，、低溫不育和穩(wěn)定不育3種類型。通過 篩選，獲得缺乏溫度敏感基因的保待系，^宵成不存性穩(wěn)定的polcms系。polCMS 目前的應(yīng)用面最廣。
陜2ACMS是李殿榮(1980)于1976年在甘藍(lán)型油菜品種間復(fù)交組合(574-3/(豐收 4號(hào)+7207泡合授粉)]后代中發(fā)現(xiàn)的,不冇株，后經(jīng)連續(xù)回交轉(zhuǎn)育得到穩(wěn)定不育系陜 2A，其恢復(fù)iS兇為1對(duì)顯性基因。陝2A polCMS具有共同的保持系和恢復(fù)系， 由其配制的三系雜種"秦油2號(hào)"是國際lr.第一個(gè)通過品種審定、并大面積用于生 產(chǎn)的甘藍(lán)型三系雜交種。
Ogu CMS是由0gura(1968)在卩l(xiāng)木蘿卜Raphanus sativas L.群體中發(fā)現(xiàn)天然雄性 不育，選冇得到的系統(tǒng)。法國Bannerol等(1977)采用連續(xù)回交的方法將這種胞質(zhì)分 別轉(zhuǎn)育到甘藍(lán)型油菜和甘藍(lán)中，得到油菜蘿卜質(zhì)雄性不宵系。oguCMS不育性穩(wěn)定， 所有甘藍(lán)型油菜品種均是它的保持系，其恢復(fù)基因存在于歐洲的蘿卜品種中。Ogu CMS生產(chǎn)的雜交油菜已經(jīng)在英、法等國商品化生產(chǎn)。
目前，全世界已經(jīng)報(bào)導(dǎo)的油菜不育細(xì)胞質(zhì)有22種以上，但是應(yīng)用較多的細(xì)胞質(zhì) 主要是POLCMS。目前油菜CMS利用中還是存在一些問題，主要是①油菜CMS 育性不穩(wěn)定問題-;②應(yīng)用的CMS細(xì)胞質(zhì)比較爭一，讓人不禁想起單一細(xì)胞質(zhì)可能 造成的生產(chǎn)^失。因此，發(fā)掘新的,菜CMS系統(tǒng)仍然具有十分重要的意義。
3我們在油菜原生質(zhì)體融合后代中，發(fā)現(xiàn)不育株，通過雜交和回交，獲得了 NAU10A型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系；鑒定分子線粒體DNA，證明NAU10A不育系是由
線粒體重組得到的新型不育系。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題木發(fā)明的目的在于公開 -種細(xì)胞質(zhì)雄性不育NAU10A，該不育胞質(zhì)是通
過原生質(zhì)休融合后代選fr而得到的。油菜及十字花科雜種優(yōu)勢利用中，存在不育細(xì)
胞質(zhì)單一，TT性不穩(wěn)定等問題，本發(fā)明的細(xì)胞質(zhì)雄性不育為解決細(xì)胞質(zhì)單一問題提
供了新手段，可用于油菜及其十字花科雜種優(yōu)勢利用。
技術(shù)方案
上述NAU1()A雄性不育細(xì)胞質(zhì)，屬于新型細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型，可用于甘藍(lán)型油 菜、白菜等十字花科植物的雜種優(yōu)勢利用。通過雜交、回交等育種方式，育成NAU10A 細(xì)胞質(zhì)的雄性不育系。
TGA
該序列編碼的重組蛋白序列(SEQfDNo. 2)為 MPQLDKFTYFSQFFWLCLFFF丁FYIF1CNDGDGVLGISRILKLRNQLLSHWGKTIQ
TRHLEGEHDIARR(5ALVD1MKW];VRSLDHHFRVFRYLDRLRDSKRAKVNEILDL FR
有益效果
1 、本發(fā)明的目的在于公開 一種細(xì)胞質(zhì)雄忭不存NAU10A，該不育胞質(zhì)是通過原生 質(zhì)體融合后代選育而得到的。
2、油菜及十字花科雜種優(yōu)勢利用中，存在不育細(xì)胞質(zhì)單一，育性不穩(wěn)定等問題。 本發(fā)明人提供的細(xì)胞質(zhì)是經(jīng)過線粒休堪因組重組而獲得的，該重組類型不同于 已經(jīng)大仙積應(yīng)用了 20年的POLIMA不育胞質(zhì)類型(pol)，該不育胞質(zhì)的應(yīng)用將
4有利于解決不T'f細(xì)胞質(zhì)單一的問題。ifi]目.該細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型的不育性比較
徹底，易于培—fr徹底穩(wěn)定不育系。
