專利名稱：：一種甘藍(lán)型油菜雙重不育系的選育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于農(nóng)作物雜種優(yōu)勢利用方法領(lǐng)域，涉及油菜雄性不育系的選育方法，特別是一種甘藍(lán)型油菜"環(huán)境敏感細(xì)胞核+Nap細(xì)胞質(zhì)"雙重雄性不育系的選育方法。
背景技術(shù)：
：細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS，包括雄性不育三型說的"質(zhì)一核互作型"雄性不育)是甘藍(lán)型油菜雜種優(yōu)勢利用的主要方式。世界上發(fā)現(xiàn)較早、得到廣泛研究的有Ogura、Polima、Nap三大CMS系統(tǒng)。OguraCMS在歐洲、北美應(yīng)用很多，但其恢復(fù)系以及恢復(fù)基因受到專利保護(hù)。在中國廣為應(yīng)用的是Polima、陜2ACMS等，其遺傳方式、恢保關(guān)系、育性表現(xiàn)等都具有Polima型CMS特征(楊光圣等，甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育的遺傳分類研究.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)1998(1):27-34)，育性不穩(wěn)定，大多數(shù)保持系選育的不育系對低溫敏感，前期花粉量大。為此，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)和西南農(nóng)業(yè)大學(xué)提出了"細(xì)胞核不育十PolimaCMS"雙重不育系思路(楊光圣等.作物學(xué)報，1997,23(2):144-149;李加納，油菜細(xì)胞核+細(xì)胞質(zhì)雙重不育系選育初報.西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1994，16(4):403-405)，但只能解決群體中50%的微粉株，沒有徹底解決微粉問題。NapCMS又稱Shiga—Thompson系統(tǒng)，加拿大、歐洲、日本、中國的很多甘藍(lán)型油菜品種都具有Nap細(xì)胞質(zhì)，例如Karat，Regent,ACElect,Amazon,Arctik，Cyclone,Defender,Ebony,Falcon,Korell，Pearl,Topas等，所以絕大多數(shù)正常品種可以恢復(fù)NapCMS的育性，目前僅發(fā)現(xiàn)波蘭品種Bronowski、日本品禾中Isuzunatane、Muraskinatane、法國品禾中Brio、捷克品禾中Ceska、中國品種湘矮B等極少數(shù)品種可以保持NapCMS(ShigaT，BabaB.Cytoplasmicmalesterilityinrapeplan《5mss/ca加;wsL.).JapaneseJournalofBreeding.1971.Suppl，2:16-17;ThompsonKF.Cytoplasmicmalesterilityinoilseedrape.Heredity.1972，29:253-257;傅廷棟，楊光圣.油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系雜種.見雜交油菜的育種和利用(傅廷棟主編)，湖北科學(xué)技術(shù)出版社，1995，46-51)。NapCMS恢復(fù)基因和PolimaCMS恢復(fù)基因被定位在同一座位上(LiX-Q，JeanM，LandryB.S"BrownG.GRestorergenesfordifferentformsofBrassicacytoplasmicmalesterilitymaptoasinglenuclearlocusthatmodifiestranscriptsofseveralmitochondrialgenes.ProcNatlAcadSciUSA，1998,95:10032~10037)。NapCMS的優(yōu)點是對Fi代雜交種沒有明顯的細(xì)胞質(zhì)副效應(yīng)，恢復(fù)系廣泛，不育系在涼爽環(huán)境下比較穩(wěn)定，但最大缺點是對高溫環(huán)境敏感，平均氣溫高于20攝氏度，會有花粉產(chǎn)生(FanZ，StefanssonBR.InfluenceoftemperatureonsterilityoftwoCMSsystemsinrape.CanJPlantSci1986,66:221-227)，而世界上各個冬油菜和春油菜產(chǎn)區(qū)，在油菜開花期都會或長或短出現(xiàn)這樣的天氣，因此該不育系生產(chǎn)雜交種的風(fēng)險很大，種子純度難以保障，很難投入商業(yè)應(yīng)用。