專利名稱：：生物農(nóng)藥梧寧霉素在防治水稻稻瘟病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一禾中由不吸水鏈霉菌梧州亞禾中(5Yr印Z:a^cesa力j^rosco/)ic"ss"Z^/x/r股/ro"e/7"s/7.."力印)產(chǎn)生的生物農(nóng)藥——梧寧霉素在防治水稻稻瘟病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：我國是農(nóng)業(yè)大國，常年種植糧食作物l億公頃以上，棉花480萬公頃以上，油料作物1400萬公頃以上，蔬菜瓜果1800萬公頃以上，常年需要防治面積超過3億公頃。為了防治病蟲害，保證農(nóng)業(yè)的正常生產(chǎn)，長期以來，人們大量使用化學(xué)農(nóng)藥防治病蟲害?；瘜W(xué)農(nóng)藥的使用對(duì)保證農(nóng)作物正常生產(chǎn)起到有效作用，但隨著長期以來和大量使用化學(xué)農(nóng)藥，對(duì)生態(tài)環(huán)境已造成嚴(yán)重破壞，如土壤結(jié)構(gòu)破壞、土壤中酶活性降低、土質(zhì)和水體嚴(yán)重污染等等，破壞了整個(gè)生態(tài)環(huán)境，糧食、蔬菜、水果等幾乎所有食品中有毒農(nóng)藥殘留量嚴(yán)重超標(biāo)，食用殘留化學(xué)農(nóng)藥嚴(yán)重超標(biāo)的瓜果蔬菜造成人畜中毒的事件也時(shí)有發(fā)生。針對(duì)中國入世，發(fā)達(dá)國家紛紛調(diào)整提高了產(chǎn)品進(jìn)口的技術(shù)fj檻，農(nóng)產(chǎn)品受到的影響首當(dāng)其沖。我國僅農(nóng)副產(chǎn)品因農(nóng)藥殘留超標(biāo)而遭國外"綠色壁壘"封殺的損失每年就高達(dá)70億美元。發(fā)展無公害的生物農(nóng)藥是解決現(xiàn)有農(nóng)藥及農(nóng)產(chǎn)品出口問題的主要途徑。生物農(nóng)藥屬于環(huán)境友好型產(chǎn)品，使用生物農(nóng)藥，不僅可以減少化學(xué)農(nóng)藥和化肥的使用，有效地實(shí)現(xiàn)農(nóng)產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)安全生產(chǎn)，提升農(nóng)產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)附加值,而且可為我國農(nóng)產(chǎn)品出口創(chuàng)造有利條件，極大地增強(qiáng)我國農(nóng)產(chǎn)品的國際競爭力。對(duì)我國推進(jìn)綠色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展及發(fā)展農(nóng)村經(jīng)濟(jì)、增加農(nóng)民收入、促進(jìn)農(nóng)村繁榮具有重要的推進(jìn)作用。水稻是我國主要的糧食作物，目前種植面積超過2800萬公頃，年產(chǎn)量達(dá)1.7億噸以上。每年由于病蟲害的發(fā)生，都會(huì)造成大面積的減產(chǎn)，成為阻礙水稻高產(chǎn)的重要因素。水稻稻瘟病是水稻的主要病害，蔓延快，為害嚴(yán)重，防治不好會(huì)減產(chǎn)50%以上?，F(xiàn)在防治稻瘟病的主要藥劑有三環(huán)唑可濕性粉劑、施稻靈、稻瘟靈乳油、滅病威膠懸劑等，但均存藥劑殘留、環(huán)境污染、易產(chǎn)生抗性等問題。3梧寧霉素作為已知化合物，是由不吸水鏈霉菌梧外l亞種(5Yrepf^ycesaA儀ro義'opi6'"sot&ar股力owe"s2's幾5〃fc/7)(《微生物學(xué)報(bào)》1988年，28巻(1)85-87頁)產(chǎn)生的復(fù)合型生物抗生素，含有四霉素A1、A2以及白諾氏菌素和齒香菌素，除發(fā)明單位對(duì)梧寧霉素防治蘋果腐爛病、蘋果斑點(diǎn)落葉病以及番茄灰霉病等應(yīng)用研究外，尚未見到其它單位將梧寧霉素作為生物農(nóng)藥還有其它新用途的相關(guān)報(bào)道。本發(fā)明目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供梧寧霉素的新用途，即梧寧霉素作為生物農(nóng)藥在防治水稻稻瘟病中的應(yīng)用。