3、 本發(fā)明人提供的不宵胞質(zhì)是線粒體基W組重組的結(jié)果利用具有NAP型胞質(zhì) 的可育親本原生質(zhì)體融合，獲得融合雜種；由于遺傳的異質(zhì)性，導(dǎo)致線粒體DNA 重組，從而可得到的不tf胞質(zhì)。線粒休DNA的分子實(shí)驗(yàn)證明了這個(gè)結(jié)論。本發(fā) 明的細(xì)胞質(zhì)雄性不存不同于NAP型細(xì)胞質(zhì)雄性不育，NAP型細(xì)胞質(zhì)的恢復(fù)系是 NAU10A的保持系；也不同于POLIMA型細(xì)胞質(zhì)雄性不宵系，POLIMA型不育 系的線粒體編碼ORF224蛋白，導(dǎo)致雄性不育，而本發(fā)明的不育胞質(zhì)編碼重組 型ORF222R10蛋白。從利用的角度看，NAP細(xì)胞質(zhì)的利用價(jià)值不大，而本發(fā)明 的NAU]0A細(xì)胞質(zhì)利用價(jià)值很大。
4、 本發(fā)明人提供的不育胞質(zhì)可以通過種問雜交，轉(zhuǎn)移到白菜、甘藍(lán)等十字花科物 種中去，為這些十字花科物種的雜種優(yōu)勢利用，提供細(xì)胞質(zhì)雄性不育，因此應(yīng) 用可以很廣泛，
5、 研究中，通過叢因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)NAU10A的重組型基因O/ i^ZR70在穩(wěn)定
不育系中表込大，而在可T'f雜交組合中該1I組型基因表達(dá)量低，說明該基因與 雄性不育的形成有關(guān)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
以播娘蒿(Dwcwa^""TO/7/iia)葉片和甘藍(lán)型油菜(Smw/ca "印^)子葉為 材料提取原生質(zhì)體，采用PEG—高pH、高鈣附加DMSO融合方法，液體淺層靜 置培養(yǎng)，硏究影響播娘蒿與甘藍(lán)型汕菜原生質(zhì)體融合的因素，獲得了 19株再生植 株。結(jié)果表明4 %纖維素i悔+ 0.5 %離析酶+5 mmol/L MES酶解10h和1 %纖維 素酶+ 0.2%離析酶+3 mmol/L MES酶解14h分別適合獲得高產(chǎn)率播娘蒿與油菜 原生質(zhì)體；30 % PEG + 0,3mot/L葡萄糖+ 50 mmol/L CaC12 2H20 + 15 % DMSO 獲得了 10%的融合率；改良B5培養(yǎng)基的原生質(zhì)體培養(yǎng)效果較好；每次添加不同 的新鮮培養(yǎng)基和添加MES對(duì)于防止褐化具有很好的效果適宜分化培養(yǎng)基為MS + 4.0 mg/L 6-BA + 0.3 mg/L NAA + 5.()mg/L AgN03;適宜生根培養(yǎng)基為MS + O.lmg/LIBA + 0.1 mg/L NAA 。
甘藍(lán)招油菜與播娘蒿的原生質(zhì)休融合獲得的再生植株移栽到田間后，對(duì)其進(jìn) 行了形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)及花粉活力觀察。雜種植株生長緩慢、在葉型、葉片缺刻、 葉緣裂痕、莖桿分枝處顏色、花蕾初期顏色等形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)出播娘蒿的特征，開 花期和成熟期相對(duì)較晚；雜種植株花比油菜花小，花粉活力低，結(jié)實(shí)率低。在融 合雜種中出現(xiàn)了 7個(gè)不育株，用甘藍(lán)W汕菜與融合雜種進(jìn)行雜交和回交研究。
實(shí)施例2利用原化:質(zhì)體融合技術(shù)所獲得的融合雜種中，出現(xiàn)了不育株。用不育株了與
NAU10B雜交，進(jìn) 一歩從雜交F開始選擇徹底不育株與NAU10A回交，經(jīng)過5 代回交，得到檢定的不育系NAU10A。 NAU10A的不^性在年份間表現(xiàn)穩(wěn)定不宵。 通過測交，己經(jīng)找到恢復(fù)系，實(shí)現(xiàn)了三系配套，為雜種優(yōu)勢利用提供了新的授粉控 制系統(tǒng)。研究丌創(chuàng)了細(xì)胞質(zhì)方法，通過改方法從融合雜種至回交一代，均發(fā)現(xiàn)細(xì)胞 質(zhì)重組；基因克隆的研究表明，回交一代以后細(xì)胞質(zhì)mtDNA保持穩(wěn)定，不再發(fā)生 重組。
NAU10A是通過原生質(zhì)體融合獲得的一系列重組細(xì)胞質(zhì)的中的一個(gè)。本發(fā)明 中，選育不育胞質(zhì)的方法體系中，結(jié)合了mtDNA重組方法以及和育種選擇方法， 最后通過細(xì)胞質(zhì)鑒定，得到了優(yōu)良的不育細(xì)胞質(zhì)。
實(shí)施例3
