專利名稱：一種用于培育轉基因禽的種蛋孵化方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于培育轉基因禽的種蛋孵化方法。
背景技術：
利用基因工程技術可以將禽類中不利的基因剔除，以提高禽類的抗病抗逆性、提高禽類生產性能和改善肉質。繼乳腺生物反應器之后，利用轉基因技術將人或動物的抗體基因導入蛋雞體內，將其改造成輸卵管生物反應器，可以使其所產的蛋中含有大量具有經(jīng)濟價值的蛋白質，再用其生產藥品和保健品。因此，轉基因禽類具有巨大的經(jīng)濟價值和應用前景。 近年來已有不少轉基因雞的研究報告出爐，但是真正可以投入生產的卻幾乎沒有，主要原因之一是轉基因禽類的成功孵化比較難實現(xiàn)。 禽類為卵生孵化，其受精卵在體內受精后不久就被蛋清和蛋殼包裹并開始發(fā)育，到種蛋產出體外時就已經(jīng)是有5-6萬個細胞的囊胚了，排出的種蛋會在合適的溫度濕度等條件下再繼續(xù)進行發(fā)育，所以禽類的轉基因不像哺乳類動物那樣可以在受精卵單細胞層面上進行顯微操作，而大多是對剛產出的種蛋進行囊胚水平上的轉基因操作，再使轉基因后的種蛋繼續(xù)孵化培養(yǎng)直至出雛。隨之，雞胚的體外培養(yǎng)體系也建立起來。起初人們將雞胚放在陶瓷缸、塑料膜中培養(yǎng)，雞胚最久可以發(fā)育到14天，但是沒有活的雞胚出雛；后來發(fā)展出代用蛋殼孵化體系，其在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中成功獲得了出雛的小雞，但是孵化率較低，主要是因為復雜的體外培養(yǎng)孵化體系并不能很好的滿足雞胚在原蛋殼內的發(fā)育要求，再加上其復雜的程序和苛刻的條件，使其推廣應用受到限制。 如果要提高轉基因雞的孵化率，最好的方法就是在種蛋原殼中孵化轉基因雞胚。近年來發(fā)展出"開窗法"轉基因操作種蛋轉基因過程，其方法如下在種蛋原殼的赤道面上開直徑0. 5-1. 0cm的圓窗，透過其對雞胚X期胚盤進行轉基因操作，術后將開口用各種材料(例如膠類、塑料膜、石蠟膜等物質)封閉，使轉基因后的雞胚在種蛋原殼內繼續(xù)進行孵化。這種稱為"開窗法"的操作方法可以成功的獲得轉基因雛雞并且孵化率比以往的雞胚體外培養(yǎng)方法要高。但是與實際需求相比，這種方法的孵化率仍然很低，主要是因為孵化過程中封口后的種蛋普遍出現(xiàn)蛋清外溢的現(xiàn)象，最多可以在一批蛋中100%的出現(xiàn)不同程度的蛋清外溢現(xiàn)象，蛋清的外溢破壞了蛋內水分和營養(yǎng)的平衡，影響了雞胚的正常發(fā)育，并且外溢的蛋清極易滋生細菌，引發(fā)細菌的污染，造成雞胚的死亡。有關研究認為蛋清外溢是由于開窗導致蛋內氣壓的失衡引起的，所以，又采取封窗前往蛋內添加稀蛋清或是磷酸鹽緩沖液的辦法來解決，也有采取去掉種蛋鈍端部分蛋殼的方法來解決，雖然這樣的措施部分降低了蛋清外溢的程度，但是這些方法均操作繁瑣，并且也沒有在根本上杜絕蛋清外溢的發(fā)生。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種孵化種蛋的方法，該方法特別適合應用于轉基因禽的培育。
本發(fā)明所提供的孵化種蛋的方法，是將蛋殼的赤道上有被封閉的開孔的種蛋，按照使被封閉的開孔朝上并處于所述種蛋的最高處的方式放置，進行靜置孵化；至所述種蛋內的絨毛膜發(fā)育到包裹種蛋內的全部內容物時，再將所述種蛋大頭朝上小頭朝下放置，進行翻蛋孵化；然后再進行靜置孵化直至出雛。 其中，所述種蛋內的絨毛膜包裹種蛋內的全部內容物時，是指從開始孵化時計起，孵化至第4-5天，優(yōu)選為第5天。 所述翻蛋孵化共持續(xù)12-15天，優(yōu)選為14天。 所述靜置孵化和翻蛋孵化的溫度為37-38. 5t:，優(yōu)選為38t:;所述靜置孵化和翻蛋孵化的相對濕度為50% _75%，優(yōu)選為75%。 本發(fā)明方法適合于一般禽類種蛋的孵化，如鵪鶉、家鴨和雞等，而且種蛋的品種不限。 所述種蛋為采取開窗法操作的轉基因種蛋。 所述蛋殼的赤道上有被封閉的開孔的種蛋可從商業(yè)途徑獲得，也可按照常規(guī)方法(如"開窗法")制備。 