目前在甘藍(lán)型油菜中發(fā)現(xiàn)了溫敏核不育或光溫敏核不育，都表現(xiàn)為在低溫及(或)短日照條件下雄性可育，在高溫及(或)長日照條件下雄性不育，已經(jīng)公開報道的分別是①湖南省農(nóng)科院育成的湘91S(甘藍(lán)型油菜溫敏核不育系湘91S的選育，作物研究，1995年S1期；)、②貴州油料科學(xué)研究所育成的H90S(中國油料作物學(xué)報.2001(4):11-15)、③劉尊文等報道的N196S(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報.2006,28(5):654-656)、④于澄宇等報道的373S(中國農(nóng)學(xué)通報.2007，(7):255-258)。溫敏核不育、光敏核不育、光溫敏核不育等都屬于環(huán)境敏感細(xì)胞核雄性不育(VirmaniSSandIlyasAhmedM.2001.Environmentsensitivegeniemalesterility(EGMS)incrops.AdvancesinAgronomy72:139-195)，但從概念上來講，環(huán)境敏感細(xì)胞核雄性不育概念更廣泛，還包括對濕度或者其他復(fù)雜環(huán)境條件敏感的不育系。環(huán)境敏感細(xì)胞核雄性不育用于兩系法雜交制種的優(yōu)勢是多為隱性基因控制，可以通過雜交回交，把不育基因轉(zhuǎn)入到任何一個目標(biāo)品種或自交系，選育新型不育系；其它品種一般都可用作恢復(fù)系，恢復(fù)源廣，容易獲得較高產(chǎn)量潛力雜交組合。其致命弱點是對氣候條件的要求更為嚴(yán)格，可供選擇的制種區(qū)不多，制種失敗的風(fēng)險更大。湖南省農(nóng)科院研究人員用溫敏不育系湘油91S保持PolimaCMS，育成了沒有微粉的PolimaCMS新不育系"湘新A"、湘油66A(鄔賢夢等，甘藍(lán)型油菜無微量花粉細(xì)胞質(zhì)雄性不育系湘油66A的選育.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，32(4):347-351)，可見結(jié)合溫敏細(xì)胞核不育和細(xì)胞質(zhì)不育實踐上是可行的。
發(fā)明內(nèi)容為了克服環(huán)境敏感細(xì)胞核不育系與NapCMS的缺點，解決雜交油菜制種難題，本發(fā)明的目的在于，提出一種新的甘藍(lán)型油菜雙重不育系的選育方法，該方法將環(huán)境敏感細(xì)胞核不育基因?qū)氲絅apCMS的保持系和不育系，選育出"環(huán)境敏感核不育+Nap細(xì)胞質(zhì)"雙重不育系(代號EGMS+NapCMS)。為了實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案一種甘藍(lán)型油菜雙重不育系的選育方法，其特征在于，按如下步驟實現(xiàn)步驟一，采用環(huán)境敏感核不育材料與NapCMS的保持系雜交，得到F,代，F(xiàn),自交得到F2，F(xiàn)2自交得到F3;步驟二，在F2或F3分離世代選擇育性隨環(huán)境變化而變化的環(huán)境敏感不育株，作為父本與NapCMS測交；步驟三，淘汰不能保持NapCMS的環(huán)境敏感不育株，保留能保持NapCMS的環(huán)境敏感不育株，繼續(xù)自交；步驟四，保留下來的環(huán)境敏感不育單株自交后代同時作為父本繼續(xù)與上一代保持下來的NapCMS測交；步驟五，重復(fù)步驟三和步驟四，經(jīng)過4個世代以上的連續(xù)自交兼測交，即可得到一種自身雄性育性對環(huán)境敏感的NapCMS保持系，其細(xì)胞核中含有環(huán)境敏感細(xì)胞核不育基因，但細(xì)胞核中不含NapCMS的恢復(fù)基因，而細(xì)胞質(zhì)為正?？捎?xì)胞質(zhì)；與此同步測交保持下來的NapCMS就是兼有環(huán)境敏感細(xì)胞核不育和Nap細(xì)胞質(zhì)不育特征的雙重不育系。上述方法選育的雙重不育系可以用于雜交油菜制種。即將雙重不育系作為母本，和可以恢復(fù)雙重不育系育性的父本間隔種植，開花后由父本給母本授粉，收獲母本上所結(jié)的種子，即為雜交種。