利用NAU10A不育胞質(zhì)與白菜(Srtm/cfl"叩附)品種"上海青"雜交，F(xiàn)l 代仍然表現(xiàn)為不育，而NAP型胞質(zhì)的甘藍(lán)，.油菜與上海青雜交后，F(xiàn)l有花粉量基 本正常，說明NAU10A不育胞質(zhì)可以轉(zhuǎn)移到油菜近緣中去，為雜種優(yōu)勢利用提供 新手段。
實(shí)驗(yàn)例4
選用甘藍(lán)型油菜雄性不冇細(xì)胞質(zhì)NAU10A的新鮮幼嫩黃化葉片為材料，提取線 粒體DNA。依據(jù)數(shù)據(jù)庫中A^P細(xì)胞質(zhì)雄性不育高度相關(guān)的or/222設(shè)計(jì)引物
上游引物Pl: 5'-TCATCGAAATAGATCGAGTA-3，；
下游引物P2: 5'-TTATGAGCTAGATAAAGCTACT -3';
以基因組DNA為模板，擴(kuò)增目的基因。PCR反應(yīng)條件優(yōu)化后為94'C預(yù)變性5 min 后；94。C變性30s， 54。C退火45s， 72。C延伸60s， 32個(gè)循環(huán);72'C再延伸10 min。擴(kuò) 增出了 一條600 700 bp大小的特異條帶。PCR回收產(chǎn)物連接到PGT克隆載體上，轉(zhuǎn) 化到大腸桿llTOP10中，以來自l，的片段上的引物序列為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定 目的片段。對(duì)此目的片段進(jìn)行測序，結(jié)果衣明特異片段大小為669bp，具有起始密 碼子(ATG)和終止密碼子(TGA)。開放閱讀框完整。但是序列出現(xiàn)了重組，與NAP 型細(xì)胞質(zhì)的ORF222不同，且具有這種重組序列的不育胞質(zhì)與NAP型的"恢復(fù)系和 保持系"關(guān)系也不同。 實(shí)驗(yàn)例5:
以油菜NAU10A為材料，分別從其根、莖、葉、花蕾以及花等組織中，提取總 RNA，采用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄cDNA黨:一條鏈，以cDNA第一條鏈為模板，采用RT-PCR 技術(shù)，檢測池第NAU10A不同組織的差異表達(dá)情況。
內(nèi)參基兇"c"w的弓1物序列
actinF: 5,-CGCCGAGCG()GAAATCGTC-3，；aetinR: 5，-GGAAAGTGCTGAGGGATGC-3，。
以真核生物中組成性表達(dá)的基因五^7a為內(nèi)標(biāo)，對(duì)cDNA第一鏈進(jìn)行半定量分 析，￡K a的PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5。C2min; 94。C45s， 55。C45s， 72。Clmin， 24個(gè) 循環(huán)；72°C,延伸10min。結(jié)果表明基因在不育系的根、莖、葉、花蕾以及花中 都有表達(dá)，但在花器官和莖中的表達(dá)較高，均屬于組成型表達(dá)；在可育雜交組合中 表達(dá)量低。說明不育性可能與Oi i^W有關(guān)。
綜上所述，本發(fā)明人利用原生質(zhì)體融合技術(shù)，得到了不育株，由不育株的雜交 和回交后代得到穩(wěn)定不育系NAU10A，其細(xì)胞質(zhì)經(jīng)過分子鑒定，證明為新型雄性不 育胞質(zhì)，在ORF222區(qū)域得到了重組型DNA序列和基因及其編碼蛋白。本發(fā)明人 提供了一種新型雄性不育授粉控制系統(tǒng)，為油菜乃至油菜的十字花科近緣種的雜種 優(yōu)勢利用提供了新方法。
本發(fā)明涉及的序列及記號(hào)分列如下:
(1) SEQIDNO. 1的信息
(i) 序列特征
(A) 長度669 bp
(B) 類型核苷酸
(C) 鏈性單鏈
(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii) 分子類型核苷酸
(iii) 序列描述SEQIDNO. 1
(2) SEQ ID NO. 2的信息
(i) 序列特征
(A) 長度222 a.a
(B) 類型氨基酸
(C) 鏈性單鏈
(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii) 分子類型蛋白質(zhì)
(iii)序列描述SEQ ID NO.2
(3) SEQ ID NO. 3的信息
①序列特征
(A)長度20b(B) 類型核苷酸
(C) 鏈性單鏈
(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii) 分子類型核苷酸