本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，開窗法轉基因種蛋在孵化過程中出現(xiàn)蛋清外溢的根本原因是蛋清與有機封口物質直接接觸造成的。用于封閉開窗的封口膜基本采用的是有機物質，其表面含有許多微小的孔隙，而蛋清是堿性的優(yōu)良有機溶劑，其中還含有各種各樣的酶類物質，在孵化的過程中如果使蛋清與封口膜直接接觸，在溫暖高濕的孵化環(huán)境中，蛋清會漸漸的將封口膜物質溶解，加上孵化時翻蛋造成蛋清流動的反復沖刷，封口膜就會逐漸被溶蝕，其表面的微小孔隙擴大，最終導致蛋清的外溢。 本發(fā)明的發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，開窗法轉基因操作中，種蛋赤道上開窗之后，蛋殼內會出現(xiàn)一個微小的空腔(稱人工氣室)。 本發(fā)明的發(fā)明人基于以上發(fā)現(xiàn)，并結合如下禽類胚胎的發(fā)育過程，創(chuàng)造性地提供了一種從根本上克服了蛋清外溢現(xiàn)象的種蛋孵化方法 種蛋孵化過程中，從開始孵化時計起，孵化33小時后，雞胚胎膜開始發(fā)育，胎膜首
先開始包裹胚胎，后逐漸擴大；到孵化第4天時，胎膜基本合攏，內層為羊膜，外層為絨毛
膜，此時，羊膜已包裹胚胎，絨毛膜貼著蛋殼且已包裹種蛋內的全部內容物；到孵化第5天
時，絨毛膜和尿囊融合形成尿囊絨毛膜，此時尿囊絨毛膜完全合攏并包裹種蛋內的全部內
容物；以后胚胎通過尿囊絨毛膜及卵囊膜吸收營養(yǎng)和呼吸，最后孵化至出雛。 本發(fā)明方法摒棄了原有的治標不治本的封蛋措施，利用種蛋自身的結構特點和雞
胚發(fā)育過程中胎膜的發(fā)育特點，創(chuàng)造性地通過在孵化期間對轉基因種蛋孵化時蛋位的調
整，簡單有效地避免了蛋清與封口物質的直接接觸。首先，在孵化的前期，即孵化第5天以
前，通過種蛋的擺放，即使蛋殼上的開窗處于種蛋的最高處，利用上述人工氣室將蛋清與封口膜隔絕，使其相互不能直接接觸；在絨毛膜發(fā)育到包裹整個種蛋內容物以后，即孵化第5天后，絨毛膜及后續(xù)形成的尿囊絨毛膜使蛋清與封口物質隔絕，使其不能直接接觸后，再將種蛋大頭朝上豎直放置并恢復翻蛋孵化。因此，在整個種蛋的孵化過程中，都徹底隔絕了蛋清與封口膜的直接接觸，因而從根本上杜絕了蛋清外溢的可能性。另外，本發(fā)明方法還無需在封閉開孔前，向蛋內添加蛋清等補充液體，使操作更簡便。 本發(fā)明方法從根本上克服了傳統(tǒng)方法中蛋清外溢的缺陷，保證了孵化過程中蛋內的水分和營養(yǎng)平衡，減少了由于蛋清外溢而造成雞胚死亡的損失，保證了轉基因雞胚的正常發(fā)育，直接提高了轉基因雞胚的孵化率。本發(fā)明方法步驟簡單，可操作性強，并適合于其它開窗法轉基因操作后的禽類種蛋的孵化，如鵪鶉，家鴨等。因此，本發(fā)明方法具有重要的應用價值，適合于推廣。


圖1為種蛋孵化中蛋清外溢現(xiàn)象和蛋清無外溢現(xiàn)象的圖。
圖2為本發(fā)明方法孵化出的雛雞的圖。
具體實施例方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
實施例1、開窗法轉基因后的雞種蛋的孵化 本實施例中所用的蛋殼的赤道上有被封閉的開孔的種蛋是通過開窗法進行轉基因操作后的雞種蛋，用于封閉開孔的有機物是石蠟膜(Paraffilm)，而且，在封閉開孔前，種蛋內不添加稀蛋清或磷酸鹽緩沖液等。
本發(fā)明方法的實驗步驟如下 1、將上述種蛋水平靜置于孵化蛋托上，使蛋殼上的窗口朝上并處于種蛋的水平最高處；用噴霧器向種蛋表面噴灑青霉素和鏈霉素混合溶液(青霉素的濃度為100mg/ml，鏈霉素的濃度為100mg/ml) ， 5ml混合溶液/100個種蛋；然后將種蛋靜置入孵，孵化時不翻蛋，期間蛋殼上的窗口一直朝上并處于種蛋的水平最高處，溫度38度，相對濕度75%。