本發(fā)明渉及由不吸水鏈霉菌梧少H亞禾中(5Yreptawyces3力j^n9sco;w'c〃s仰667.紛^o"e"hs/.(《微生物學(xué)報(bào)》1988年，28巻(1)85-87頁)，產(chǎn)生的梧寧霉素作為生物農(nóng)藥在防治水稻稻瘟病中的應(yīng)用。梧寧霉素是一種復(fù)合型生物抗生素，含有四霉素A1、A2以及白諾氏菌素和茴香菌素。根據(jù)梧寧霉素A1的核磁共振、紅外吸收光譜、紫外吸收光譜以及質(zhì)譜確定的分子量和其他一些理化數(shù)據(jù)，推導(dǎo)出梧寧霉素A1的分子式應(yīng)為C,晶2N(X3，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為收光譜以及質(zhì)譜確定的分子量和其他一些理化數(shù)據(jù)，推導(dǎo)出梧寧霉素B化學(xué)結(jié)構(gòu)式為:
發(fā)明內(nèi)容法，通過核磁共振、紅外吸收光譜、紫外吸根據(jù)類似梧寧霉素A1分離鑒定方法，通過核磁共振、紅外吸收光譜、紫外吸收光譜以及質(zhì)譜確定的分子量和其他一些理化數(shù)據(jù)，推導(dǎo)出梧寧霉素C化學(xué)結(jié)構(gòu)式為<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>一、梧寧霉素對(duì)稻瘟病菌室內(nèi)生物活性測定試驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)采用生長速率法進(jìn)行室內(nèi)生物活性的測定，明確了梧寧霉素對(duì)水稻稻瘟病菌的抑制活性，確定梧寧霉素對(duì)水稻稻瘟病菌EC50、EC70、EC90,為該產(chǎn)品防治稻瘟病提供高技術(shù)資料和依據(jù)。1、材料與方法1.1供試材料稻瘟病菌、梧寧霉素、4%春雷霉素可濕性粉劑1.2試驗(yàn)方法1.2.1病原菌培養(yǎng)病原菌2次復(fù)壯后接種于培養(yǎng)基中，用滅菌的打孔器切取菌餅，備用。1.2.2供試藥劑的配制將梧寧霉素配置成0.15、0.30、0.60、1.20、2.40Pg/ml5個(gè)梯度，陽性對(duì)照品4%春雷霉素可濕性粉劑根據(jù)田間使用劑量配制成40.0(^g/ml的濃度。1.2.3在無菌條件下，分別將各濃度劑量的樣品及對(duì)照品，加入培養(yǎng)基中，充分混勻，等量導(dǎo)入培養(yǎng)皿中，制成相應(yīng)濃度的含藥平板。試驗(yàn)設(shè)加入等量無菌水的處理做空白對(duì)照。每個(gè)處理設(shè)6次重復(fù)。1.2.4在無菌條件下，將已經(jīng)制備好的稻瘟病菌的菌餅接種于含藥平板中央，菌絲面朝h，蓋上皿蓋，置25'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1.2.5調(diào)查方法根據(jù)空白對(duì)照培養(yǎng)皿中菌絲的生長情況調(diào)査病原菌菌絲生長情況。用卡尺測定菌落直徑，單位為毫米。每個(gè)菌落用十字交叉垂直測定直徑各一次，取其平均值。1.3數(shù)理統(tǒng)計(jì)與分析方法1.3.1計(jì)算方法根據(jù)調(diào)查結(jié)果，按照公式(1)(2)計(jì)算各處理濃度，稻瘟病菌的菌絲生長抑制率，單位為百分率，計(jì)算結(jié)果保留小數(shù)點(diǎn)后2位。D=Dl-D2....................................(1)式中D為菌落增長直徑Dl為菌落直徑6D2為菌盤直徑D0-DtI二X100..................(2)DO式中I為菌絲生長抑制率DO為空白對(duì)照菌絲增長直徑Dt為藥劑處理菌絲增長直徑1.3.2統(tǒng)計(jì)分析方法根據(jù)梧寧霉素的各濃度的對(duì)數(shù)X值，以相應(yīng)處理對(duì)菌絲抑制率的幾率值Y，用數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法求出公式要記得毒力回歸方程，求出EC50、EC70、EC90，用以評(píng)價(jià)梧寧霉素對(duì)稻瘟病病菌的抑制作用。釆用鄧肯氏法差異顯著性分析。