(iii) 序列描述SEQIDN0.3
(4) SEQIDN0.4的信息
(i) 序列特征
(A) 長度22b
(B) 類型核苷酸
(C) 鏈性單鏈
(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii) 分子類型核苷酸 (iii)序列描述SEQIDNO.4
(5) SEQ ID NO. 5的信息
(i) 序列特征-
(A) 長度19b
(B) 類型核苷酸
(C) 鏈性單鏈
(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii) 分子類型核苷酸
(iii)序列描述SEQIDNO. 5
(6) SEQ IDN0.6的信息
(i) 序列特征
(A) 長度19b
(B) 類型核苷酸
(C) 鏈性單鏈
(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii) 分子類型核苷酸
(iii)序列描述SEQIDNO. 6序列表
<110>南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120>油菜雄性不育細(xì)胞質(zhì)NAU10A的育種方法
<130>瞧0A
<140> 2009-7-6
<141> 2009-07-06
<150> 2009-7-5
〈151〉 2009-07-05
<160> 6
<170〉 Patentln version 3. 5
〈210〉 1
<211> 669
<212> DNA
〈213> Brassica n即us
<400> 1
atgcctcaac tttactttct ctaaaactac cttggtgg犯 ctcatgttcg ttgctsgg犯 gatggcgtcg gcggacgttg agccgagtgc gccctcgtcg
tttcgatga 〈210〉 2 〈211〉 222 〈212〉 PRT <213> Brassica <400> 2
Met Pro
tggataaatt cacttatttt tcacaattct ettattttcat atgcaatgat gg,tggag gg犯ccaact gctttcacac tggggtaaga aagatcgtac aagtaagttc ggggtcttag tggtcccataa aatgcggcta gctatattta atgagaatct aatatatggt ttg肌tttat cgcccccagc tctagatctc aacgagcgcc 卿gttccga ctctcaacaa gcgcggaatg aagagat肌c ccgtcaccta gagggtgagc atatcatgaa gtggg鄉(xiāng)tc aggagcttgg sccgtctgcg ,ttcg犯g卿gcc犯gg
rmpus
1
Cys
Gin Leu Asp 5
Phe
Lys Phe Thr* Tyr
Phe 10 Phe
Ser
Leu Phe Phe Phe Thr Phe Tyr lie 20 25 Gly lie Ser Arg lie Leu 40
Gin Ser Lys Leu
Gly Val Leu 35
Trp Gly Lys Thr
His 50
Arg Thr Ser Lys
Asp 65
Leu Met Phe Val
lie Lys Trp Gly 100
lie 55
Gly Val Leu Ala
Phe 70
Pro Lys Met Arg
Val 85
Leu Leu Gly
Asn Glu 105
Leu
90
Asn
Phe
75
Ala
Leu
tctggttatg tscttgggst ccatccagag cgttcgccac tttttgggat ttcagttcgg cgccactgca ctgatatgct atgatatcgc atcaccactt
tg犯Cg犯3t
ccttttcttc cagc3gaatt caagctaaag gcgctatttc ta組ggggg cgtcggacca tcttttgtac agcgcatatt gcggcgtcaa ccgggtcttt
Ser
Gin Cys
Lys Leu Arg
lie
Lys
60
Ala
lie
lie
Phe
Asn
Asn
45
Leu
Thr
Phe
Tyr
Phe
Asp
30
Gin
Gly
Arg
lie
Gly 110
Trp
15
Gly
Leu
Gly
Tyr
Phe
95
Leu
Leu
Asp
Leu
Lys
Phe
80
Gly
Asn
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 669Pro Pro Ala Leu 125