2、孵化至種蛋內的絨毛膜已包裹種蛋內的全部內容物(即從開始孵化計起，在孵化的第5天)時，將平置的種蛋改成大頭朝上，小頭朝下豎直放置，并恢復翻蛋，蛋的擺動幅度為45度，翻蛋頻率為每2小時翻蛋一次，在溫度38度、75%相對濕度的條件下孵化；翻蛋孵化一共進行14天； 3、孵化至第19天，停止翻蛋，將種蛋由孵化蛋托上取下置于蛋盤中，繼續(xù)在溫度38度、75%相對濕度的條件下孵化； 4、孵化至第20-21天，轉基因種蛋會陸續(xù)出雛，將出雛的小雞轉移至育雛箱中進行后續(xù)培養(yǎng)和實驗。 同時將經(jīng)同樣開窗轉基因操作的雞種蛋用現(xiàn)有的常規(guī)方法進行孵化，以作為對照，現(xiàn)有孵化方法的實驗步驟如下 1、將種蛋大頭朝上，小頭朝下豎直放置，開啟翻蛋，蛋的擺動幅度為45度，翻蛋頻率為每2小時翻蛋一次，在溫度38度、75%相對濕度的條件下孵化。 2、孵化至第19天，停止翻蛋，將種蛋由孵化蛋托上取下置于蛋盤中，繼續(xù)在溫度38度、75%相對濕度的條件下孵化。 實驗設3次重復，用本發(fā)明方法共孵化了 120個種蛋，用現(xiàn)有方法共孵化了 180個種蛋，結果如圖l和圖2所示。表明，用本發(fā)明方法孵化的120個種蛋均無蛋清外溢現(xiàn)象(圖1A和圖1B)，雞胚可以在不喪失蛋清的條件下正常發(fā)育，最終的轉基因種蛋的孵化率為23. 5%;而用現(xiàn)有方法孵化的180個轉基因種蛋均有不同程度的蛋清外溢現(xiàn)象(圖1C為嚴重外溢，圖1D為中度外溢)，雞胚全部死亡，孵化率為0%。用本發(fā)明方法孵化成功的雛雞如圖2所示。
權利要求
一種孵化種蛋的方法，是將蛋殼的赤道上有被封閉的開孔的種蛋，按照使被封閉的開孔朝上并處于所述種蛋的最高處的方式放置，進行靜置孵化；至所述種蛋內的絨毛膜發(fā)育到包裹種蛋內的全部內容物時，再將所述種蛋大頭朝上小頭朝下放置，進行翻蛋孵化；然后再進行靜置孵化直至出雛。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述種蛋內的絨毛膜包裹種蛋內的全部 內容物時，是指從開始孵化時計起，孵化至第4-5天，優(yōu)選為第5天。
3. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述翻蛋孵化共持續(xù)12-15天，優(yōu)選 為14天。
4. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述靜置孵化和翻蛋孵化的溫度為 37-38. 5t:，優(yōu)選為38t:;所述靜置孵化和翻蛋孵化的相對濕度為50% _75%，優(yōu)選為75%。
5. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述種蛋為禽的種蛋。
6. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述禽為雞。
7. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述種蛋為采取開窗法操作的轉基 因種蛋。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于培育轉基因禽的種蛋孵化方法。該方法是將蛋殼的赤道上有被封閉的開孔的種蛋，按照使被封閉的開孔朝上并處于所述種蛋的最高處的方式放置，進行靜置孵化；至所述種蛋內的絨毛膜發(fā)育到包裹種蛋內的全部內容物時，再將所述種蛋大頭朝上小頭朝下放置，進行翻蛋孵化；然后再進行靜置孵化直至出雛。本發(fā)明方法從根本上克服了傳統(tǒng)方法中蛋清外溢的缺陷，保證了孵化過程中蛋內的水分和營養(yǎng)平衡，減少了由于蛋清外溢而造成雞胚死亡的損失，保證了轉基因雞胚的正常發(fā)育，提高了轉基因雞胚的孵化率。本發(fā)明方法步驟簡單，可操作性強，并且適合于其它開窗法轉基因操作后的禽類種蛋的孵化，如鵪鶉，家鴨等。因此，本發(fā)明方法具有重要的應用價值，適合于推廣。
文檔編號A01K67/00GK101720716SQ20081022533
公開日2010年6月9日 申請日期2008年10月30日 優(yōu)先權日2008年10月30日
發(fā)明者孫研研, 楊寧, 蔣斌, 鄭江霞 申請人:中國農業(yè)大學