2、結(jié)果與結(jié)論實(shí)驗(yàn)表明，梧寧霉素不同濃度處理均達(dá)到顯著水平。毒力回歸方程Y=4.0746+2.2304X，相關(guān)系數(shù)0.9836。根據(jù)方程計(jì)算出EC50=0.2600Pg/ml、EC70=0.4467lVml、EC90=0.976化g/ral，即供試藥劑稀釋5769倍時(shí)，對(duì)稻瘟病菌的抑制率可達(dá)50%;供試藥劑稀釋3358倍時(shí)，對(duì)稻瘟病菌抑制率達(dá)70%;當(dāng)供試藥劑稀釋1536倍時(shí)，對(duì)稻瘟病菌抑制率達(dá)90%。結(jié)論梧寧霉素對(duì)稻瘟病菌有較高的生物活性。當(dāng)藥劑濃度在1.2-2.4^g/ml之間時(shí)，梧寧霉素對(duì)稻瘟病菌的抑制作用優(yōu)于或接近于4%春雷霉素可濕性粉劑，但有效成分用量明顯低于陽性對(duì)照。二、梧寧霉素防治水稻稻瘟病應(yīng)用試驗(yàn)示范例1、試驗(yàn)示范l試驗(yàn)地點(diǎn)遼寧省丹東市東港市椅圈鎮(zhèn)試驗(yàn)作物及品種水稻防治對(duì)象水稻稻瘟病(P/ric〃7ahaoir幼eCa力7頁試驗(yàn)?zāi)康膶?duì)梧寧霉素進(jìn)行水稻稻瘟病的田間驗(yàn)證性試驗(yàn)，并對(duì)其安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。環(huán)境條件該地塊為插秧田，播種日期2007年4月15日，定植日期5月17日，株行距9X5cm，施復(fù)合肥50公斤，尿素45公斤。試驗(yàn)藥劑梧寧霉素對(duì)照藥劑75%三環(huán)唑可濕性粉劑用量與處理編號(hào)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>使用方法噴霧法在稻瘟病發(fā)病前夕或發(fā)病初期進(jìn)行第一次施藥，共施藥2-3次，間隔7天。試驗(yàn)周期和施藥次數(shù)第一次施藥2007年8月9日；第二次施藥2007年8月20日調(diào)查方法分別于7月21日、二次施藥后前天8月10日，調(diào)査兩次。每小區(qū)5點(diǎn)取樣，每點(diǎn)50穗，按照標(biāo)準(zhǔn)，記錄發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。分級(jí)方法0級(jí)無?。籰級(jí)每穗損失5%以下(個(gè)別枝梗發(fā)病)；3級(jí)每穗損失6-20%(1/3左右別枝梗發(fā)病)；5級(jí)每穗損失21-50%(穗頸或主軸發(fā)病，谷粒半癟)；7級(jí)每穗損失51-70%(穗頸發(fā)病，大部分谷粒癟)；9級(jí)每穗損失71-100%(穗頸發(fā)病，白穗)。8藥效計(jì)算方法￡(各級(jí)病穗數(shù)x相對(duì)級(jí)別數(shù))病情指數(shù)-X100調(diào)查總穗數(shù)X9CK0-PT1防治效果(％)=(1--)X100CK1-PTO式中CK0、CK1分別為空白對(duì)照區(qū)施藥前、后的病情指數(shù)；PT0、PT1分別為藥劑處理區(qū)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(2)、結(jié)論采用鄧肯氏新復(fù)極差法對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。經(jīng)方差分析表明試驗(yàn)藥劑最高劑量防治效果高于陽性對(duì)照樣品，且有效成分施藥量明顯低于陽性對(duì)照。試驗(yàn)藥劑防治水稻稻瘟病于水稻稻瘟病發(fā)病前或初期施藥，連續(xù)用2-3次，每畝藥液量為50升，可有效防止水稻稻瘟病，且在實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)水稻生長無不良影響，未見藥害。2、試驗(yàn)示范2試驗(yàn)地點(diǎn)黑龍江富錦市農(nóng)技中心試驗(yàn)田試驗(yàn)作物及品種水稻防治對(duì)象水稻稻瘟病(/^""http:///wao/yzaeCa。試驗(yàn)?zāi)康膶?duì)梧寧霉素進(jìn)行水稻稻瘟病的田間驗(yàn)證性試驗(yàn)，并對(duì)其安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。