本發(fā)明的方法將環(huán)境敏感核不育與細(xì)胞質(zhì)不育結(jié)合，取得了良好的技術(shù)效果，選育出的雙重不育系達(dá)到100%完全不育，花瓣平展，雄蕊白色無花粉，花期育性穩(wěn)定。大部分正常品種可以恢復(fù)其育性，大大擴(kuò)展了油菜雜種優(yōu)勢可利用的范圍，減少了制種風(fēng)險，能夠提高雜交種制種純度，并為提高雜交種產(chǎn)量提供了技術(shù)保障。圖1是雙重不育系選育過程示意圖；以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。具體實施例方式由于環(huán)境敏感細(xì)胞核雄性不育的表達(dá)不依賴于細(xì)胞質(zhì)，可以把不育基因?qū)肴魏纹废狄约癈MS，作為選育"環(huán)境敏感細(xì)胞核+Nap細(xì)胞質(zhì)"雙重不育系的良好供體。本發(fā)明所述環(huán)境敏感核不育是指由隱性細(xì)胞核不育基因控制的雄性不育材料，其雄蕊的育性可隨氣溫、光周期或其它環(huán)境因素變化而變化。目前國內(nèi)發(fā)現(xiàn)的幾種光溫敏、溫敏細(xì)胞核不育系均屬于這一范圍，均可以用作選育雙重不育系的基因供體。本發(fā)明的甘藍(lán)型油菜新型雙重不育系的選育方法，經(jīng)過如下步驟選育200810231885.0說明書第5/9頁用環(huán)境敏感核不育材料作為父本與NapCMS的保持系(例如Bronowski、Isuzunatane等)雜交，F(xiàn)!自交得到F2，F(xiàn)2自交得到F3;在F2或F3分離世代選擇不同的環(huán)境敏感不育株，作為父本與NapCMS測交，此時初步將環(huán)境敏感核不育基因?qū)隢apCMS，但核不育基因不純合，尚不能表現(xiàn)效應(yīng)；淘汰不能保持NapCMS的環(huán)境敏感不育株，保留能保持NapCMS、而且農(nóng)藝性狀、品質(zhì)優(yōu)良的環(huán)境敏感不育株，繼續(xù)自交純化，同時每代作為父本繼續(xù)與上一代保持下來的NapCMS單株測交，這一過程類似回交步驟，在逐步置換NapCMS細(xì)胞核的同時，反復(fù)將環(huán)境敏感核不育基因?qū)隢apCMS，核不育基因純合，可以表現(xiàn)出雙重不育系統(tǒng)的效應(yīng)；經(jīng)過4個世代以上自交兼測交，就能得到一種NapCMS的特殊保持系，其細(xì)胞核中含有環(huán)境敏感細(xì)胞核不育基因但不含有NapCMS的恢復(fù)基因，而細(xì)胞質(zhì)為正?？捎?xì)胞質(zhì)；以這種特殊保持系作為父本反復(fù)測交保持下來的就是與父本細(xì)胞核基因相似，兼有不育細(xì)胞質(zhì)的EGMS+NapCMS雙重不育系。以后用雙重不育系和其保持系雜交即可繁殖不育系。環(huán)境敏感不育株的鑒定繁殖方法是在低溫短光濕潤環(huán)境下(例如日均溫<13攝氏度，日長〈12h，濕度>50。/0使其自交繁殖；而在高溫長光干燥環(huán)境下(例如日均溫〉15攝氏度，日長〉12.5h，濕度<50%)使其達(dá)到高度不育。由于雙重不育系育性很穩(wěn)定，遠(yuǎn)大于兩種不育系統(tǒng)獨立表達(dá)的效果，為保證雙重不育系的保持系的自交結(jié)實能力強一些，在后一種環(huán)境下，對環(huán)境敏感核不育的選擇標(biāo)準(zhǔn)可以降低，不需要完全不育，只要能達(dá)到高度不育(不育度〉90%)即可。EGMS+NapCMS在雜交油菜制種中的使用方法與一般CMS三系制種體系相似EGMS+NapCMS作為母本，和可以恢復(fù)雙重不育系育性的父本間隔種植，開花后由父本給母本授粉，收獲母本上所結(jié)的種子，即為雜交種。親本繁殖方法也與一般CMS相似，雙重不育系和其相應(yīng)保持系雜交即可繁殖不育系，區(qū)別是保持系的自交繁殖需要在低溫短光濕潤環(huán)境下，這種條件可以在冬油菜區(qū)實現(xiàn)，也可以在人工控制環(huán)境下實現(xiàn)。環(huán)境敏感核不育、NapCMS是分別對低溫和高溫敏感的不育系統(tǒng)，單獨應(yīng)用于商業(yè)生產(chǎn)風(fēng)險很大，而申請人提出的方法將環(huán)境敏感核不育與細(xì)胞質(zhì)不育結(jié)合，取得了良好效果雙重不育系花瓣平展，花絲很短，雄蕊低于花瓣水平面，花藥白色，整個花期穩(wěn)定無微粉。