Ala Asp Val Glu
Leu Ala His lie 160
Glu His Asp lie 175
Glu Val Arg Ser 190
Arg Leu Arg Asp 205
Phe Arg
Leu Phe Gin Phe Gly Val Gly Pro Asp Gly Val Ala
115 120 Asp Leu Asn Glu Arg Pro Pro Leu His Leu Leu Tyr 130 135 140
Ser Ser Asp Ser Gin Gin Ala Arg Asn Ala Asp Met 145 150 155
Ser Arg Val Gin Glu lie Thr Arg His Leu Glu Gly
165 170 Ala Arg Arg Gin Ala Leu Val Asp lie Met Lys Trp
180 185 Leu Asp His His Phe Arg Val Phe Arg Tyr Leu Asp
195 200 Ser Lys Arg Ala Lys Val Asn Glu lie Leu Asp Leu 210 215 220
〈210> 3 <211> 20 <212> DNA
<213> Brassica ,us <400> 3
tcatcgaaat agatcgagta 20 〈210> 4 〈211> 22 <212>腿
〈213> Brassica napus 〈400> 4
ttettgagcta gataaagcta ct 22 〈210〉 5 <211> 19 <212> DNA
<213> Brassica napus 〈400> 5
cgccgagcgg gaaatcgtc 19 <210> 6 <211> 19 〈212〉 DNA
<213〉 Brassica napus <400> 6
ggaaagtgct gagggatgc 19
10
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞質(zhì)雄性不育胞質(zhì)NAU10A利用原生質(zhì)體融合技術(shù)，通過雜交和回交育種方法，得到甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系，分別命名為NAU10A和NAU10B
2. 權(quán)力要求1所述的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的線粒體DNA具有通過原生質(zhì)體融合得到 的重組DNA序列(9i F22Z^0，其核苷酸序列SEQ ID No. 1為AGGAGCT丁GC:AT(》 GAAGAGAGC〔:AAGGTGAACGAAATACTCGATCTATTTCGATGA
3.權(quán)利要求2所述的一種重組型W Fn/0基因的編碼蛋白序列SEQ ID No. 2為:KLKLGGKDRTSKFGVLAFATRYFLMr'VVPKMRLAIFIFGIKWGLLGNENLIYGLNL
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甘藍(lán)型油菜雄性不育細(xì)胞質(zhì)NAU10A的創(chuàng)建方法和特征，屬于遺傳工程領(lǐng)域和植物育種領(lǐng)域。利用甘藍(lán)型油菜原生質(zhì)體技術(shù)，獲得了融合后代，從融合后代中發(fā)現(xiàn)了不育株；利用NAU10B保持系與該不育株雜交和回交，得到了穩(wěn)定不育系NAU10A。提取NAU10A不育系的線粒體DNA，并且利用PCR技術(shù)克隆鑒定不育胞質(zhì)，得到NAU10A不育系的線粒體DNA的一個(gè)特征序列SEQ ID NO.1和其編碼氨基酸序列SEQ ID NO.2。本發(fā)明的細(xì)胞質(zhì)和特征基因序列為首次報(bào)導(dǎo)。NAU10A細(xì)胞質(zhì)可廣泛應(yīng)用十字花科植物的雜種優(yōu)勢利用，具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A01H5/00GK101647405SQ20091003182
公開日2010年2月17日 申請(qǐng)日期2009年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月14日
發(fā)明者姜淑慧, 張麗君, 張鳳啟, 張紅生, 杜同慶, 田琳琳, 管榮展, 秀 鄭, 陳健美 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)