環(huán)境條件試驗(yàn)田為老稻田地，土壤為白漿化草甸，土肥力中等，畝施40%土配方肥25公斤，尿素10公斤。2007年4月15日育苗，5月25日插秧，插秧規(guī)格30cmx10cm-—2-3株。試驗(yàn)藥劑梧寧霉素對(duì)照藥劑25%百克乳油用量與處理編號(hào)處理編號(hào)藥劑施藥劑量施藥量(有效成分量)(1)梧寧霉素1000倍1.5mg/kg(2)梧寧霉素1250倍1.2rag/kg(3)梧寧霉素1500倍1.0mg/kg(4)陽性對(duì)照25%百克乳油2000倍225mg,/kg(5)空白——使用方法噴霧法葉面噴霧，沒處理3升藥液，重復(fù)4次。試驗(yàn)周期和施藥次數(shù)7月21葉瘟初發(fā)期和7月30R兩次施藥。調(diào)查方法分別于8月9日、8月20日、8月28日調(diào)査三次。每小區(qū)5點(diǎn)取樣，每點(diǎn)50穗，每次施肥前和最后一次施肥后7天，按照標(biāo)準(zhǔn)，記錄發(fā)病肯況，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。分級(jí)方法0級(jí)無?。籰級(jí)葉片病斑少于5個(gè)，長度小于lcm;3級(jí)葉片病斑6-10個(gè)，部分病斑長度大于lcm;5級(jí)葉片病斑11-25個(gè)，部分病斑連成片，占葉面積10-25%;7級(jí)葉片病斑26個(gè)以上，病斑連成片，占葉面積26-50%;9級(jí)葉片病斑連成片，占葉面積250%以上。藥效計(jì)算方法病穗(葉、粒率)(%)自穗(葉、粒率)數(shù)X100調(diào)杳總病穗(葉、粒率)數(shù)￡(各級(jí)病穗數(shù)x相對(duì)級(jí)別數(shù))病情指數(shù)-X100調(diào)査總德數(shù)X9CKO-PT1防治效果(％)=(1--)X100CKl—PTO式中CK0、CK1分別為空白對(duì)照區(qū)施藥前、后的病情指數(shù)；PT0、PT1分別為藥劑處理區(qū)施藥前、后的病情指數(shù)。11<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2、結(jié)論調(diào)查結(jié)果表明，對(duì)照藥劑處理對(duì)稻瘟病表現(xiàn)出明顯的防治效果，二次施藥后10天，對(duì)葉瘟病防效為82.66%。試驗(yàn)藥劑梧寧霉素隨著施藥劑量增加，對(duì)稻瘟病防效提高。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用鄧肯氏新復(fù)極差法統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果為梧寧霉素IOOO倍稀釋液防效效果高于陽性對(duì)照藥劑，且施藥量明顯低于陽性對(duì)照藥劑。施藥后觀察，梧寧霉素處理水稻生長正常，無藥害發(fā)生。從以上試驗(yàn)結(jié)果，可以得出木發(fā)明與現(xiàn)在技術(shù)相比，具有下述有益效果1、通過室內(nèi)和田間試驗(yàn)證明梧寧霉素1000倍稀釋液防治水稻稻瘟病效果優(yōu)于4%春雷霉素可濕性粉劑、75%三環(huán)唑可濕性粉劑和25%百克乳油，而且施藥量明顯低于陽性對(duì)照，這就說明使用梧寧霉素不僅可減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，提高防效，而且可以與其它生物農(nóng)藥交替使用，減緩抗性的產(chǎn)生；2、梧寧霉素對(duì)革蘭氏陰性、陽性細(xì)菌、酵母以及絲狀真菌(包括病原真菌)等有抑制作用，且對(duì)蘋果腐爛病防治效果達(dá)％%以上，對(duì)水稻稻瘟病、蘋果斑點(diǎn)落葉病以及番茄灰霉病也有良好的防治效果，且具有廣譜性；3、梧寧霉素是一株菌同時(shí)產(chǎn)生的含有4種成分的生物抗生素，屬于環(huán)境友好型農(nóng)藥，且多種抗生素協(xié)同作用，可減少其它農(nóng)藥的使用，對(duì)維護(hù)生態(tài)環(huán)境有一定意義；4、梧寧霉素經(jīng)試驗(yàn)證明是低毒的。急性毒性LD50為4000mg/kg，皮膚和粘膜刺激都無異常反應(yīng)，Ames試驗(yàn)，CHL-1細(xì)胞SCE致突變和微核試驗(yàn)均為陰性。