由于環(huán)境敏感細(xì)胞核不育基因和NapCMS基因的表達(dá)機理不同，從概率論的觀點來說是獨立事件，而又同在花藥中表達(dá)，存在目標(biāo)的交叉性，環(huán)境敏感細(xì)胞核不育對低溫敏感而NapCMS對高溫敏感，二者相互制約，因此使得育性受環(huán)境影響而恢復(fù)的可能性大幅度降低。除過穩(wěn)定性外，應(yīng)用這種雙重不育系還具有如下積極效果(1)采用Nap不育細(xì)胞質(zhì)，避免了單一應(yīng)用Ogura或Polima不育細(xì)胞質(zhì)的潛在危險；(2)絕大多數(shù)普通品種可以同時恢復(fù)環(huán)境敏感核不育和NapCMS，因此可直接作為雙重不育系的恢復(fù)系，大大擴(kuò)展了可利用的雜種優(yōu)勢范圍；(3)對雜交種制種區(qū)域生態(tài)環(huán)境的要求寬松，不像溫敏不育系等在只能在中國北方或春油菜區(qū)制種。雙重不育系在雜交油菜制種中的使用方法以雙重不育系作為母本，和可以恢復(fù)雙重不育系育性的父本間隔種植，開花后由父本給母本授粉，收獲母本上所結(jié)的種子，即為雜交種。以下是發(fā)明人給出的實施例，本發(fā)明不限于這些實施例。在選育過程中，NapCMS的保持系包括但不限于下列品種波蘭品種Bronowski、日本品種Isuzunatane、Muraskinatane、法國品種Brio、捷克品種Ceska、中國品種湘矮B。實施例1:由Bronowski連續(xù)回交加拿大品種ACElect得到不育系，代號BronowskiNapCMS,表現(xiàn)為前期穩(wěn)定不育，后期恢復(fù)為半不育。利用選育的一個環(huán)境敏感不育系373S(中國農(nóng)學(xué)通報，2007，(7》255-258，該不育系已經(jīng)在青海省農(nóng)林科學(xué)院、揚州農(nóng)科所、山西農(nóng)科院等單位種植鑒定，并贈送相關(guān)單位開展育種應(yīng)用研究)與品種中雙9號雜交、Fi代再和中雙9號回交，用BCF2代分離出的環(huán)境敏感不育株連續(xù)自交，得到環(huán)境敏感不育系Z9—EGMS，該環(huán)境敏感不育系Z9—EGMS的性狀為低硫甙、低芥酸、抗倒伏，將環(huán)境敏感不育系Z9—EGMS在陜西楊凌等地秋播，花期育性表現(xiàn)與373S相同，初花期低溫短日照條件下可育或半不育，隨著4月份氣溫升高、日照加強，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆挥?。用Z9—EGMS作父本與NapCMS的保持系Bronowski(硫甙<30nmol/g)雜交，在F2代135株分離出9株環(huán)境敏感不育株，育性變化過程與Z9—EGMS相同。經(jīng)品質(zhì)分析，其中的3株環(huán)境敏感不育株性狀為低芥酸(脂肪酸中芥酸含量<1%)、低硫甙(餅粕硫甙〈30nmol/g)，用這3株環(huán)境敏感不育株性測交BronowskiNapCMS，篩選出1個株系BZ9—3可以保持CMS，然后把環(huán)境敏感不育株連續(xù)自交，同時每代測交上代保持下來的CMS，達(dá)到與連續(xù)回交相似的效果，快速置換BronowskiNapCMS的細(xì)胞核。其實經(jīng)過第二代測交后，向NapCMS中導(dǎo)入的環(huán)境敏感不育基因已經(jīng)純合，含有雙重不育系統(tǒng)的群體育性已經(jīng)很穩(wěn)定，初步顯示了雙重不育系的良好效應(yīng)。如此經(jīng)過保持系連續(xù)自交以及同步測交保持NapCMS，最終選育成低芥酸、低硫甙、高含油量的EGMS+NapCMS雙重不育系Z9—ECMS。選育過程如圖l所示。該EGMS+NapCMS雙重不育系整個花期穩(wěn)定無微粉，經(jīng)測交大多數(shù)品種可以恢復(fù)其育性，表明該雙重不育系是一種實用型授粉控制系統(tǒng)。實施例2:采用從湖南省農(nóng)科院作物研究所選育的溫敏雄性不育兩系雜交種湘雜油5號(品種審定編號國審油2003011，2002年湖南省農(nóng)作物品種審定委員會審定，原代號9705，品種來源湘91Sx中雙4號。中國油料作物學(xué)報.2005(3):74-76)后代中分離出一個環(huán)境敏感不育系Xiang5S。用環(huán)境敏感不育系Xiang5S作父本與NapCMS的保持系Bronowski(硫甙〈30pmol/g)雜交，在F2代178株分離出2株環(huán)境敏感不育株。用這2個環(huán)境敏感不育株作父本測交BronowskiNapCMS,1個株系可以部分保持CMS。從這個環(huán)境敏感不育株自交后代選11株，測交上代保持下來的CMS，其中2個保持效果很好，接近完全不育，初步顯示了雙重不育系的良好效應(yīng)。用這兩個株系再次保持3個世代以上，就得到育性穩(wěn)定的雙重不育系。實施例3:雙重不育系與其它不育系育性比較試驗在陜西楊凌地區(qū)正常秋播雙重不育系Z9—ECMS、雙重不育保持系BZ9、環(huán)境敏感核不育系Z9—EGMS以及BronowskiNapCMS進(jìn)行實驗。次年花期各隨機選取10株，每株取不同部位IO枚新鮮花朵，擠壓花藥使花粉釋放出來，用醋酸洋紅染色，在顯微鏡下統(tǒng)計有活力的花粉(形狀橢圓、外形完整、能夠染成紅色)百分率。另選10株套袋自交，計算分別相對于正常品種中雙9號及Bronowski的自交結(jié)實率，估算整個花期的雄性育性。結(jié)果表明雙重不育系育性Z9—ECMS很穩(wěn)定，在開花各個時期均沒有可育花粉，不能自交結(jié)實，不育度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它3個材料。將恢復(fù)系YC2的花粉給每材料人工授粉50朵花，最終結(jié)實率都很好，實驗結(jié)果見表1，表明雙重不育系Z9—ECMS的雌蕊結(jié)實性能正常。表1.雙重不育系與其它不育系育性比較<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權(quán)利要求1.一種甘藍(lán)型油菜雙重不育系的選育方法，其特征在于，按如下雜交改良步驟實現(xiàn)步驟一，采用環(huán)境敏感核不育材料與NapCMS的保持系雜交，得到F1代，F(xiàn)1自交得到F2，F(xiàn)2自交得到F3；步驟二，在F2或F3分離世代選擇育性隨環(huán)境變化而變化的環(huán)境敏感不育株，作為父本與NapCMS測交；步驟三，淘汰不能保持NapCMS的環(huán)境敏感不育株，保留能保持NapCMS的環(huán)境敏感不育株，繼續(xù)自交；步驟四，保留下來的環(huán)境敏感不育單株自交后代同時作為父本繼續(xù)與上一代保持下來的NapCMS測交；步驟五，重復(fù)步驟三和步驟四，經(jīng)過4個世代以上的連續(xù)自交兼測交，得到一種自身雄性育性對環(huán)境敏感的NapCMS保持系，其細(xì)胞核中含有環(huán)境敏感細(xì)胞核不育基因，但細(xì)胞核中不含NapCMS的恢復(fù)基因，而細(xì)胞質(zhì)為正常可育細(xì)胞質(zhì)；與此同步測交保持下來的NapCMS就是兼有環(huán)境敏感細(xì)胞核不育和Nap細(xì)胞質(zhì)不育特征的雙重不育系。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述的NapCMS的保持系包括波蘭品種Bronowski、曰本品種Isuzunatane、Muraskinatane、法國品禾中Brio、捷克品種Ceska或中國品種湘矮B。3.權(quán)利要求1所述的甘藍(lán)型油菜雙重不育系的選育方法在雜交油菜制種中的應(yīng)用。4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，將權(quán)利要求l選育的雙重不育系作為母本，和可以恢復(fù)雙重不育系育性的父本間隔種植，開花后由父本給母本授粉，收獲母本上所結(jié)的種子，即為雜交種。全文摘要本發(fā)明公開了一種新型甘藍(lán)型油菜雙重不育系的選育方法，該方法采用環(huán)境敏感核不育材料與NapCMS的保持系雜交，后代選擇環(huán)境敏感核不育株測交保持NapCMS，把環(huán)境敏感核不育基因?qū)氲絅apCMS，選育出的雙重不育系達(dá)到100％完全不育，花瓣平展，雄蕊白色無花粉，花期育性穩(wěn)定。大部分正常品種可以恢復(fù)其育性，大大擴(kuò)展了油菜雜種優(yōu)勢可利用的范圍，減少了制種風(fēng)險；能夠提高雜交種制種純度，并為提高雜交種產(chǎn)量提供了技術(shù)保障。文檔編號A01H1/04GK101390493SQ20081023188公開日2009年3月25日申請日期2008年10月24日優(yōu)先權(quán)日2008年10月24日發(fā)明者于澄宇,胡勝武申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)