蓄積性毒性試驗(yàn)檢査結(jié)果表明各器官均無明顯異常，蓄積系數(shù)大于5.6,以上說明梧寧霉素毒性很低，急性毒性和食鹽和小蘇打相仿；具休實(shí)施方式通過下面給出的具體實(shí)施例，可以進(jìn)一步了解本發(fā)明。但它們并不是對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。實(shí)施例l:梧寧霉素發(fā)酵液的制備(1)種子發(fā)酵培養(yǎng)基每100毫升中含有黃豆餅粉1.0g，淀粉1.0g，葡萄糖0，7g，蛋白胨O.5g，硫酸鎂0.03g，硫酸鈸1.0g，磷酸氫二鉀0.02g，.碳酸鈣0.7g，氯化鈉0.lg，植物油0.2g，PH自然；(2)深層發(fā)酵培養(yǎng)基每100毫升中含有葡萄糖2.5g，淀粉l,5g，玉米面1.0g，黃豆餅粉2，0g，蛋白胨(或玉米漿)0.5g，硫酸銨0.2g，硫酸鎂0.03g，磷酸氫二鉀0.02g，碳酸鈣0.7g，氯化鈉O.lg，植物油0.2g，滅菌后添加培養(yǎng)基體積0.4%的正丙醇，PH自然。(3)種子發(fā)酵液的制備按5-20%的接種量取不吸水鏈霉菌梧州亞種(^5Yr印tc^yc^s力國rgroscopicu5脂z/oue/7Sj's幾5u/s;)菌株，于25—35。C在禾中子發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-24小時(shí)，通風(fēng)量1:0.5-1(V/V)，轉(zhuǎn)速150-300轉(zhuǎn)/分鐘，制取種子發(fā)酵液備用；(4)梧寧霉素發(fā)酵液的制備按5-20%的接種量取上述種子發(fā)酵液于25-35'C進(jìn)行深層發(fā)酵培養(yǎng)，通風(fēng)量前期0-12小時(shí)、中期12-40小時(shí)、后期40-42小時(shí)1:0.5-1(V/V)，轉(zhuǎn)速150-300轉(zhuǎn)/分鐘，接種量5-20%，發(fā)酵周期64-72小時(shí)，得到梧寧霉素發(fā)酵液。實(shí)施例2-11:梧寧霉素防治水稻稻瘟病應(yīng)用實(shí)例13梧寧霉素防治水稻稻瘟病田間藥效試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表(遼寧省丹東市東港市椅圈鎮(zhèn))<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>權(quán)利要求1、由不吸水鏈霉菌梧州亞種(Streptomycesahygoscopicussubsp.Wuzhouensisn.subsp)產(chǎn)生的梧寧霉素作為生物農(nóng)藥在防治水稻稻瘟病中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了由不吸水鏈霉菌梧州亞種(Streptomycesahygroscopicussubsp.Wuzhouensisn.subsp)產(chǎn)生的生物農(nóng)藥梧寧霉素在水稻稻瘟病防治中的新用途。梧寧霉素是一種復(fù)合型生物抗生素，含有四霉素A1、A2以及白諾氏菌素和茴香菌素，對(duì)蘋果腐爛病防治率可達(dá)95％以上。本發(fā)明通過室內(nèi)和田間試驗(yàn)證明，梧寧霉素1000倍稀釋液防治水稻稻瘟病效果優(yōu)于4％春雷霉素可濕性粉劑、75％三環(huán)唑可濕性粉劑和25％百克乳油，而且施藥量明顯低于陽性對(duì)照。使用梧寧霉素不僅可以減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，提高防效，而且可以與其他生物農(nóng)藥交替使用，減緩抗性的產(chǎn)生；梧寧霉素對(duì)水稻稻瘟病有良好的防治效果，且無環(huán)境污染、藥劑殘留等問題，屬于環(huán)境友好型農(nóng)藥，是一種具有良好開發(fā)應(yīng)用前景的生物農(nóng)藥。文檔編號(hào)A01N43/90GK101632367SQ20081001250公開日2010年1月27日申請(qǐng)日期2008年7月24日優(yōu)先權(quán)日2008年7月24日發(fā)明者關(guān)艷麗,吳紅艷,莉李,桓明輝,池景良,浩田,郭玲玲,飛陳,韓希軍申請(qǐng)人:遼寧省微生物科學(xué)研究院